Yöntemin sıvı kromatografi prensibi. Doğal ve atık su kirleticilerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi

Tanıtım

Bölüm 1. Sıvı kromatografi yöntemlerinin temel kavramları ve sınıflandırılması

1.1 Sıvı kromatografisi için aparat

Bölüm 2. HPLC'nin özü

2.1 Uygulama

Bölüm 3. Çevresel nesnelerin analizinde HPLC kullanımına ilişkin örnekler

Bölüm 4. HPLC Ekipmanı

Edebiyat

Başvuru

Tanıtım

kromatografik yöntemler benzer bir yapıya sahip organik maddelerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için genellikle vazgeçilmezdir. Aynı zamanda, çevresel kirleticilerin rutin analizi için en yaygın olarak kullanılan gaz ve yüksek performanslı sıvı kromatografisidir. İçme ve atık sulardaki organik kirleticilerin gaz kromatografik analizi ilk olarak dolgulu kolonların kullanımına dayanıyordu, daha sonra kuvars kılcal kolonlar da yaygınlaştı. Kılcal kolonların iç çapı genellikle 0.20-0.75 mm'dir, uzunluk 30-105 m'dir.Sudaki kirleticilerin analizinde en iyi sonuçlar, fenil grupları içeren metilfenilsilikonlardan yapılmış farklı film kalınlıklarına sahip kılcal kolonlar kullanıldığında çoğunlukla elde edilir. %5 ve %50... Numune giriş sistemi, genellikle kapiler kolonlar kullanan kromatografik tekniklerde bir güvenlik açığı haline gelir. Örnek tanıtım sistemleri iki gruba ayrılabilir: evrensel ve seçici. Çok yönlü uygulamalar arasında split ve splitless enjeksiyon sistemleri, "soğuk" kolon enjeksiyonu ve sıcaklık programlı buharlaştırma yer alır. Seçici enjeksiyon ile ara yakalama ile üfleme, headspace analizi vb. Üniversal enjeksiyon sistemlerini kullanırken, örneğin tamamı kolona verilir; seçici enjeksiyon ile sadece belirli bir fraksiyon enjekte edilir. Kolona giren fraksiyon sadece uçucu maddeler içerdiğinden ve teknik tamamen otomatikleştirilebildiğinden seçici enjeksiyon ile elde edilen sonuçlar çok daha doğrudur.

Kirleticilerin izlenmesinde kullanılan gaz kromatografik dedektörler genellikle mobil fazdaki her bileşene yanıt veren evrensel dedektörler ve mobil fazda benzer kimyasal özelliklere sahip belirli bir madde grubunun varlığına yanıt veren seçici dedektörler olarak ikiye ayrılır. Evrensel olanlar alev iyonizasyonu, atomik emisyon, kütle spektrometrik dedektörleri ve kızılötesi spektrometriyi içerir. Su analizinde kullanılan seçici dedektörler elektron yakalama (halojen atomları içeren maddelere seçici), termoiyonik (azot ve fosfor içeren bileşiklere seçici), fotoiyonizasyon (aromatik hidrokarbonlara seçici), elektrolitik iletkenlik dedektörü (halojen atomları içeren bileşiklere seçici) , kükürt ve azot). Minimum tespit edilebilir madde miktarı nanogramdan saniyede pikograma kadardır.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi(HPLC), gaz kromatografisi ile analiz edilemeyen çok sayıda termal olarak kararsız bileşiğin belirlenmesi için ideal bir yöntemdir. Metil karbonatlar ve organofosfat insektisitler ve diğer uçucu olmayan maddeler dahil olmak üzere modern tarım kimyasalları, genellikle sıvı kromatografisi ile analiz nesneleri haline gelir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, çevresel izlemede kullanılan diğer yöntemler arasında popülerlik kazanmaktadır, çünkü aynı zamanda numune hazırlama otomasyonu açısından parlak umutları vardır.

BÖLÜM 1. TEMEL KAVRAMLAR VE SIVI KROMATOGRAFİSİ YÖNTEMLERİNİN SINIFLANDIRILMASI

Sıvı kromatografisi, sabit faz desteğinin tipine bağlı olarak birkaç sınıfa ayrılır. Kağıdın basit donanım tasarımı ve ince tabaka kromatografisi, bu yöntemlerin analitik uygulamada yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Bununla birlikte, sıvı kolon kromatografisinin büyük olanakları, bu klasik yöntem için ekipmanın geliştirilmesini teşvik etti ve HPLC'nin hızlı bir şekilde tanıtılmasına yol açtı. Eluentin kolondan yüksek basınç altında geçirilmesi, analiz hızını önemli ölçüde artırmayı ve ince bir şekilde dağılmış bir sorbent kullanılması nedeniyle ayırma verimliliğini önemli ölçüde artırmayı mümkün kıldı. HPLC yöntemi şu anda organik bileşiklerin karmaşık karışımlarını izole etmeyi, nicel ve nitel olarak analiz etmeyi mümkün kılmaktadır.

Ayrıştırılacak maddenin (elüat) durağan faz ile etkileşim mekanizmasına göre adsorpsiyon, dağılım, iyon değişimi, boyut dışlama, iyon çifti, ligand değişimi ve afinite kromatografisi ayırt edilir.

adsorpsiyon kromatografisi... Adsorpsiyon kromatografisi ile ayırma, ayrılacak maddenin yüzeyde aktif polar merkezleri olan alümina veya silika jel gibi bir adsorban ile etkileşimi sonucunda gerçekleştirilir. Çözücü (eluent) polar olmayan bir sıvıdır. Sorpsiyon mekanizması, sorbentin polar yüzeyi ile analiz edilen bileşenin moleküllerinin polar (veya polarizasyon yapabilen) bölgeleri arasındaki özel bir etkileşimden oluşur (Şekil 1).

Pirinç. 1. Adsorpsiyon sıvı kromatografisi.

bölme kromatografisi... Sıvı kromatografisinin dağıtım varyantında, bir madde karışımının ayrılması, karışmayan iki faz - eluent (hareketli faz) ve sorbent üzerindeki faz (sabit faz) arasındaki dağılım katsayılarındaki fark nedeniyle gerçekleştirilir.

NS normal faz Dağıtım sıvı kromatografisinin bir varyantında, sorbentin (çoğunlukla silika jel) yüzeyine aşılanmış polar olmayan bir eluent ve polar gruplar kullanılır. Nitril, amino grupları vb. gibi polar gruplar içeren ikameli alkilklorosilanlar, silika jel yüzeyinin değiştiricileri olarak kullanılır (aşılanmış fazlar) (Şekil 2). Aşılı fazların kullanımı, sabit faz yüzeyinin sorpsiyon özelliklerini hassas bir şekilde kontrol etmeyi ve yüksek ayırma verimi elde etmeyi mümkün kılar.

Pirinç. 2. Aşılanmış fazlı bölme kromatografisi (normal faz varyantı).

Pirinç. 3. Aşılı faz ayırma kromatografisi (ters faz versiyonu).

Desteklenen fazlar ile sıvı kromatografisinin daha az kullanılan bir versiyonu, sabit bir destek üzerinde sıvı bir sabit fazın biriktirilmesidir.

Özel (jel nüfuz eden) kromatografi, sıvı kromatografisinin bir çeşididir, burada maddelerin ayrılması, moleküllerin sorbentin gözeneklerindeki çözücü ile parçacıkları arasında akan çözücü arasındaki dağılımı nedeniyle meydana gelir.

afin kromatografi, proteinlerle seçici olarak kompleksler (konjugatlar) oluşturan, sorbent (sentetik reçine) yüzeyine aşılanmış maddeler (antijenler) ile ayrılmış proteinlerin (antikorların) spesifik etkileşimlerine dayanır.

İyon değişimi, iyon çifti, ligand değişim kromatografisi esas olarak inorganik analizlerde kullanılır.

Kromatografik ayırmanın temel parametreleri.

Kromatografik ayırmanın ana parametreleri, karışım bileşeninin alıkonma hacmi ve alıkonma süresidir (Şekil 4).

Tutma süresi tR, örneğin kolona enjekte edildiği andan karşılık gelen pikin maksimumu ortaya çıkana kadar geçen süredir. Tutma süresini eluent hacimsel hız F ile çarparak, tutma hacmini VR elde ederiz:

Düzeltilmiş alıkonma süresi - emilmemiş bileşenin maksimum zirvesinin ortaya çıktığı andan ilgili bileşiğin zirvesine kadar geçen süre:

tR "= tR - t0;

Azaltılmış veya düzeltilmiş alıkonma hacmi, kolon ölü hacmi V0 için düzeltilmiş alıkonma hacmidir, yani emilmemiş bileşenin alıkonma hacmi:

VR "= VR - V0;

Tutma özelliği aynı zamanda sabit fazdaki maddenin kütlesinin hareketli fazdaki maddenin kütlesine oranı olarak tanımlanan kapasite katsayısı k "'dir: k" = mn / mp;

k "değerini kromatogramdan belirlemek kolaydır:

Kromatografik ayırmanın en önemli parametreleri verimliliği ve seçiciliğidir.

Teorik plakaların yüksekliği (HETT) ile ölçülen ve sayılarıyla (N) ters orantılı olarak kolonun verimliliği, aynı alıkonma zamanında çıkan maddenin tepe noktası ne kadar dar olursa o kadar yüksek olur. Verimlilik değeri, aşağıdaki formül kullanılarak kromatogramdan hesaplanabilir:

N = 5,54 . (tR / 1/2) 2 ,

nerede tr- tutma süresi,

w 1/2 - yarım yükseklikte tepe genişliği

Kolon başına teorik plaka sayısını, kolon uzunluğunu L ve ortalama emici tane çapı dc'yi bilerek, teorik plakaya (HETT) ve azaltılmış yüksekliğe (PVETT) eşdeğer yükseklik değerlerini elde etmek kolaydır:

VETT = L / N PVETT = VETT / d C

Bu özellikler, sorbentin kalitesini ve kolonları doldurma kalitesini değerlendirerek farklı tipteki kolonların verimliliğini karşılaştırmaya izin verir.

İki maddenin ayrılmasının seçiciliği denklem ile belirlenir:

İki bileşenli bir karışımın ayrılması düşünüldüğünde, önemli bir parametre de ayırma derecesi RS'dir:

;

RS değeri 1.5'e eşit veya daha büyükse, piklere izin verildiği kabul edilir.

Ana kromatografik parametreler, çözünürlük için aşağıdaki denklemle bağlantılıdır:

;

Ayırma seçiciliğini belirleyen faktörler şunlardır:

1) sorbentin kimyasal yapısı;

2) çözücünün ve değiştiricilerinin bileşimi;

3) ayrılacak karışımın bileşenlerinin kimyasal yapısı ve özellikleri;

4) kolon sıcaklığı

1.1 Sıvı kromatografisi için aparat

Modern sıvı kromatografisinde, en basit sistemlerden çeşitli ek cihazlarla donatılmış yüksek sınıf kromatograflara kadar değişen derecelerde karmaşıklığa sahip cihazlar kullanılır.

İncirde. 4. Herhangi bir kromatografik sistemde mevcut olan, şu veya bu şekilde gerekli minimum bileşen setini içeren bir sıvı kromatografın blok şeması sunulmaktadır.

Pirinç. 4. Bir sıvı kromatografın blok diyagramı.

Pompa (2), sabit bir solvent akışı oluşturacak şekilde tasarlanmıştır. Tasarımı öncelikle sistemdeki çalışma basıncı tarafından belirlenir. 10-500 MPa aralığında çalışması için pistonlu (şırınga) veya pistonlu tip pompalar kullanılmaktadır. İlkinin dezavantajı, eluent ile doldurmak için periyodik olarak durma ihtiyacı ve ikincisinin tasarımın büyük karmaşıklığı ve sonuç olarak yüksek fiyattır. 1-5 MPa'lık düşük çalışma basınçlarına sahip basit sistemler için ucuz peristaltik pompalar başarıyla kullanılmaktadır, ancak sabit basınç ve akış hızı elde etmek zor olduğu için kullanımları hazırlık görevleriyle sınırlıdır.

Enjektör (3), ayrılacak bileşenlerden oluşan bir karışım numunesinin kolona yeterince yüksek tekrarlanabilirlikle enjekte edilmesini sağlar. Basit akış durdurma örnekleme sistemleri bir pompa durdurma gerektirir ve bu nedenle Reodyne döngü dağıtıcılarından daha az uygundur.

HPLC kolonları (4), yüksek basınca dayanabilen kalın duvarlı paslanmaz çelik borulardır. Emici madde ile kolon dolgusunun yoğunluğu ve homojenliği önemli bir rol oynar. Düşük basınçlı sıvı kromatografisi için kalın duvarlı cam kolonlar başarıyla kullanılmıştır. Sıcaklık sabitliği bir termostat (5) ile sağlanır.

Sıvı kromatografisi için dedektörler (6), içinde akan eluentin bazı özelliklerinin sürekli olarak ölçüldüğü bir akış hücresine sahiptir. Genel amaçlı dedektörlerin en popüler türleri, kırılma indisini ölçen refraktometreler ve sabit bir dalga boyunda (genellikle ultraviyole bölgesinde) bir çözücünün absorbansını ölçen spektrofotometrik dedektörlerdir. Refraktometrelerin avantajları (ve spektrofotometrelerin dezavantajları), kromofor grupları içermeyen, belirlenmekte olan bileşik tipine karşı düşük hassasiyet içerir. Öte yandan, refraktometrelerin kullanımı izokratik sistemlerle sınırlıdır (sabit bir eluent bileşimi ile), bu durumda bir çözücü gradyanının kullanılması mümkün değildir.

Çevresel kirleticilerin analizinde en yaygın olarak kullanılan HPLC kolonları 25 cm uzunluğunda ve 4.6 mm iç çapta olup, oktadesil grupları ile aşılanmış 5-10 mikron boyutunda küresel silika jel partikülleri ile doldurulmuştur. Son yıllarda, daha küçük partiküllerle dolu daha küçük iç çapa sahip kolonlar ortaya çıkmıştır. Bu tür kolonların kullanılması, çözücü tüketiminde ve analiz süresinde azalmaya, ayırma hassasiyeti ve verimliliğinde bir artışa yol açar ve ayrıca kolonların spektral dedektörlere bağlanması problemini kolaylaştırır. 3,1 mm iç çapa sahip kolonlar, servis ömrünü uzatmak ve analizlerin tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için bir güvenlik kartuşu (ön kolon) ile donatılmıştır.

Modern HPLC cihazlarında dedektörler olarak, genellikle bir diyot matrisi üzerinde bir UV dedektörü, floresan ve elektrokimyasal kullanılır.

Pratik çalışmada, ayırmanın genellikle birer birer değil, aynı anda birkaç mekanizma yoluyla gerçekleştiği akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, dışlama ayırma, adsorpsiyon etkileri, adsorpsiyon - dağıtım ve bunun tersi ile karmaşıktır. Ayrıca, iyonlaşma derecesi, baziklik veya asitlik, moleküler ağırlık, polarize edilebilirlik ve diğer parametreler açısından numunedeki maddeler arasındaki fark ne kadar büyük olursa, bu tür maddeler için farklı bir ayırma mekanizması olasılığı da o kadar yüksek olur.

Pratikte, en yaygın olanı, durağan fazın polar olmadığı, mobil fazın polar olduğu (yani, "doğrudan faz" kromatografisinin tersi) "ters faz" (dağıtım) kromatografisidir.

Dünyadaki çoğu laboratuvarda, 16 öncelikli PAH grubu HPLC veya CMS ile analiz edilir.

BÖLÜM 2. HPLC'NİN ÖZÜ

Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC), kromatografik bir kolonda meydana gelen proseslerin doğası genellikle gaz kromatografisindeki proseslerle aynıdır. Tek fark, bir sıvının sabit bir faz olarak kullanılmasıdır. Sıvı mobil fazların yüksek yoğunluğu ve yüksek kolon direnci nedeniyle, gaz ve sıvı kromatografisi donanım tasarımlarında büyük farklılıklar gösterir.

HPLC'de mobil fazlar olarak genellikle saf çözücüler veya bunların karışımları kullanılır.

Sıvı kromatografide eluent olarak adlandırılan bir saf çözücü (veya çözücü karışımları) akışı oluşturmak için kromatografın hidrolik sisteminde pompalar kullanılır.

Adsorpsiyon kromatografisi, bir maddenin yüzeyde aktif merkezleri olan silika jel veya alümina gibi adsorbanlarla etkileşimi sonucunda gerçekleştirilir. Farklı numune moleküllerinin adsorpsiyon merkezleriyle etkileşime girme yeteneğindeki fark, kolon boyunca hareketli faz ile hareket sırasında bölgelere ayrılmalarına yol açar. Bu durumda elde edilen bileşenlerin bölgelerinin ayrılması, hem çözücü hem de adsorban ile etkileşime bağlıdır.

Farklı hacimlere, yüzeylere ve gözenek çaplarına sahip silika jel adsorbanları, HPLC'de en yaygın şekilde kullanılır. Alümina ve diğer adsorbanlar çok daha az kullanılır. Bunun ana nedeni:

HPLC için tipik olan yüksek basınçlarda paketlemeye ve kullanıma izin vermeyen yetersiz mekanik mukavemet;

silika jel, alüminyum oksit ile karşılaştırıldığında, daha geniş bir gözeneklilik, yüzey alanı ve gözenek çapı aralığına sahiptir; alüminyum oksidin önemli ölçüde daha yüksek katalitik aktivitesi, numune bileşenlerinin ayrışması veya bunların geri döndürülemez kimyasal soğurulması nedeniyle analiz sonuçlarının bozulmasına yol açar.

HPLC dedektörleri

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), herhangi bir nedenle gaz kromatografisi için uygun bir forma dönüştürülemeyen, türevleri şeklinde bile olsa, polar uçucu olmayan maddeleri tespit etmek için kullanılır. Bu maddeler, özellikle sülfonik asitleri, suda çözünür boyaları ve fenil-üre türevleri gibi bazı pestisitleri içerir.

Dedektörler:

UV - diyot dizisi dedektörü. Fotodiyotların "matrisi" (iki yüzden fazla vardır) UV ve görünür spektral bölgelerdeki sinyalleri sürekli olarak kaydeder, böylece tarama modunda UV-B spektrumlarının kaydedilmesini sağlar. Bu, özel bir hücreden hızla geçen bileşenlerin bozulmamış spektrumlarını sürekli olarak yüksek hassasiyette kaydetmeyi mümkün kılar.

Zirvenin "saflığı" hakkında bilgi sağlamayan tek dalga boyu algılama ile karşılaştırıldığında, bir diyot dizisinin tam spektrumunu karşılaştırma yeteneği, çok daha yüksek bir güvenle bir tanımlama sonucu sağlar.

Floresan dedektörü. Floresan dedektörlerin büyük popülaritesi, çok yüksek seçicilik ve hassasiyetten ve birçok çevresel kirleticinin floresan (örneğin, poliaromatik hidrokarbonlar) olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır.

Kolayca oksitlenen veya indirgenen maddeleri tespit etmek için bir elektrokimyasal dedektör kullanılır: fenoller, merkaptanlar, aminler, aromatik nitro ve halojen türevleri, keton aldehitler, benzidinler.

PP'nin yavaş ilerlemesi nedeniyle kolondaki karışımın kromatografik olarak ayrılması uzun zaman alır. İşlemi hızlandırmak için kromatografi basınç altında gerçekleştirilir. Bu yönteme yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) denir.

Klasik sıvı kolon kromatografisinde kullanılan ekipmanın modernizasyonu, onu en umut verici ve modern analiz yöntemlerinden biri haline getirdi. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hem düşük hem de yüksek moleküler ağırlıklı uçucu olmayan termolabil bileşiklerin ayrılması, hazırlayıcı izolasyonu ve kalitatif ve kantitatif analizi için uygun bir yöntemdir.

Kullanılan sorbent tipine bağlı olarak, bu yöntem 2 kromatografi seçeneği kullanır: polar olmayan bir eluent kullanan bir polar sorbent üzerinde (doğrudan faz seçeneği) ve polar bir eluent kullanan polar olmayan bir sorbent üzerinde - ters fazlı yüksek olarak adlandırılır -performans sıvı kromatografisi (HPLC).

Eluent, eluent'e geçtiğinde, HPLC koşulları altındaki denge, polar sorbentler ve susuz PP'lerin koşulları altında olduğundan çok daha hızlı kurulur. Bunun bir sonucu olarak, sulu ve sulu-alkolik eluentlerle çalışmanın rahatlığının yanı sıra Off-HPLC, günümüzde büyük popülerlik kazanmıştır. Çoğu HPLC analizi bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilir.

Dedektörler. Ayrı bir bileşenin sütunundan çıkışın kaydı, bir dedektör kullanılarak gerçekleştirilir. Kayıt için, mobil fazdan gelen ve karışım bileşeninin doğası ve miktarı ile ilişkili herhangi bir analitik sinyalde bir değişiklik kullanabilirsiniz. Sıvı kromatografisinde, çıkış çözeltisinin ışık absorpsiyonu veya ışık emisyonu (fotometrik ve florometrik dedektörler), kırılma indisi (refraktometrik dedektörler), potansiyel ve elektriksel iletkenlik (elektrokimyasal dedektörler) gibi analitik sinyaller kullanılır.

Sürekli olarak algılanan sinyal bir kaydedici tarafından kaydedilir. Kromatogram, karışımın tek tek bileşenleri kolondan ayrıldığında oluşturulan, kayıt cihazı bandına kaydedilen dedektör sinyallerinin bir dizisidir. Karışımın ayrılması durumunda, harici kromatogramda ayrı ayrı pikler görülebilir. Zirvenin kromatogram üzerindeki konumu, tanımlama amacıyla, tepenin yüksekliği veya alanı, niceleme amacıyla kullanılır.

2.1 Uygulama

HPLC en yaygın olarak aşağıdaki kimyasal analiz alanlarında kullanılmaktadır (HPLC'nin neredeyse hiçbir rekabeti olmadığı durumlarda analiz nesneleri vurgulanmıştır):

Gıda kalite kontrolü - tonik ve tatlandırıcı katkı maddeleri, aldehitler, ketonlar, vitaminler, şekerler, boyalar, koruyucular, hormonlar, antibiyotikler, triazin, karbamat ve diğer pestisitler, mikotoksinler, nitrozaminler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar vb.

Çevre koruma - fenoller, organik nitro bileşikleri, mono- ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar, bir dizi pestisit, ana anyonlar ve katyonlar.

Adli bilim - ilaçlar, organik patlayıcılar ve boyalar, güçlü ilaçlar.

İlaç endüstrisi - steroid hormonları, hemen hemen tüm organik sentez ürünleri, antibiyotikler, polimer preparatları, vitaminler, protein preparatları.

İlaç - hastalıkların teşhisinde biyolojik sıvılarda (amino asitler, pürinler ve pirimidinler, steroid hormonlar, lipidler) listelenen biyokimyasal ve tıbbi maddeler ve bunların metabolitleri, bireysel amaçları için ilaçların vücuttan atılma oranının belirlenmesi dozaj.

Tarım - Uygulanan gübre miktarının belirlenmesi için topraklarda nitrat ve fosfat tayini, yemin besin değerinin (amino asitler ve vitaminler) belirlenmesi, toprak, su ve tarım ürünlerinde pestisitlerin analizi.

Biyokimya, biyoorganik kimya, genetik mühendisliği, biyoteknoloji - şekerler, lipidler, steroidler, proteinler, amino asitler, nükleositler ve bunların türevleri, vitaminler, peptitler, oligonükleotitler, porfirinler vb.

Organik kimya - tüm kararlı organik sentez ürünleri, boyalar, ısıya dayanıklı bileşikler, uçucu olmayan bileşikler; inorganik kimya (iyonlar ve kompleks bileşikler şeklinde hemen hemen tüm çözünür bileşikler).

gıda ürünleri, alkollü ve alkolsüz içecekler, içme suları, ev kimyasalları, parfümlerin üretimlerinin her aşamasında kalite kontrolü ve güvenliği;

insan kaynaklı bir afet veya acil durum sahasındaki kirliliğin niteliğinin belirlenmesi;

narkotik, güçlü, zehirli ve patlayıcı maddelerin tespiti ve analizi;

işletmelerde ve canlı organizmalarda sıvı atıklarda, hava emisyonlarında ve katı atıklarda zararlı maddelerin (polisiklik ve diğer aromatik hidrokarbonlar, fenoller, pestisitler, organik boyalar, ağır, alkalin ve alkalin toprak metallerinin iyonları) varlığının belirlenmesi;

organik sentez süreçlerinin, petrol ve kömür işlemenin, biyokimyasal ve mikrobiyolojik endüstrilerin izlenmesi;

gübreleme için toprağın kalitesinin, toprakta, suda ve ürünlerde pestisit ve herbisitlerin varlığının yanı sıra yemin besin değerinin analizi; karmaşık araştırma analitik görevleri; eser miktarda ultra saf madde elde etmek.

BÖLÜM 3. ÇEVRESEL OBJELERİN ANALİZİNDE HPLC KULLANIM ÖRNEKLERİ

HPLC - çevresel nesnelerdeki PAH'ları izlemek için bir yöntem

Polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'ler), 1. tehlike sınıfının ekotoksik maddeleri için, doğal nesnelerde son derece düşük seviyelerde izin verilen maksimum konsantrasyonlar (MPC) belirlenmiştir. MPC düzeyinde ve altında PAH'ların belirlenmesi, çok karmaşık analitik görevlerden biridir ve bunları çözmek için yüksek teknoloji analiz yöntemleri (GC-MS, GC, HPLC) kullanılır. İzleme için bir yöntem seçerken, dikkate alınan ana özelliklere - duyarlılık ve seçicilik, hız ve ekonomi eklenir, çünkü izleme, bir seri analizi içerir. Kısa, küçük çaplı kolonlardaki HPLC seçeneği, bu gereksinimleri büyük ölçüde karşılar. Bu yöntemi kullanarak, yazarlar üç doğal ortamda benzo [a] pireni izlemek için yöntemler geliştirdiler ve onayladılar: aerosol, kar örtüsü ve yüzey suları. Teknikler şunlarla karakterize edilir: PAH'ların organik çözücülerle ekstraksiyonu ve ekstrakt konsantrasyonu dahil olmak üzere basit birleştirilmiş numune hazırlama, konsantre ekstraktın kromatografik kolona doğrudan eklenmesi, UV bölgesinde çok dalga boylu fotometrik algılamanın kullanılması. spektrum, kromatogramlarda iki parametre, alıkonma süresi ve spektral oran kullanılarak PAH tepe noktalarının tanımlanması... Aerosolde benzo [a] piren 0,3 ila 450 ng / m3 konsantrasyon aralığında, yüzey sularında 10 ila 1000 ng / L konsantrasyon aralığında, kar örtüsünde benzo [a] piren belirlenirken toplam hata% 10'u geçmez. 0,5 ila 50 μg / m2 arasında yüzey yoğunluğu aralığı. Öncelikli PAH'ların (12 bileşiğe kadar) eşzamanlı belirlenmesi ve analitlerin homojen olmayan piklerinin kaydedilmesi durumunda, ekstrenin mobil fazın seçiciliğinde, algılama dalga boyunda ve kolon sıcaklığında bir değişiklikle yeniden ayrılması önerilir, belirlenen PAH'ın bireysel özelliklerini dikkate alarak.

1 ... Ortam hava kalitesi. Benzo [a] pirenin kütle konsantrasyonu. HPLC ölçüm tekniği. Onay sertifikası MVI No. 01-2000.

2 ... Yüzey kalitesi ve arıtılmış atık su. Benzo [a] pirenin kütle konsantrasyonu. HPLC ölçüm tekniği. Onay sertifikası MVI No. 01-2001.

3 ... Kar kalitesi. Benzo [a] pirenin kütle konsantrasyonu. HPLC ölçüm tekniği. Onay belgesi MVI No. 02-2001.

Haddelenmiş bakır tortusunun atık alümotermal indirgemesi kullanılarak sulu çözeltilerden anilinin uzaklaştırılması

Hidrokarbonların atık sudan uzaklaştırılması sorunu acil bir iştir. Birçok kimya, petrokimya ve diğer endüstrilerde toksik maddeler olan anilin ve türevleri oluşur. Anilin oldukça toksik bir maddedir, maksimum konsantrasyon limiti 0.1 mg/m3'tür. Anilin ve türevleri suda çözünür ve bu nedenle yerçekimi ile çökeltme ile uzaklaştırılamaz.

Atıksuyu organik kirleticilerden arındırmanın en iyi yöntemlerinden biri, yenilenebilen (alüminosilikatlar, modifiye killer, ahşap, lifler, vb.) ve yenilenemeyen (aktif karbon, makro gözenekli polimer malzemeler, vb.) inorganik ve organik adsorbanların kullanılmasıdır. . ).

Rejenere adsorbanlar, farklı polaritelerdeki organik maddeleri sudan çıkarabilir. Etkili adsorbanların aranması acil bir iştir.

Bu rapor, Erivan Kablo Fabrikasının (OPMOERKZ) haddelenmiş bakır ölçeğinin anilin sorbentleri olarak uygulanması alanındaki bir çalışmanın sonuçlarını sunmaktadır.

Kromatografik çalışmalar, bir HPLC kromatografı / yüksek performanslı sıvı kromatografisi / sistemleri (Waters 486 - dedektör, Waters 600S - kontrolör, Waters 626 - Pompa), incelenen sorbentlerle doldurulmuş 250 x 4 mm'lik bir kolonda, mobil faz hızı 1 ml/m/mobil faz araştırdığımız çözücülerdir/, dedektör UV-254'tür. UV spektroskopik analizi, bir Specord-50 spektrofotometre üzerinde gerçekleştirildi, spektrumlar ASPECT PLUS bilgisayar programı kullanılarak elde edildi.

Tam olarak tartılmış sorbent kısımları, başlangıç konsantrasyonları farklı olan su içindeki belirli hacimlerdeki anilinlere ilave edildi. Karışım 6 saat boyunca iyice çalkalandı, ardından numune çökmeye bırakıldı. Adsorpsiyon 48 saat içinde pratik olarak tamamlanır Çöken anilin miktarı UV spektrofotometrik ve refraktometrik analiz ile belirlendi.

İlk olarak, karbon tetraklorür içindeki bir çözeltiden anilin çıkarıldığında OPMOErKZ'nin adsorpsiyon özellikleri araştırıldı. Anilinin en iyi sorbent 3'ü emdiği ortaya çıktı (tablo).

0.01-0.0001 mol / l konsantrasyonlarında anilin sulu çözeltileri için de ölçümler yapıldı. Tablo, 0,01 M'lik bir çözüm için verileri gösterir.

20 ° C'de 0.01 M sulu anilin çözeltisinden çeşitli sorbentler tarafından anilin absorpsiyonu

Önceden, adsorpsiyonun belirtilen konsantrasyon aralığında arttığı ve doğrusal olarak kırılma indisine bağlı olduğu bulunmuştu. Anilin miktarı, "kırılma indeksi - molar konsantrasyon" grafik ilişkisinden belirlendi ve hem sıvı kromatografisi hem de UV spektral analizi verileriyle düzeltildi.

Sorbent 3, sulu çözeltiler için en aktif olanıdır.Adsorbe edilen kirletici miktarı, ilk çözeltiye eklenen toplam kirletici miktarı ile nihai çözeltide kalan miktarı arasındaki fark olarak hesaplanmıştır.

Çevresel nesnelerde PAH'ların belirlenmesi için yöntemler

Tipik olarak, PAH'ları belirlemek için gaz kromatografisi (GC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemleri kullanılır. kantitatif analiz için yeterli olan ana 16 PAH'ın ayrılması, gaz kromatografisinde kapiler kolonlar veya HPLC'de kullanılan yüksek performanslı kolonlar kullanılarak elde edilir. On altı PAH'ın kalibrasyon karışımlarını iyi ayıran bir sütunun, test numunelerinde eşlik eden organik bileşiklerin arka planına karşı da iyi ayrılacaklarını garanti etmediği unutulmamalıdır.

Analizi basitleştirmek ve elde edilen sonuçların yüksek kalitesini elde etmek için, analitik prosedürlerin çoğu, numunelerdeki diğer ilgili bileşik gruplarından PAH'ların ön izolasyonu (ayırma) aşamasını içerir. Düşük basınçlı sıvı-katı veya sıvı-sıvı sıvı kromatografi teknikleri bu amaç için en yaygın olarak silika jel veya alümina gibi adsorpsiyon mekanizmaları kullanılarak kullanılır, bazen de Sephadex kullanılarak adsorpsiyon ve eliminasyon gibi karışık mekanizmalar kullanılır.

Numunelerin ön saflaştırılmasının kullanılması, aşağıdakilerin etkisinden kaçınmayı mümkün kılar:

Alifatik hidrokarbonlar gibi tamamen polar olmayan bileşikler;

Ftalanlar, fenoller, polihidrik alkoller, asitler gibi orta ila yüksek düzeyde polar bileşikler;

Reçineler gibi yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) esas olarak iki tür dedektör kullanır: bir florometrik dedektör veya bir fotodiyot dizisine sahip bir spektrofotometrik dedektör. Florometrik tespitte PAH'ların tespit limiti çok düşüktür, bu da bu yöntemi özellikle eser miktarlarda poliaromatik bileşiklerin tespiti için uygun hale getirir. Bununla birlikte, klasik florometrik dedektörler, incelenen bileşiğin yapısı hakkında pratik olarak hiçbir bilgi sağlamaz. Modern tasarımlar, bireysel bileşiklerin karakteristiği olan floresan spektrumlarının kaydedilmesini mümkün kılar, ancak bunlar rutin ölçümlerin pratiğinde henüz yaygınlaşmamıştır. Fotodiyot cetvelli (PDL) bir spektrofotometrik dedektör, UV ve görünür spektral aralıkta absorpsiyon spektrumlarını kaydetmeyi mümkün kılar, bu spektrumlar tanımlama için kullanılabilir. Benzer bilgiler, hızlı tarama dedektörleri kullanılarak elde edilebilir.

Bahsedilen PAH'ların ayrılması, tanımlanması ve nicel analizi için bir analitik teknik seçerken aşağıdaki koşullar dikkate alınmalıdır:

Test numunelerinde belirlenen içeriklerin seviyesi;

İlgili maddelerin sayısı;

Kullanılan analitik prosedür (ölçüm tekniği);

Seri ekipmanın yetenekleri.

İyonik yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile toprak alkali elementlerin ve magnezyumun belirlenmesi için bir yöntemin geliştirilmesi

Su analizi problemlerinin çözümüne olanak sağlayan yöntemlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi analitik kimyada önemli bir problemdir. Yüksek basınçlı yüksek performanslı sıvı kromatografisinin geliştirilmesi, iyon değişim kromatografisinde iyon kromatografisi adı verilen yeni bir yönün gelişimini teşvik etti. İyon kromatografisi için sorbentlerin sentezi zordur, çünkü onlar için birçok gereksinim vardır. Ticari olarak temin edilebilen oldukça etkili katyon değiştiricilerin olmaması nedeniyle, bir değiştiricinin sentezlendiği dinamik olarak modifiye edilmiş bir ters faz kullanıldı: N-heksadesil-N-dekanoil-paraminobenoilsülfonik asit etil-diizopropilamonyum (DHDASK), burada SO 3 - katyon değişimi yapabilen grup. Değiştirici çözeltiyi geçtikten sonra, l = 260 nm'de absorpsiyon, bir plato ile 6.4 birim optik yoğunluğa (° E) ulaştı. Hesaplanan iyon değiştirme kapasitesi 15,65 µmol'dür. Alkali toprak elementlerinin ve magnezyumun katyonları spektrumun UV bölgesinde absorbe etmediğinden, sentezlenen UV absorbe edici eluent 1,4-dipiridinyum bütan bromür (DPB bromür) kullanılarak dolaylı UV tespiti kullanıldı. Halojen iyonları kolonun çelik kısımlarını tahrip ettiğinden, 1,4-dipiridinyumbütan bromür iyonu asetat iyonu ile değiştirildi. Kolon, eluent ile yıkandığında, değiştirici karşı iyon, etildiizopropilamonyum, UV emici 1,4-dipiridinyumbutan iyonu ile değiştirilir. Katyonların ayrılması, "ölçek katlama" modunda 0,4 A ölçeğinde optimal dalga boyu l = 260 nm'de gerçekleştirildi; kaydedicinin polaritesi tersine çevrildi. Çalışılan tüm katyonların ayrılması, kompleks yapıcı bir katkı maddesi olan oksalik asit eklenerek sağlandı. Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ için tespit limitleri 8 μg / L'dir; 16 μg / L; 34 μg / L; Sırasıyla 72 μg / L. Seçilen koşullar altında, 10.6 +1.9 mg-iyon / l, Mg 2+ -2.5 + mg-iyon / l olan Ca2+ içeriği musluk suyu analiz edildi. Tekrarlanabilirlik hatası Ca 2+ için %-2,2'yi ve Mg 2+ için %1.4'ü geçmez.

Çevredeki kadmiyum komplekslerinin analizi

Biyosferdeki ağır metallerin göç mekanizmalarını incelemek için, doğada metallerin varlığının kimyasal formları hakkında verilere ihtiyaç vardır. En toksik metallerden birinin - kadmiyum - bileşiklerinin analizindeki zorluklar, kırılgan kompleksler oluşturması ve onları izole etmeye çalışırken doğal dengelerin bozulması ile ilişkilidir. Bu çalışmada, topraktaki ve bitkilerdeki kadmiyum bileşikleri, ekstrelerin kromatografik olarak ayrılmasına ve ardından bileşenlerin kimyasal analizle tanımlanmasına dayanan bir teknik kullanılarak araştırıldı. Bu yaklaşım, yalnızca kadmiyumun kimyasal formlarını tanımlamayı değil, aynı zamanda çevresel nesnelerdeki dönüşümlerini izlemeyi de mümkün kıldı.

OH-karbonhidrat ve polifenol grupları (flavonoidler dahil), C = O, fosfatlar, NH 2, NO 2, SH grupları, biyosfer nesnelerinde kadmiyum ile koordine edilir. Bu çalışmanın amaçları doğrultusunda, bu bileşik sınıflarını temsil eden bir dizi model ligand derlenmiştir. Model ligandların suda çözünür kadmiyum tuzları ile etkileşimi UV spektroskopisi ve HPLC ile araştırıldı.

Kadmiyum bileşiklerini izole etmek için özel olarak seçilmiş (Cd ile kompleks oluşturmayan) çözücüler ile ekstraksiyon kullandık. Böylece kadmiyumu, yakın kimyasal analoğu olan çinko hariç tüm ağır metallerden ayırmak mümkündür. Elde edilen ekstraktların kromatogramlarında kadmiyum ve çinko içeren pikler ditizonat formundaki metallerin bağlanmasıyla tespit edildi. Çinkodan ayırma için, pH 6-8'de Cd ve Zn komplekslerinin stabilitesindeki fark kullanıldı. İzole edilen Cd bileşikleri, elüsyon sırasında pH'da bir değişiklik ile HPLC ile tanımlandı. Kadmiyum bileşiklerinin toprak bileşenleri ve bitki dokuları ile bir analizi yapıldı ve bitkiler tarafından topraktan kadmiyum alımındaki bir artışa tepki olarak üretilen maddeler belirlendi. Flavonoidlerin, özellikle trisinin, tahıllarda koruyucu ajanlar, baklagillerde sisteinin alkoksi türevleri ve turpgillerden bitkilerde hem polifenoller hem de tiyoller olduğu gösterilmiştir.

BÖLÜM 4. HPLC EKİPMANI

SERİSİ ACCELA

Yeni ACCELA ultra yüksek performanslı sıvı kromatografı, en geniş akış hızı ve basınç aralığında çalışabilir ve hem geleneksel kolonlarda tipik HPLC ayrımı hem de sorbent partikül boyutu 2'den küçük olan kolonlarda ultra hızlı ve verimli ayırma sağlar. μm ultra yüksek basınçlarda (1000 atm'nin üzerinde).

Sistem, yüksek hızlı kromatografik ayırma için sadece 65 µl tutma hacmine ve 1000 barı aşan basınçlara sahip üç ayda bir gradyan giriş pompası içerir. otomatik örnekleyici ACCELA 30 saniyelik numune enjeksiyon döngüsünde çalışabilir ve en yüksek enjeksiyon tekrarlanabilirliğini sağlar. Diyot Dizi Dedektörü Hızlandırılmış PDA minimum akış hücre hacmi (2 μL) ile yüksek hızlı kromatografi modu için optimize edilmiştir, patentli LightPipe teknolojisini kullanır ve kusursuz bir kromatografik sistem ve kolonların kullanılmasıyla sağlanan simetrik tepe şeklini korur.

Sistem, dünyadaki en güçlü ve en iyi HPLC / MS sistemlerini oluşturmak için kütle spektrometreleriyle mükemmel bir şekilde bütünleşir.

Her türlü uygulama için Thermo Electron'dan temin edilebilen 1,9 μm tane boyutuna sahip UHP kolonları

SERİSİ TSP

HPLC cihazlarının modüler tasarım ilkesi, müşterinin herhangi bir analitik görevi çözmek için ekipmanı esnek bir şekilde tamamlamasına olanak tanır ve değişirse, hızlı ve ekonomik olarak değiştirilebilir. Geniş modül yelpazesi, izokratikten dört bileşenli gradyan, mikro kolondan yarı hazırlayıcıya kadar değişen pompaları, mevcut tüm dedektörleri, el tipi enjektörlerden herhangi bir numune işleme özelliğine sahip otomatik numune alıcılara kadar numune enjeksiyon sistemlerini, ölçüm sonuçlarını işlemek ve hepsini kontrol etmek için güçlü bir yazılım içerir. sistem modülleri. Tüm modüller CSA, TUF / GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000'e göre sertifikalandırılmıştır, kompakttırlar, modern bir tasarıma sahiptirler, kullanımı kolaydır, yerleşik bir ekran ve self ile donatılmıştır. -diagnostic system, görev yöntemleri parametreleri oluşturmanıza ve kaydetmenize izin verir. "İyi Laboratuvar Uygulaması" (GLP) kriterlerini karşılarlar ve Rusya Federasyonu Ölçüm Cihazları Kaydı'nda listelenirler. Ölçüm raporları İngiltere, ABD, Almanya ve Fransa Farmakopelerine uygun olarak düzenlenmektedir.

TSP modüler sistemleri, en yüksek güvenilirlik ve operasyonel kararlılık ile karakterize edilir.

Modüllerin kombinasyonu, analiste bir yandan entegre bir sistemin tüm avantajlarını ve diğer yandan modüler bir sistemin esnekliğini sağlar. Yüksek Verimli Sıvı Kromatografisinin (HPLC) uygulama alanı ne olursa olsun -farmakoloji, biyoteknoloji, çevresel analiz, klinik analiz,

İç ortam havası: kontrol ve temizleme yöntemleri. Zararlı maddelerin kaynağının ve çevrenin kontrolü. Gaz analizörleri: gaz karışımının bileşimini izlemek için uygulama ve modern türleri - evrensel fotometrik sıvı ve bant.

Çevreyi izlemek ve kontrol etmek için bir sistem olarak izleme. Çevresel nesnelerdeki kirleticileri izleme yöntemleri.

Tek kolonlu iyon kromatografisi ile anyonların ayrılması. Bir iyon değişim reçinesi parçacığının yapısının görüntüsü. Çevresel nesnelerin analizinde iyon değişim kromatografisinin kullanımına örnekler. İyon kromatografisi ile bira analizinin özellikleri.

Organoklorlu bileşiklerin genel özellikleri, temel fiziksel ve kimyasal özellikleri ve uygulamaları, çevre, hayvan, balık ve insan vücuduna olumsuz etkileri. Gıdalardaki organoklorlu pestisitler ve bunların tayini için yöntemler.

Düzlemsel (ince tabaka) kromatografinin temelleri: İnce bir tabaka halinde kromatografi ile su, gıda, yem ve tütün ürünlerinde pestisitlerin, organoklorlu pestisitlerin analizi için modern enstrümantal yöntemlerin kullanılması durumu ve beklentileri.

Analiz için iç mekan hava örnekleri almak için mevcut yöntemler. Kolorimetrik tüplerin çalışma prensibi. Belirli bir kirletici ile temas üzerine belirli bir reaktifin renginin değişmesi. Uçucu organik bileşiklerin tespiti.

Fluometrinin teorik temelleri (lüminesans), çevresel nesnelerin ve modern araştırma ekipmanlarının analizinde uygulama alanları. Lüminesans analizinin olağanüstü hassasiyeti ve hızı. Uyarma enerji kaynağı sorunları.

Kimyasal analitik ekipmanın geliştirilmesi, yalnızca gerçekleştirilen ölçümlerin kalitesi sorununu ortadan kaldırmakla kalmaz, tam tersine, ölçümlerin tüm yönlerinde daha yüksek talepler doğurur.

Sanayi tesisi hakkında genel bilgiler. Bölgenin iklim koşulları. Teknolojik zincir. Kirlilik kaynakları ve doğal çevrenin bozulması. Doğal suların kirlenmesi. Yüzey suyu kalitesi gözlem noktaları. Su numunesi alma ve analiz yöntemleri.

İnsan ekonomik faaliyeti sırasında çevreye verilen çok çeşitli organik bileşikler, bu maddelerin hidrosferin teknolojik kirliliğinin doğasını belirleyen ana kirleticiler haline gelmesine yol açmaktadır.

Spektroskopik analiz yöntemlerinin özellikleri. Ekstraksiyon-fotometrik yöntemlerin özü. Doğal sularda ağır metallerin tayini için yöntemin kullanım örnekleri. Bromür iyonlarını, nitrat iyonlarını tespit etme yöntemi. Modern ekipman.

Gaz kromatografisinin kavramı ve amacı, tutma parametreleri. Tutma süresi ve tutma hacmi. Gaz kromatografisinde denklemler. Gaz kromatografisi için ek cihazlar. Acil durumlarda hava kirliliği kontrolü.

Kütle spektrometrisi yöntemi kavramı ve özellikleri. Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektrometrisinde çift odaklı kütle spektrometreleri. Çevresel kirleticilerin, ekipmanların tanımlanmasında kromatografi-kütle spektrometrisinin kullanımı.

Gaz akışlarının kirliliğini değerlendirme yöntemleri. Gaz örneklemesi ve analiz ve ölçüm yöntemleri için temel gereksinimler. Parametrik kirliliği değerlendirme yöntemleri. Su ortamı, toprak, toprak ve bitki örtüsünün kirliliğini değerlendirme yöntemleri. Değişikliklerin tanımlanması.

Spektrofotometri, fotokolorimetri ve kolorimetri ile adsorpsiyon yöntemlerini kullanan optik analiz yöntemleriyle saf metallerdeki madde içeriğinin yüzde binde birinin belirlenmesi. Web siteleri aracılığıyla kimyasal analitik ekipman satışı.

Kondüktometrik analiz yöntemlerinin uygulanmasının amacı ve temel ilkeleri. Kullanılan yöntemlerin çeşitleri ve uygulamalarının özellikleri. Çevresel nesnelerin ve bunun için gerekli ekipmanların analizinde kondüktometri kullanımına örnekler.

Doğal sularla ilgili olarak, nicel belirleme ve hidrokarbonların (CH) antropojenik ve doğal bileşenlerine ayırma sorunları göz önünde bulundurulur.

Su arıtmanın emme yöntemleri artık giderek daha yaygın olarak kullanılmaktadır ve en sık kullanılan emici maddelerden biri aktif karbondur.

Ana kromatografi türleri. Çevresel izlemede kromatografik yöntemlerin uygulanması. Çevresel nesnelerin analizinde kromatografinin uygulanması. Modern donanım tasarımı. Kromatogramların geliştirilmesi için yöntemler ve bir kromatografın çalışması.

Doğal suların fizikokimyasal yöntemlerle izlenmesi: düzlemsel (ince tabaka kromatografisi) ve su lizizi için uygulaması. Düz bir sorbent ve çözücü tabakasındaki bir madde karışımının ayrılması. Bir florometrede petrol ürünlerinin ışıldama yoğunluğu.

(OFS 42-0096-09)

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), mobil fazın (PF) sıvı olduğu bir kolon kromatografisi tekniğidir.

olmayan maddelerle dolu bir kromatografik kolonda hareket eden kemik

mobil faz (sorbent). HPLC kolonları, kolonun girişinde yüksek hidrolik basınçlara sahiptir, bu nedenle HPLC'ye bazen

vyvayut "yüksek basınçlı sıvı kromatografisi".

Maddelerin ayrılma mekanizmasına bağlı olarak, aşağıdakiler ayırt edilir:

HPLC seçenekleri: adsorpsiyon, dağıtım, iyon değişimi,

özel, kiral, vb.

Adsorpsiyon kromatografisinde, maddelerin ayrılması, farklı adsorpsiyon ve desorpsiyon yetenekleri nedeniyle meydana gelir.

gelişmiş bir yüzeye sahip bir adsorbanın yüzeyi, örneğin silika jel.

Dağıtım HPLC'de, ayrılacak maddelerin durağan maddeler arasındaki dağılım katsayılarının farklı olması nedeniyle ayrılma meydana gelir.

(genellikle hareketsiz bir desteğin yüzeyine kimyasal olarak aşılanır) ve

mobil aşamalar.

PP ve NF'nin polaritesine göre, HPLC normal faz ve hacim olarak ikiye ayrılır.

genişletilmiş faz

Normal fazlı kromatografi, kromatografinin bir varyantı olarak adlandırılır.

polar bir sorbent kullanın (örneğin, silika jel veya

bükülmüş NH2 - veya CN grupları) ve polar olmayan PF (örneğin, geliştirilmiş heksan

kişisel eklemeler). Ters faz kromatografisinde,

polar olmayan kimyasal olarak değiştirilmiş sorbentler kullanın (örneğin,

polar olmayan alkil radikali C18) ve polar mobil fazlar (örneğin,

metanol, asetonitril).

İyon değişim kromatografisinde, bir karışımdaki maddelerin molekülleri, ayrışma

Çözeltide katyonlara ve anyonlara dönüşürler, hareket ederken ayrılırlar.

iyonik ile farklı döviz kurları nedeniyle sorbent (katyon veya anyon)

sorbent grupları.

Dışlamada (elek, jel nüfuz eden, jel-filtreleme)

kromatografi, maddelerin molekülleri, sabit fazın gözeneklerine farklı nüfuz etme yetenekleri nedeniyle büyüklüklerine göre ayrılır. Bu durumda, ilk eş-

sabit fazın minimum sayıdaki gözeneklerine nüfuz edebilen en büyük moleküller (en yüksek moleküler ağırlığa sahip) ortaya çıkar,

ve ikincisi, küçük boyutlu moleküllere sahip maddelerdir.

Ayırma genellikle birer birer değil, aynı anda birkaç mekanizma ilerler.

HPLC yöntemi, herhangi bir olumsuzluğun kalitesini kontrol etmek için kullanılabilir.

elmacık analitleri. Analiz için uygun aletleri kullanın - sıvı kromatograflar.

Bir sıvı kromatografın bileşimi genellikle aşağıdaki temel bilgileri içerir:

herhangi bir düğüm:

– Mobil fazlı (veya kapasitif) bir kap içeren PF hazırlama ünitesi

mobil fazın parçası olan bireysel solventlerle

zy) ve PF gaz giderme sistemi;

– pompalama sistemi;

– mobil fazlı karıştırıcı (gerekirse);

– numune enjeksiyon sistemi (enjektör);

– kromatografik kolon (bir termostata monte edilebilir);

- dedektör;

– veri toplama ve işleme sistemi.

pompalama sistemi

Pompalar, belirli bir sabit hızda kolona PF beslemesi sağlar. Mobil fazın bileşimi sabit veya değişken olabilir.

analiz sırasında. İlk durumda, sürece izokratik denir,

ve ikinci degradede. Pompalama sisteminin önüne bazen kurulur.

mobil fazın filtrasyonu için 0,45 µm gözenek çapına sahip filtreler. Modern

Sıvı kromatograf pompalama sistemi, bir bilgisayar tarafından kontrol edilen bir veya daha fazla pompadan oluşur. Bu, eş değiştirmeyi sağlar.

Gradyan elüsyonu sırasında belirli bir programa göre PF olmak. küçük

Karıştırıcıdaki PF bileşenleri hem düşük basınçta hem de oluşabilir

(pompalardan önce) ve yüksek basınçta (pompalardan sonra). Karıştırıcı, PP'nin hazırlanması ve izokratik elüsyon için kullanılabilir,

bununla birlikte, daha doğru bir bileşen oranı, ön hazırlık ile elde edilir.

izokratik bir süreç için PP bileşenlerinin karıştırılması. Analitik HPLC için pompalar, kolon girişinde 50 MPa'ya kadar bir basınçta 0,1 ila 10 ml / dak aralığında kolona sabit bir PP akış hızının korunmasına izin verir. Ancak bu değerin aşılmaması tavsiye edilir.

Şalo 20 MPa. Basınç titreşimleri özel sönümleme ile en aza indirilir

pompaların tasarımına dahil olan demirli sistemler. Üzerinde çalışma parçaları

pompalar, PF'nin bileşiminde agresif bileşenlerin kullanılmasına izin veren korozyona dayanıklı malzemelerden yapılmıştır.

Mikserler

Tasarımları gereği mikserler statik veya dinamik olabilir.

zihinsel.

Mikserde tek hareketli faz oluşur.

Gerekli karışım önceden hazırlanmadıysa, pompalar tarafından sağlanan ayrı çözücüler. Çözücülerin karıştırılması genellikle kendiliğinden gerçekleşir, ancak bazen zorunlu karıştırma sistemleri kullanılır.

dikiş.

enjektörler

Enjektörler, numune enjeksiyonu için çok yönlü olabilir

1 µl ila 2 ml veya yalnızca belirli bir hacimde bir numuneyi enjekte etmek için ayrı

ema. Her iki enjektör türü de otomatik olabilir ("otomatik enjektörler" veya "otomatik numune alıcılar"). Numunenin (çözelti) enjeksiyonu için enjektör yer almıyor

doğrudan kromatografik sütunun önünde. Enjektörün tasarımı, PF akışının yönünü değiştirmeye ve numunenin belirli bir hacimli bir döngüye (genellikle 10 ila 100 μL) ön enjeksiyonu gerçekleştirmeye izin verir.

Bu hacim menteşe etiketinde belirtilmiştir. Enjektör tasarımı, döngünün değiştirilmesine izin verir. Analiz edilen çözümün bilinmeyene tanıtılması için

domates enjektörü, hacmi olan manuel bir mikro şırıngadır.

döngü hacmini önemli ölçüde aşıyor. Enjekte edilen çözeltinin fazlalığı,

döngüde atılır ve tam ve her zaman eşit hacimde numune kolona enjekte edilir. Döngünün manuel olarak eksik doldurulması doğruluğu azaltır

dozlama doğruluğu ve tekrarlanabilirliği ve bu nedenle doğruluğu bozar

kromatografik analizin niteliği ve tekrarlanabilirliği.

kromatografik sütun

Kromatografik kolonlar genellikle paslanmaz çelik, cam veya emici madde ile doldurulmuş ve kapalı plastik tüplerdir.

her iki tarafta 2–5 µm gözenek çapına sahip filtrelerle. analitik uzunluk

kolon, kromatografik ayırma mekanizmasına bağlı olarak, 5 ila 60 cm aralığında veya daha fazla olabilir (genellikle

10-25 cm), iç çap - 2 ila 10 mm (genellikle 4,6 mm). Mikro kolon kromunda iç çapı 2 mm'den küçük kolonlar kullanılır.

tografi. İç çapları olan kapiler kolonlar da kullanılmaktadır.

rom yaklaşık 0,3-0,7 mm. Hazırlayıcı kromatografi için sütunların iç çapı 50 mm veya daha fazladır.

Analitik kolonun önüne kısa kablolar takılabilir.

çeşitli yardımcı işlevleri yerine getiren sütunlar (koruma sütunları)

(daha sık - analitik sütunun korunması). Genellikle analiz bir bilgisayar ile gerçekleştirilir.

Bununla birlikte, ayırma verimliliğini artırmak için sıcaklık ve

analiz süresini azaltmak için bir termostat kullanılabilir

60 C'den yüksek olmayan sıcaklıklarda tirovanie kolonları. Daha yüksek sıcaklıklarda, sorbentin yok edilmesi ve PF'nin bileşiminde bir değişiklik mümkündür.

Sabit faz (sorbent)

Genellikle sorbent olarak kullanılır:

1. Normal şartlarda silika jel, alüminyum oksit, gözenekli grafit kullanılır.

küçük faz kromatografisi. Bu durumda tutma mekanizması

çay - genellikle adsorpsiyon;

2. Asidik veya bazik gruplara sahip reçineler veya polimerler. Uygulama alanı - iyon değişim kromatografisi;

3. Gözenekli silika jel veya polimerler (boyut dışlama kromatografisi);

4. Kimyasal olarak değiştirilmiş sorbentler (aşılı sorbentler

zami), en sık silika jel bazında hazırlanır. Çoğu durumda tutma mekanizması,

nuh ve durağan fazlar;

5. Kimyasal olarak değiştirilmiş kiral sorbentler, örneğin,

sulu selülozlar ve amilozlar, proteinler ve peptitler, siklodekstrinler,

enantiyomerlerin ayrılması için kullanılır (kiral kromatografi

Aşılı fazlara sahip sorbentler, değişen derecelerde kimyasal maddelere sahip olabilir.

teknik değişiklik. Emici partiküller küresel olabilir veya olmayabilir.

düzenli şekil ve çeşitli gözeneklilik.

En yaygın olarak kullanılan aşılanmış fazlar şunlardır:

– oktil grupları(sorbent oktilsilan veya C8);

– oktadesil grupları(sorbent oktadesilsilan

(ODS) veya C18);

– fenil grupları(fenilsilan emici);

– siyanopropil grupları(CN emici);

– aminopropil grupları(NH2 sorbenti);

- diol grupları (sorbent diol).

Çoğu zaman, analiz polar olmayan aşılanmış fazlar üzerinde gerçekleştirilir.

C18 sorbent kullanılarak ters faz modu.

Bazı durumlarda normal uygulama yapılması daha uygundur.

faz kromatografisi. Bu durumda, polar olmayan çözücülerle kombinasyon halinde silika jel veya polar aşılanmış fazlar ("CN", "NH2", "diol") kullanılır.

Aşılı fazlı sorbentler, üretici tarafından aksi belirtilmedikçe, 2,0 ila 8,0 pH değerlerinde kimyasal olarak stabildir.

Emici partiküller, küresel veya düzensiz şekillere ve çeşitli gözeneklere sahip olabilir. Analitik HPLC'de sorbentin partikül boyutu genellikle 3-10 µm'dir, hazırlayıcı HPLC'de - 50 µm veya daha fazladır.

Monolitik sorbentler de kullanılır.

Sorbent parçacıklarının yüksek yüzey alanı (mikroskobik olmalarının bir sonucu olarak) ile yüksek ayırma verimliliği sağlanır.

boyut ve gözeneklerin varlığı), ayrıca sorbent bileşiminin tekdüzeliği ve yoğun ve tek biçimli ambalajı.

dedektörler

Çeşitli algılama yöntemleri kullanılır. Genel durumda, kromatografik kolondan sonra içinde çözünen bileşenlere sahip PP

Ki, özelliklerinden birinin veya diğerinin (spektrumun UV veya görünür bölgesinde absorpsiyon, floresan,

kırılma indisi, elektriksel iletkenlik, vb.). Ortaya çıkan kromatogram, bazı fiziksel faktörlerin bağımlılığının bir grafiğidir.

veya zamana karşı PF'nin fizikokimyasal parametresi.

En yaygın olanları spektrofotometrik de-

optikte bir değişiklik kaydeden tectors (diyot matrisi dahil)

ultraviyole yoğunluğu, görünür ve genellikle yakın kızılötesi

190 ila 800 veya 900 nm arasındaki spektral bölgeler. Bu durumda kromatogram

çay, PF'nin optik yoğunluğunun zamana bağımlılığını temsil eder.

Geleneksel olarak kullanılan spektrofotometrik dedektör,

Çalışma aralığındaki herhangi bir dalga boyunda algılama yapabilir.

alan. Çoklu dalga boyu dedektörleri de kullanılır, bu da

aynı anda birkaç dalga boyunda algılama sağlamak için.

Bir diyot dizi dedektörü yardımıyla, sadece birkaç dalga boyunda bir kerede algılama yapmak değil, aynı zamanda pratik olarak anlık algılama yapmak da mümkündür.

FS'nin optik spektrumunu herhangi bir anda (taramadan) elde etmek için, bu da ayrılan bileşenlerin kalitatif analizini büyük ölçüde basitleştirir.

bileşenler.

Floresan dedektörlerin duyarlılığı, spektrofotometrik olanların duyarlılığından yaklaşık 1000 kat daha fazladır. Bu durumda, belirlenecek maddenin kendisi floresan yaymıyorsa, ya içsel floresan ya da karşılık gelen türevlerin floresansı kullanılır. Modern

floresan dedektörler sadece kromatografik elde etmeye izin vermez

gram, aynı zamanda analizin uyarma ve floresan spektrumlarını kaydetmek için

bağlantılar.

UV ve görünür spektral bölgelerde (örneğin karbonhidratlar) absorbe etmeyen numuneleri analiz etmek için refraktometrik dedektörler kullanılır.

(refraktometreler). Bu dedektörlerin dezavantajları, düşük (spektrofotometrik dedektörlere kıyasla) hassasiyetleri ve sinyal yoğunluğunun önemli bir sıcaklığa bağımlılığıdır (dedektör termostatlı olmalıdır).

Elektrokimyasal dedektörler de kullanılır (kondüktometrik

gökyüzü, amperometrik, vb.), kütle spektrometrik ve Fourier-IR

dedektörler, ışık saçılım dedektörleri, radyoaktivite ve diğer bazı

Mobil aşama

V PP olarak, hem bireysel hem de karışımları olmak üzere çeşitli çözücüler kullanılabilir.

V normal faz kromatografi genellikle sıvı karbon kullanır

levodorodlar (heksan, sikloheksan, heptan) ve diğer nispeten polar olmayan

küçük polar organik bileşikler ilaveli çözücüler,

PF'nin ayrıştırma gücünü düzenleyen.

Ters fazlı kromatografide, PF polar içerir

ganik çözücüler (genellikle asetonitril ve metanol) ve su. tercih için

ayırmalar genellikle belirli bir sulu çözeltiler kullanır

pH, özellikle tampon çözeltiler. Katkı maddeleri inorganik kullanılır

kimyasal ve organik asitler, bazlar ve tuzlar ve diğer bileşikler (için

örneğin, enantiyomerlerin akirallere ayrılması için kiral değiştiriciler

sorbent).

pH değerinin kontrolü, organik bir çözücü ile karışımı için değil, sulu bileşen için ayrı olarak yapılmalıdır.

PF, gerektiğinde genellikle iki olmak üzere bir çözücüden oluşabilir.

erişim - üç veya daha fazla. PP'nin bileşimi, içerdiği çözücülerin hacim oranı olarak belirtilir. Bazı durumlarda, kütle

özel olarak belirtilmesi gereken oran.

Bir UV spektrofotometrik dedektörü kullanırken, PF, algılama için seçilen dalga boyunda belirgin bir absorpsiyona sahip olmamalıdır. Belirlerken şeffaflık veya optik yoğunluk sınırı

belirli bir üreticinin çözücünün spesifik dalga boyu genellikle belirtilir

ambalaj üzerinde bulundu.

Kromatografik analiz, PF'nin saflık derecesinden büyük ölçüde etkilenir, bu nedenle üretilen solventlerin kullanılması tercih edilir.

özellikle sıvı kromatografisi için (su dahil).

PP ve analiz edilen çözeltiler çözünmeyen içermemelidir

parçacıklar ve gaz kabarcıkları. Laboratuvar koşullarında elde edilen su

Su ile önceden karıştırılmış sulu çözeltiler, organik çözeltiler

Aletler ve ayrıca analiz edilen solüsyonlar ince filtrasyona ve gazdan arındırmaya tabi tutulmalıdır. Filtreleme genellikle bu amaçlar için kullanılır.

verilen çözücü veya çözeltiye göre 0.45 µm inert gözenek boyutuna sahip bir membran filtreden vakum altında.

Veri toplama ve işleme sistemi

Modern veri işleme sistemi bir arayüzdür.

yüklü olan kromatografa bağlı kişisel bilgisayar

kaydetmenizi ve işlemenizi sağlayan yazılım

matogramın yanı sıra kromatografın çalışmasını kontrol etmek ve ana

kromatografik sistemin parametreleri.

Belirtilecek kromatografik koşulların listesi

Özel bir monografta, ortak

kolonlar, partikül boyutunun bir göstergesi olan sorbent tipi, kolon sıcaklığı (gerekirse, termostatlama), enjekte edilen numunenin hacmi (döngü hacmi),

PF'ye dönüşme ve hazırlanma yöntemi, PF besleme hızı, dedektör ve algılama koşulları, gradyan modunun tanımı (eğer kullanılıyorsa), kromatografi süresi.

İYON DEĞİŞİMİ VE İYONİK HPLC

İyon değişim kromatografisi hem organik hem de organik maddelerin analizi için kullanılır.

(heterosiklik bazlar, amino asitler, proteinler vb.) ve inor-

ganik (çeşitli katyonlar ve anyonlar) bileşikleri. bileşenlerin ayrılması

İyon değiştirme kromatografisinde analiz edilen karışımın içeriği, analiz edilen maddelerin iyonlarının iyonik gruplarla tersinir etkileşimine dayanır.

pami sorbenti. anyonitler veya katyon-

sen. Bu sorbentler esas olarak polimerik iyoniktir.

değişim reçineleri (genellikle aşılı stiren ve divinilbenzen kopolimerleri)

iyonik gruplar) veya aşılanmış iyon değişim grupları olan silika jeller. - (СН2) 3 N + X– gruplarına sahip sorbentler, anyonları ayırmak için kullanılır ve - (СН2) SO3 - Н + gruplarına sahip sorbentler katyonları ayırmak için kullanılır.

Genellikle polimer reçineleri anyonları ayırmak için kullanılır ve

katyonların sızması - modifiye silika jeller.

İyon değişim kromatografisinde PF olarak asitlerin, bazların ve tuzların sulu çözeltileri kullanılır. Tampon yarışlar yaygın olarak kullanılır.

belirli pH değerlerini korumanıza izin veren kremler. Küçük katkı maddeleri, suyla karışabilen organik maddeler kullanmak da mümkündür.

kimyasal çözücüler - asetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.

iyon kromatografisi- iyon değişim kromatografisinin bir çeşidi,

analitin iyonlarının konsantrasyonunu belirlemek için

kondüktometrik dedektör kullanır. Son derece hassas işlemler için

PF dedektöründen geçen iletkenlikteki değişikliklerin belirlenmesi, PF'nin arka plan iletkenliğinin düşük olması gerekir.

İyon kromatografisi için iki ana seçenek vardır.

Bunlardan ilki, elektrolizin elektriksel iletkenliğinin bastırılmasına dayanmaktadır.

arasında bulunan ikinci bir iyon değişim sütunu kullanarak PF

litik kolon ve dedektör. Bu sütunda nötralizasyon gerçekleşir.

PF ve analiz edilen bileşikler, deiyonik ortamda dedektör hücresine girer.

Su. Tespit edilen iyonlar tek iyonlardır.

PF iletkenliği sağlar. Bastırıcı kolonun dezavantajı, onu oldukça kısa aralıklarla yenileme ihtiyacıdır.

ben mi. Bastırıcı kolon, sürekli hareket eden bir kolon ile değiştirilebilir.

zarın bileşiminin sürekli olduğu bir zar baskılayıcı

yönde hareket eden rejenerasyon solüsyonunun akışı ile yenilenir,

PF akış yönünün tersi.

İyon kromatografisinin ikinci çeşidi, tek sütunlu iyon kromatografisidir.

matografi. Bu versiyonda çok düşük elektrik iletkenliğine sahip bir PF kullanılmaktadır.

su içeriği. Zayıf organik bileşikler elektrolit olarak yaygın olarak kullanılmaktadır.

skik asitler - benzoik, salisilik veya izoftalik.

ÖZEL HPLC

Boyut dışlama kromatografisi (boyut dışlama kromatografisi), moleküllerin boyutlarına göre ayrılmasına dayanan özel bir HPLC türüdür. Dağıtım

Sabit ve hareketli fazlar arasındaki moleküller, molekülün boyutuna bağlıdır.

leküller ve kısmen onların şekli ve polaritesi. Ayırma için bir

gözenekli emiciler - polimerler, silika jel, gözenekli camlar ve polisakaritler.

Sorbentlerin partikül boyutu 5-10 µm'dir.

Gözenekli camların ve silika jelin avantajları, PP ve analit moleküllerinin gözeneklere hızlı difüzyonu, çeşitli koşullar altında (yüksek sıcaklıklarda bile) stabilitedir. polimer sorben-

Siz stiren ve divinilbenzenin kopolimerlerisiniz (bunlar hidro-

polar olmayan mobil fazlar ile kullanılan fobik sorbentler) ve

sülfonatlı divinilbenzen veya poliakrilamid reçinelerinden yapılan hidrofilik jeller.

Gözenekli bir durağan faz ile moleküllerin iki sınırlayıcı etkileşimi mümkündür. Boyutu ortalama gözenek çapından a daha büyük olan moleküller, sorbent içine hiç girmez ve hareketli faz ile birlikte ayrıştırılır.

ilk sen. Sor- 'un gözenek boyutundan çok daha küçük bir çapa sahip moleküller

benta serbestçe içine nüfuz eder, en uzun süre sabit fazda kalır ve en son elute edilir. Orta büyüklükteki moleküller, boyuta ve kısmen de şekline bağlı olarak sorbentin gözeneklerine nüfuz eder. arasında farklı alıkonma süreleri ile elute edilirler.

en büyük ve en küçük moleküllerimiz. Kromatografiye tabi tutulan numunenin bileşenlerinin ayrılması, tekrarlanan ak-

numune bileşenlerinin emici maddenin gözeneklerine difüzyonu ve bunun tersi.

tutulmasını karakterize etmek için boyut dışlama kromatografisinde

PF akış hızı ve tutma süresinin ürününe eşit bir tutma hacmi kullanır.

Mobil aşama. PP seçimi sorbent tipine bağlıdır. Özel-

ny kromatografisi genellikle jel filtrasyonu ve jel filtrasyonu olarak ikiye ayrılır.

penetrasyon kromatografisi.

ayırmak için jel filtrasyon kromatografisi yöntemi kullanılır.

hidrofilik sorbentler üzerinde suda çözünür bileşiklerin Mobil fazlar, belirli bir pH değerine sahip sulu tampon çözeltilerdir.

Jel geçirgenlik kromatografisinde, hidrofobik sor-

kıvrımlar ve polar olmayan organik çözücüler (toluen, diklorometan, tet-

rahidrofuran). Bu yöntem, düşük çözünürlüğe sahip bileşikleri analiz etmek için kullanılır.

suda çember.

Dedektörler. Diferansiyel refraktometrik dedektörler ve ayrıca spektrofotometrik dedektörler (spektrumun kızılötesi bölgesindekiler dahil), boyut dışlama kromatografisinde dedektör olarak kullanılır.

Viskometrik ve akış lazer dedektörleri de kullanılır.

Bu dedektörler, bir refraktometre veya başka bir konsantrasyon ile birlikte

dedektör, molekül ağırlığını sürekli olarak belirlemenizi sağlar.

PF'de kireç.

ULTRA VERİMLİ SIVI KROMATOGRAFİSİ

Ultra performanslı sıvı kromatografisi, daha verimli olan sıvı kromatografisinin bir çeşididir.

klasik HPLC ile karşılaştırıldığında.

Ultra performanslı sıvı kromatografisinin bir özelliği,

1.5 ila 2 mikron partikül boyutuna sahip sorbentlerin kullanımı kullanılmaktadır. Boyutlar

matografik sütunlar genellikle 50 ila 150 mm uzunluğunda ve 1 ila

4 mm çapa kadar. Enjekte edilen numunenin hacmi 1 ila 50 µl arasında olabilir.

Klasikte kullanılan kromatografik ekipman

riante HPLC, genellikle bu tip kromatografi için özel olarak uyarlanmıştır

Ultra performanslı sıvı kromatografisi için tasarlanmış ekipman, HPLC'nin klasik versiyonunda da kullanılabilir.

Sıvı kromatografisi

Sıvı kromatografisi bir kromatografi türüdür. mobil aşama eluent olarak adlandırılan, sıvı. Durağan faz belki katı sorbent, yüzeyine sıvı uygulanmış katı taşıyıcı veya jel.

Ayırmak sütunlu ve ince tabaka sıvı kromatografisi. Kolon versiyonunda, ayrılacak maddelerin karışımının bir kısmı, basınç altında veya yerçekimi etkisi altında hareket eden bir eluent akışında sabit bir faz ile dolu bir kolondan geçirilir. İnce tabaka kromatografisinde, eluent kılcal kuvvetlerin etkisi altında bir cam levhaya veya metal folyoya uygulanan düz bir emici tabaka boyunca, gözenekli bir polimer film boyunca veya bir özel kromatografik kağıt şeridi boyunca hareket eder. Eluent, plakalar arasına sıkıştırılmış bir emici tabakadan pompalandığında, basınç altında ince tabakalı sıvı kromatografisi yöntemi de geliştirilmiştir.

Bu tür sıvı kromatografisi türleri vardır: analitik(madde karışımlarının analizi için) ve hazırlayıcı(saf bileşenleri izole etmek için).

Ayırmak sıvı kromatografisi (LC) klasik versiyonunda, gerçekleştirilen atmosferik basınç, ve yüksek hız) de gerçekleştirildi yüksek kan basıncı... Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), küçük partiküller (3-10 mikron) içeren bir sorbent ile sıkıca paketlenmiş, çapı 5 mm'ye kadar olan kolonlar kullanır. Eluenti kolondan pompalamak için 3.107 Pa'ya kadar bir basınç uygulayın. Bu tür kromatografi denir yüksek basınçlı kromatografi... Eluentin kolondan yüksek basınç altında geçirilmesi, analiz hızını önemli ölçüde artırmayı ve ince bir şekilde dağılmış bir sorbent kullanılması nedeniyle ayırma verimliliğini önemli ölçüde artırmayı mümkün kılar.

HPLC seçenekleri NS mikrokolon kromatografisi sorbent ile doldurulmuş küçük çaplı kolonlarda ve kılcal kromatografi içi boş ve sorbent dolu kılcal kolonlarda. HPLC yöntemi şu anda organik bileşiklerin karmaşık karışımlarını izole etmeyi, nicel ve nitel olarak analiz etmeyi mümkün kılmaktadır.

Sıvı kromatografi kimya, biyoloji, biyokimya, tıp ve biyoteknolojideki en önemli fizikokimyasal araştırma yöntemidir. İçin kullanılır:

· İlaçların canlı organizmalarında metabolik süreçlerin incelenmesi;

· Tıpta teşhis;

· Kimyasal ve petrokimyasal sentez, ara ürünler, boyalar, yakıtlar, yağlayıcılar, yağ, atık su ürünlerinin analizi;

· Çözeltiden sorpsiyon izotermlerinin incelenmesi, kimyasal süreçlerin kinetiği ve seçiciliği;

Deşarj

· Karışımların analizi ve ayrılması, amino asitler, proteinler, enzimler, virüsler, nükleik asitler, karbonhidratlar, lipidler, hormonlar gibi birçok biyolojik maddenin saflaştırılması ve onlardan izole edilmesi.

Makromoleküler bileşiklerin kimyasında ve polimerlerin üretiminde, monomerlerin kalitesi sıvı kromatografi kullanılarak analiz edilir, moleküler ağırlık dağılımı ve ürün kontrolü için gerekli olan oligomerlerin ve polimerlerin işlevsellik türlerine göre dağılımı incelenir.

Sıvı kromatografisi ayrıca parfümeride, gıda endüstrisinde, çevre kirliliğinin analizinde, adli bilimlerde kullanılmaktadır.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi, XX yüzyılın 70'lerinin ortalarında geliştirildi ve tanıtıldı. Sonra ilk sıvı kromatograflar ortaya çıktı.

Sıvı kromatografisi, kimyasal ve termal olarak kararsız moleküllerin, düşük uçuculuğa sahip yüksek moleküler maddelerin analizi için en uygun yöntemdir. Bu, gaz kromatografisinin aksine mobil fazın LC'deki özel rolü ile açıklanabilir: eluent sadece bir taşıma işlevi yerine getirmez.

2. Sıvı kromatografi yöntemlerinin temel kavramları ve sınıflandırılması.

Tarafından durağan faz tarafından ayrılmış maddelerin alıkonma mekanizması LC arasında ayrım yapın:

tortu kromatografisi

· adsorpsiyon kromatografisi , ile ayrılacak maddenin etkileşimi sonucunda ayırmanın gerçekleştirildiği adsorban alüminyum oksit veya silika jel gibi, yüzeyde olan aktif kutup merkezleri. çözücü(elüent) - polar olmayan sıvı.

Pirinç. Adsorpsiyon kromatografisi ile bir madde karışımının ayrılma şeması

http://www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

Sorpsiyon mekanizması, sorbentin polar yüzeyi ile analiz edilen bileşenin moleküllerinin polar (veya polarizasyon yapabilen) bölgeleri arasındaki özel bir etkileşimden oluşur (Şekil). Etkileşim, donör-alıcı etkileşimi veya hidrojen bağlarının oluşumu nedeniyle oluşur.

Pirinç. Adsorpsiyon sıvı kromatografi diyagramı

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "width =" 219 "height =" 200 ">

Pirinç. ... Aşılı faz bölüm kromatografisi (normal faz varyantı).

http://www. chemnet. ru / rus / öğretim / petrol / spezprakt-chr. html

NS normal faz Bölme sıvı kromatografisinin varyantında, nitril, amino grupları vb. gibi polar gruplar içeren ikameli alkilklorosilanlar silika jel yüzeyinin değiştiricileri olarak kullanılır (aşılı fazlar) (Şekil). Aşılı fazların kullanımı, sabit faz yüzeyinin sorpsiyon özelliklerini hassas bir şekilde kontrol etmeyi ve yüksek ayırma verimi elde etmeyi mümkün kılar.

Ters evre sıvı kromatografisi, sorbent yüzeyine aşılanmış polar eluent ve polar olmayan gruplar (uzun alkil zincirleri) arasındaki karışım bileşenlerinin dağılımına dayanır (Şek.). Daha az yaygın olarak, sabit bir desteğe sıvı sabit bir faz uygulandığında, desteklenen fazlara sahip bir sıvı kromatografisi çeşidi kullanılır.

Pirinç. ... Aşılı faz bölüm kromatografisi (ters faz versiyonu). http://www. chemnet. ru / rus / öğretim / petrol / spezprakt-chr. html

Bölme sıvı kromatografisi şunları içerir: ekstraksiyon sıvısı kromatografi burada sabit faz, katı bir taşıyıcı üzerinde biriken organik bir özütleyicidir ve hareketli faz, ayrılacak bileşiklerin sulu bir çözeltisidir. Ekstraktanlar olarak örneğin fenoller, trialkil fosfatlar, aminler, kuaterner amonyum bazları ve ayrıca kükürt içeren organofosfor bileşikleri kullanılır. Ekstraksiyon sıvı kromatografisi, kullanılmış nükleer yakıtın işlenmesinde alkali metal iyonları, aktinitler ve benzer özelliklere sahip diğer elementler gibi inorganik bileşikleri ayırmak ve konsantre etmek için kullanılır.

iyon değişim kromatografisi,

iyon değiştiriciler.

katyon değiştiriciler

anyonitler.

amfoterik iyon değiştiriciler

amfolitler

iyonit

katyon değiştirici

anyonitler

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (katyon değişimi)

R-OH + Na + + Cl - → R-Cl + Na + + OH - (anyon değişimi)

İyon değiştiriciler aşağıdaki gereksinimleri karşılamalıdır: çeşitli ortamlarda kimyasal olarak kararlı, kuru ve özellikle şişmiş durumda mekanik olarak güçlü, yüksek absorpsiyon kapasitesine ve iyi rejenerasyon yeteneğine sahip olmalıdır.

İyon değişim (iyon) kromatografisinde, ayrılmış anyonlar (katyonlar), yüksek performanslı kolonların küçük kapasiteli bir yüzey aktif iyon değiştirici ile doldurulduğu, yüksek hassasiyetli bir kondüktometrik dedektör ile asitler (karşılık gelen bazlar) olarak tespit edilir.

iyon çifti kromatografisi

ligand değişim kromatografisi

ayrılan bileşiklerin geçiş metali katyonları ile kompleksler oluşturma yeteneğinin farklı olması

boyut dışlama kromatografisi

moleküler boyuttaki farklılıklar

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" right "width =" 429 "height =" 319 ">

Pirinç. Jel Geçirgenlik Kromatografisi Şeması

Afinite kromatografisi

Pirinç. Afinite Kromatografisi Şeması

http://www. chemnet. ru / rus / öğretim / petrol / spezprakt-chr. html

Daha sonra, makromolekül için daha büyük bir afiniteye sahip bir bileşik çözeltisi geçirilerek polimerden çıkarılır. Bu tür kromatografi, enzimlerin, proteinlerin, hormonların izolasyonu için biyoteknoloji ve biyotıpta özellikle etkilidir.

Bağlı olarak maddenin taşındığı yolda aşağıdaki sıvı kromatografi seçenekleri ayırt edilir: etkileyici, önden ve yer değiştirme.
En sık kullanılan etkileyici ayrılacak karışımın bir kısmının, eluent akışında kolona dahil edildiği bir varyant. Kolondan karışım bileşenlerinin verimi, kromatograma pikler olarak kaydedilir. (pilav.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "width =" 291 "height =" 165 ">

Pirinç. Kromatografinin gelişen varyantının şeması

Boy uzunluğu veya tepe alanı karakterize eder bileşenlerin konsantrasyonu, a Kavradı birimler – karışımın kalitatif bileşimi... Bileşenler genellikle standart maddelerle alıkonma sürelerinin çakışmasıyla tanımlanır; kimyasal veya fizikokimyasal yöntemler de kullanılır.

NS önden Varyantta (Şekil), ayrılacak maddelerin bir karışımı, hareketli bir faz rolü oynayan kolondan sürekli olarak geçirilir. Sonuç olarak, yalnızca kolonda en az emilen madde saf halde elde edilebilir.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "width =" 279 "height =" 145 ">

Pirinç. Ön kromatografi şeması

Bu durumda kromatogram, yükseklikleri bileşenlerin konsantrasyonlarıyla orantılı olan adımları temsil eder; alıkonma hacimleri, bileşenlerin alıkonma süresi ile belirlenir. Böyle bir kromatogramı ayırt ederken, gelişmekte olan versiyonda elde edilene benzer bir resim elde edilir.

V yer değiştirme Bir varyantta, kolona verilen karışımın bileşenleri, herhangi bir bileşenden daha güçlü bir şekilde adsorbe edilen eluent tarafından değiştirilir. Sonuç olarak, ayrılacak maddelerin bitişik fraksiyonları elde edilir.Bileşenlerin salınma sırası, sorbent yüzeyi ile etkileşimlerinin kuvveti ile belirlenir (Şek.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "genişlik =" 320 "yükseklik =" 175 ">

Pirinç. Yer değiştirme kromatografisi şeması

3. Temel kromatografik büyüklükler ve tayini.

Maddeleri sıvı kromatografi kullanarak ayırırken, yukarıda belirtildiği gibi gelişen, önden ve yer değiştirme varyantları kullanılabilir. Çoğu zaman, ayrıştırılacak karışımın bir kısmının eluent akışında kolona verildiği bir geliştirme versiyonu kullanılır. Kolondan karışım bileşenlerinin verimi, kromatograma pikler olarak kaydedilir. Kromatogramdan (Şek.) Belirleyin:

emilemeyen (t0), ayrılmış bileşenlerin (tR1, tR2, tR3, vb.) alıkonma süreleri; tepelerin tabanının genişliği (tw1, tw2, vb.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "width =" 61 "height =" 24 src = ">;

B) düzeltilmiş bileşen tutma hacmi ,

nerede t "R - düzeltilmiş bileşen tutma süresi;

C) belirli bir bileşene sütun kapasite oranı ;

NS) kolon verimliliği ile karakterize edilen eşdeğer teorik plaka sayısı

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "width =" 129 "height =" 51 src = ">;

F) izin https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "genişlik =" 203 yükseklik = 51 "yükseklik =" 51 ">

kapasitans faktörü k " değeri üzerinde önemli bir etkisi vardır r S: değişimde k"0'dan 10'a (optimum limitler) r S güçlü bir şekilde artar. Anlam k " sorbentin iki katına çıkmış yüzeyi ve kolondaki miktarı ile adsorpsiyon denge sabiti (Henry sabiti) tarafından belirlenir.

Seçicilik katsayısı α iki ayrı bileşenin adsorpsiyon denge sabitlerindeki fark tarafından belirlenir. Artan α ile (1'den ~ 5'e kadar) r S keskin bir şekilde artar, α 'de daha fazla artış az değişir. Kolon seçiciliği, emici yüzeyin kimyasal yapısı, eluentin bileşimi, kolonun sıcaklığı ve ayrılacak bileşiklerin yapısı gibi faktörlere bağlıdır. Sıvı kromatografide kromatografiye tabi tutulan maddelerin sorpsiyonu, sistemin üç ana bileşeninin (sorbent, ayrılacak maddeler ve eluent) ikili etkileşimi ile belirlendiğinden, eluentin bileşimini değiştirmek, yıkama sıvısını optimize etmenin uygun bir yoludur. ayırma işlemi.

sütun verimliliği adsorbanın partikül boyutuna ve gözenek yapısına, kolonun tekdüzeliğine, eluentin viskozitesine ve kütle aktarım hızına bağlıdır. Kolon direnci arttığından, girişteki eluent basıncı ve deney süresi arttığından ve analiz edilen bileşenin tepe noktasının genişlemesi nedeniyle analizin hassasiyeti ve doğruluğu azaldığından, kolon uzatma her zaman daha iyi ayrılmaya yol açmaz. . Eğer öyleyse, kromatogramdaki iki maddenin tepe noktaları neredeyse tamamen ayrılır. büyüme ile r S ayırma süresi artar. NS r S < 1 - ayrılık tatmin edici değil. Hazırlayıcı kromatografide, nispeten büyük miktarlarda ayrılmış maddelerin girişi ile bağlantılı olarak, kolon aşırı yük ile çalıştırılır. Bu, kapasitans oranını azaltır, teorik plakaya eşdeğer yüksekliği arttırır, bu da çözünürlükte bir azalmaya yol açar.

4. Adsorbanlar

Adsorban ve solvent (eluent) doğru seçilirse karışımın kromatografik ayrımı etkili olacaktır.

Adsorban, ayrılan bileşenlerle kimyasal olarak etkileşime girmemeli, çözücü üzerinde katalitik bir etki göstermemelidir. Ayrıca, adsorbanın, karışımın bileşenleri açısından seçici olması da gereklidir. Düzgün seçilmiş bir kurutucu maksimum emiciliğe sahip olmalıdır.

Ayırmak polar (hidrofilik) ve polar olmayan (hidrofobik) adsorbanlar... Polar maddelerin polar sorbentler için adsorpsiyon afinitesinin polar olmayanlardan çok daha yüksek olduğu unutulmamalıdır.

Adsorban olarak alüminyum oksit, aktif karbonlar, silika jel, zeolitler, selüloz ve bazı mineraller kullanılmaktadır.

Alüminyum oksitAl2O3 – amfoterik adsorban(şek.) Üzerinde karışımlar ayrılabilir polar maddeler ve polar olmayan çözücülerde... Nötr alümina genellikle doymuş hidrokarbonlar, aldehitler, alkoller, fenoller, ketonlar ve eterlerin sulu olmayan çözeltilerinden kromatografi için kullanılır.

Pirinç. Kromatografi için alüminyum oksit

http://görüntüler. /542857_w200_h200_product5.jpg

Al2O3'ün aktivitesi nem içeriğine bağlıdır. Susuz alüminyum oksit en yüksek aktiviteye sahiptir. Geleneksel olarak bir birim olarak alınır. Gerekirse, taze hazırlanmış alüminayı suyla (Brockmann ölçeği) karıştırarak farklı nem içeriğine sahip alümina hazırlayabilirsiniz.

Alüminyum oksit aktivitesinin nem içeriğine bağımlılığı

Örneğin, hidrokarbonları ayırmak için 1.5-2 aktiviteye sahip Al2O3 kullanılır; alkollerin ve ketonların ayrılması için - 2-3.5.

Alüminyum oksitin spesifik yüzey alanı 230-380 m2/g.

Silika jeli(hidroksillenmiş veya kimyasal olarak modifiye edilmiş), silisik asitlerin aşırı doymuş çözeltilerinden elde edilen kurutulmuş jelatinimsi silikon dioksittir ( n SiO2 m H2O) pH> 5-6'da. (Şek.) Katı hidrofilik sorbent.

Pirinç. Silika jeli

http://www. silika jeli. /

http://silikajel. ru / resimler / askg. gif

Analitik kolonlarda silika jelin partikül boyutu 3-10 mikron, hazırlayıcı kolonlarda - 20-70 mikron. Küçük partikül boyutu, kütle aktarım hızını arttırır ve kolonun verimini arttırır. Modern analitik kolonlar 10-25 cm uzunluğundadır. Partikül boyutu 5 mikron olan silika jel ile doldurulur ve 20-30 bileşenden oluşan kompleks karışımların ayrılmasını sağlar. Partikül boyutu 3-5 mikrona düştükçe kolonun verimi artar ancak direnci de artar. 0.5-2.0 ml / dak'lık bir eluent akış hızı elde etmek için (1-3) · 107Pa'lık bir basınç gereklidir. Silika jel, böyle bir basınç düşüşüne dayanabilirken, polimer emici granüller daha elastik ve deforme olabilir. Son zamanlarda, etkinlikleri açısından silika jellere yakın, yoğun bir ağ ile makro gözenekli bir yapıya sahip mekanik olarak güçlü polimer sorbentler geliştirilmiştir. 10 µm ve üzeri boyuttaki sorbent partiküllerinin şekli, kolonun verimliliği üzerinde büyük bir etkiye sahip değildir, ancak daha geçirgen bir paketleme sağlayan küresel sorbentler tercih edilir (Şek.)

Pirinç. küresel silika jel

http://görüntüler. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Bir silika jel partikülünün iç yapısı, bir iletişim kanalları sistemidir. Sıvı kromatografisi için gözenek çapı 6-25 nm olan sorbentler kullanılır. Sıvı kromatografisinin ayrılması esas olarak alkil ve arilklorosilanların veya alkil etoksisilanların silanol yüzey gruplarıyla reaksiyonu ile modifiye edilmiş silika jeller üzerinde gerçekleştirilir. Bu tür reaksiyonların yardımıyla, C8H17-, C18H37- veya C6H5- grupları aşılanır (hidrofobikleştirilmiş bir yüzeye sahip sorbentler elde etmek için), nitril, hidroksil grupları vb. (Şek.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "width =" 166 "height =" 116 src = ">

Pirinç. Modifiye silika jel yapısı

silika jeller kromatografide kullanılan petrol ürünleri karışımlarının ayrılması için, daha yüksek yağ asitleri, bunların esterleri, aromatik aminler, nitro türevleri organik bileşikler. Silika jeli – hidrofilik sorbent, su ile kolayca ıslanır. Bu nedenle sulu çözeltilerden absorpsiyon için kullanılamaz. Silika jelin aktivitesi su içeriğine bağlıdır: ne kadar az su içerirse o kadar fazla aktivite (Brockmann ölçeği).

Silika jel aktivitesinin nem içeriğine bağımlılığı

Silika jellerin spesifik yüzey alanı 500-600 m2/g'dir.

aktif karbonlar işleme sırasında aşırı derecede gözenekli hale gelen ve adsorpsiyon veya kimyasal reaksiyonlar için çok geniş bir yüzey alanı elde eden bir karbon şeklidir.(Şekil) 1300-1700 m2/g özgül yüzey alanına sahiptirler.

Pirinç. Aktif karbon

http://e-katalog. rus biz. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

Aktif karbonların gözenek yapısı üzerindeki ana etki, üretimleri için başlangıç malzemeleri tarafından uygulanır. Hindistan cevizi kabuğuna dayalı aktif karbonlar, kömüre dayalı daha büyük bir mikro gözenek oranı (2 nm'ye kadar) ile karakterize edilir - daha büyük bir mezo gözenek oranı (2-50 nm). Makro gözeneklerin büyük bir kısmı, ahşap bazlı aktif karbonların (50 nm'den fazla) karakteristiğidir. Mikro gözenekler özellikle küçük moleküllerin adsorpsiyonu için çok uygundur ve mezogözenekler özellikle daha büyük organik moleküllerin adsorpsiyonu için çok uygundur.

Zeolitler (moleküler elekler)- doğal ve sentetik kökenli alkali ve toprak alkali metallerin gözenekli kristalli alüminosilikatları. (pilav.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "genişlik =" 211 yükseklik = 211 "yükseklik =" 211 ">

Pirinç. zeolitler

http://www. zeolit. spb. ru / _img / _36mm. jpg

http://kntgroup. ru / başparmak. php? dosya = / yüklemeler / ürünler / 6.jpg & x_width = 250

Farklı kristal yapılara sahip dört tip zeolit (A, X, Y, M) vardır. Katyona bağlı olarak zeolitler şu şekilde gösterilir: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Zeolitlerin özelliği bu mu kristallerin gözenekleri, moleküllerin boyutuyla orantılı olarak 0.4-1 nm mertebesinde boyutlara sahiptir. birçok sıvı veya gaz halindeki maddeler. Bir maddenin molekülleri bu gözeneklere nüfuz edebiliyorsa, zeolit kristallerinin gözeneklerinde adsorpsiyon meydana gelir. Bir maddenin daha büyük molekülleri adsorbe edilmez. Farklı gözenek boyutlarına sahip zeolitleri seçerek farklı maddelerin karışımlarını net bir şekilde ayırmak mümkündür.

Zeolitlerin spesifik yüzey alanı 750-800 m2/g'dir.

Bir adsorban seçerken, maddelerin yapısını ve çözünürlüklerini dikkate almak gerekir. Örneğin, doymuş hidrokarbonlar zayıf adsorbe olurken, doymamış hidrokarbonlar (çift bağa sahiptir) daha iyi adsorbe edilir. Fonksiyonel gruplar, bir maddenin adsorpsiyon kapasitesini arttırır.

5. Eluentler

Bir çözücü (eluent) seçerken, adsorbanın yapısını ve ayrılacak karışımdaki maddelerin özelliklerini dikkate almak gerekir. Eluentler, kromatografiye tabi tutulan karışımın tüm bileşenlerini iyi çözmeli, düşük viskoziteye sahip olmalı, gerekli seçicilik seviyesini sağlamalı, ucuz, toksik olmayan, inert olmalı ve tespit yöntemleriyle uyumlu olmalıdır (örneğin, benzen bir eluent olarak kullanılamaz. UV dedektörü).

Normal faz kromatografisi genellikle küçük miktarlarda kloroform CHCl3, izopropanol izo-C3H7OH, diizopropil eter ilavesiyle hidrokarbonları (heksan, heptan, izooktan, sikloheksan) kullanır; ters fazlı kromatografide - asetonitril CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioksan, tetrahidrofuran, dimetilformamid ile su karışımı. Kromatografi sırasında ayrılan karışımın tek tek bileşenlerini izole etmek için, bunlar genellikle sırayla yıkanır (elute edilir). Bu amaçla farklı desorpsiyon kapasitelerine sahip solventler kullanılmaktadır. Çözücüler, polar adsorbanlarda azalan desorpsiyon kapasitesi sırasına göre düzenlenir - eluotropik Trappe serisi... Ayrılacak karışımın bileşenleri yakın değerlere sahipse k "( belirli bir bileşene göre kolon kapasite oranı), ardından bir eluent ile kromatografik. Karışımın tek tek bileşenleri sorbent tarafından güçlü bir şekilde tutulursa, artan mukavemete sahip bir dizi eluent kullanılır.

Eluotropik solvent aralığı

6. Sıvı kromatografisi için donatım

Modern sıvı kromatografisinde, en basit sistemlerden yüksek sınıf kromatograflara kadar değişen derecelerde karmaşıklıktaki cihazlar kullanılır.
Modern bir sıvı kromatografı şunları içerir: eluentler için kaplar, yüksek basınçlı pompalar, bir dağıtıcı, bir kromatografik kolon, bir dedektör, bir kayıt cihazı, bir kontrol sistemi ve sonuçların matematiksel olarak işlenmesi.

İncirde. herhangi bir kromatografik sistemde mevcut olan, şu veya bu biçimde, gerekli minimum bileşen setini içeren bir sıvı kromatografının blok diyagramını sunar.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "width =" 361 "height =" 254 src = ">

Pirinç. Sıvı kromatograf diyagramı: 1- mobil faz için rezervuar, 2-pompa, 3-enjektör, 4-kolon, 5- termostat, 6- dedektörler, 7- kayıt sistemi, 8- bilgisayar.

Depolama tankı mobil faz için, analiz için yeterli kapasiteye sahip olmalı ve solvent gaz giderme cihazı kolonda ve dedektörde eluentte çözünmüş gaz kabarcıklarının oluşumunu engellemek için.

Pompa amaçlanan sabit bir solvent akışı oluşturmak için... Tasarımı öncelikle sistemdeki çalışma basıncı tarafından belirlenir. 10-500 MPa aralığında çalışması için pistonlu (şırınga) tip pompalar kullanılmaktadır. Dezavantajları, eluent ile doldurmak için periyodik olarak durma ihtiyacıdır. 1-5 MPa'lık düşük çalışma basınçlarına sahip basit sistemler için ucuz peristaltik pompalar kullanılır. Eluentler, toz parçacıklarını (0,2 mikrondan fazla) tutan bir filtreden pompaya girer. Bazen, çözünmüş havayı uzaklaştırmak ve dedektörde kabarcık oluşumunu önlemek için (özellikle sulu ve polar eluentler durumunda) eluentlerden küçük bir helyum akımı geçirilir. Analitik kromatograflarda, kolona eluenti beslemek için geri besleme sistemli pistonlu pompalar kullanılır, bu da akış nabzını %1-2 içinde düzeltmeyi mümkün kılar ve 0,1 ila 25 ml / dak'ya kadar olan basınçlarda hacimsel hızlar sağlar. ~ 3.107 Pa. Mikrokolon kromatografisinde, eluentin hacimsel akış hızları çok daha düşüktür - 10-1000 µl/dak. Gradyanlı elüsyon durumunda, bir programlayıcı tarafından kontrol edilen ve toplam akış hızını sabit bırakarak eluentin 2-3 bileşenini karıştırma odasına besleyen birkaç pompa kullanılır. Akışı durdurmadan yüksek basınç altında bir kolona bir numune enjekte etmek için, araştırılan çözelti numunesi için bilinen bir hacme sahip bir halkaya bağlı özel mikro dozlama muslukları kullanın. Mikrodoz valfleri veya şırıngalar kullanılarak otomatik numune alma ve numune enjeksiyonlu dozlama sistemleri geliştirilmiştir.

Enjektör sağlar karışım numunesi enjeksiyonu bileşenlerin yeterince yüksek tekrarlanabilirliğe sahip bir sütuna ayrılması. Basit akış durdurma örnekleme sistemleri bir pompa durdurma gerektirir ve bu nedenle Reodyne döngü dağıtıcılarından daha az uygundur.

Hoparlörler HPLC için genellikle 10-25 cm uzunluğunda ve 3-5 mm iç çapta cilalı paslanmaz çelik borudan yapılır.

Pirinç. Sıvı kromatografisi için kromatografi kolonları

Ayrıca kullan cam sütunlar metal bir kasaya yerleştirilmiş; mikrokolon kromatografisinde - baskılı metal sütunlar 1.0-1.5mm iç çapa sahip, baskılı cam mikro sütunlar 70-150 mikron çapında ve içi boş kılcal kolonlar 10-100 mikron çapında; hazırlayıcı kromatografide - 2 ila 10 cm ve daha fazla çapa sahip sütunlar. Kolonların sorbent ile düzgün ve yoğun doldurulması için bir süspansiyon paketleme yöntemi kullanılır. Süspansiyon, kolona 5 x 107 Pa'ya kadar bir basınç altında sağlanan bir sorbent ve uygun bir organik sıvıdan hazırlanır. Kolondan ayrılan ayrılmış bileşenleri belirlemek için kullanmak dedektörler. sıcaklık sabitliği tedarik edilen termostat.

dedektörler sıvı kromatografisi için, akan eluentin herhangi bir özelliğinin sürekli bir ölçümünün olduğu bir akış hücresine sahiptir. Çok hassas olmalılar. Dedektör hassasiyetini arttırmak için bazen kolondan sonra karışım bileşenlerinin türevlendirilmesi kullanılır. Bunu yapmak için, eluentin akışıyla, ayrılan maddelerle etkileşime girerek daha belirgin özelliklere sahip türevler oluşturan, örneğin, spektrumun UV veya görünür bölgesinde daha güçlü emen veya daha büyük olan türevler oluşturan bu tür reaktifler eklenir. floresan yeteneği. Bazen türevlendirme kromatografik analizden önce yapılır ve başlangıç malzemeleri yerine türevler ayrılır. En popüler türler dedektörler genel amaç refraktometrelerölçme kırılma indisi, ve spektrofotometrik dedektörler tanımlayan çözücünün optik yoğunluğu sabit bir dalga boyunda (genellikle ultraviyole bölgesinde). İLE refraktometrelerin avantajları(ve spektrofotometrelerin dezavantajları) atfedilmelidir tipine karşı düşük hassasiyet bağlantılar kromofor grupları içerebilir veya içermeyebilir. Öte yandan, refraktometrelerin kullanımı izokratik sistemlerle sınırlıdır (sabit bir eluent bileşimi ile), bu durumda bir çözücü gradyanının kullanılması mümkün değildir.

Diferansiyel "href =" / metin / kategori / diferansiyel / "rel =" yer imi "> diferansiyel yükseltici ve kaydedici. entegratör, ortaya çıkan tepe noktalarının göreli alanlarını hesaplamanıza izin verir. Karmaşık kromatografik sistemlerin kullanımı arayüz birimi kromatografın bağlanması kişisel bilgisayar yalnızca bilgilerin toplanmasını ve işlenmesini değil, aynı zamanda cihazı kontrol eden, kantitatif özellikleri ve bazı durumlarda karışımların kalitatif bileşimini hesaplayan . mikroişlemci sağlar otomatik numune enjeksiyonu, tarafından değiştir belirli bir eluent kompozisyon programı gradyan elüsyonu ile, sürdürmek kolon sıcaklığı.

Brükör ". Pirinç. sıvı kromatografi jasco

Kendi kendine test soruları

Sıvı Kromatografisi Nedir? Türlerini, uygulama alanlarını adlandırın. hakkında liste Ana kromatografik miktarlar ve bunların belirlenmesi Ayrılan maddelerin LC'nin durağan fazı tarafından tutulma mekanizmasına bağlı olarak ne tür sıvı kromatografisi mevcuttur? Maddenin taşınma şekline bağlı olarak ne tür kromatografi vardır? Adsorban olarak hangi maddeler kullanılır? Fark ne? Sıvı mobil faz olarak ne hizmet eder - bir eluent? Çözücüler için gereklilikler. Bölme kromatografisi ile adsorpsiyon kromatografisi arasındaki fark nedir? Sıvı kromatograf devresinin ana parçalarını, amaçlarını listeler.

kullanılmış literatür listesi

1 "Tıpta sıvı kromatografisi"

Http: // günlük. ıssep. rss. ru / makaleler / pdf / 0011_035.pdf

2 "Yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerine giriş"

Http: // www. chemnet. ru / rus / öğretim / petrol / spezprakt-chr. html

3 "Sıvı kromatografisi"

Http: // e-bilim. ru / dizin /? id = 1540

4 "Kromatografi"

Http: // belchem. narod. ru / kromatografi1.html

HPLC'de mobil fazlar olarak genellikle saf çözücüler veya bunların karışımları kullanılır.

Sıvı kromatografide eluent olarak adlandırılan bir saf çözücü (veya çözücü karışımları) akışı oluşturmak için kromatografın hidrolik sisteminde pompalar kullanılır.

HPLC için tipik olan yüksek basınçlarda paketlemeye ve kullanıma izin vermeyen yetersiz mekanik mukavemet;

silika jel, alüminyum oksit ile karşılaştırıldığında, daha geniş bir gözeneklilik, yüzey alanı ve gözenek çapı aralığına sahiptir; alüminyum oksidin önemli ölçüde daha yüksek katalitik aktivitesi, numune bileşenlerinin ayrışması veya bunların geri döndürülemez kimyasal soğurulması nedeniyle analiz sonuçlarının bozulmasına yol açar.

HPLC dedektörleri

Dedektörler:

Floresan dedektörü. Floresan dedektörlerin büyük popülaritesi, çok yüksek seçicilik ve hassasiyetten ve birçok çevresel kirleticinin floresan (örneğin, poliaromatik hidrokarbonlar) olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır.

elektrokimyasal dedektör kolayca oksitlenen veya indirgenen maddeleri tespit etmek için kullanılır: fenoller, merkaptanlar, aminler, aromatik nitro- ve halojen türevleri, keton aldehitler, benzidinler.

Dedektörler. Ayrı bir bileşenin sütunundan çıkışın kaydı, bir dedektör kullanılarak gerçekleştirilir. Kayıt için, mobil fazdan gelen ve karışım bileşeninin doğası ve miktarı ile ilişkili herhangi bir analitik sinyalde bir değişiklik kullanabilirsiniz. Sıvı kromatografisinde, çıkış çözeltisinin ışık absorpsiyonu veya ışık emisyonu (fotometrik ve florometrik dedektörler), kırılma indisi (refraktometrik dedektörler), potansiyel ve elektriksel iletkenlik (elektrokimyasal dedektörler) gibi analitik sinyaller kullanılır.

Tanıtım.

Son 10 yılda sıvı kromatografisinin hızlı gelişimi, temel olarak teorik temellerin yoğun gelişimi ve yüksek verimli versiyonunun pratik kullanımı ile gerekli sorbentlerin ve ekipmanın yaratılması ve endüstriyel üretiminden kaynaklanmaktadır.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisinin (HPLC) ayırt edici bir özelliği, çok yüksek ayırma verimliliği ile hızlı kütle transferi sağlayan 3-10 mikron tane boyutuna sahip sorbentlerin kullanılmasıdır.

Şu anda, HPLC, enstrümantal yöntemler arasında geliştirme oranları açısından gaz kromatografisini bile geride bırakarak en üst sıralarda yer almaktadır. HPLC'nin gaz kromatografisine göre en önemli avantajı, kaynama noktaları veya moleküler ağırlık gibi fizikokimyasal özelliklerinde herhangi bir kısıtlama olmaksızın hemen hemen her nesneyi inceleme yeteneğidir.

Günümüzde HPLC, bilim ve teknolojinin çeşitli alanlarında yaygın olarak kullanılan, iyi tanımlanmış bir araçsal yöntemdir. Biyokimya, moleküler biyoloji, çevre kirliliği kontrolü gibi kritik alanların yanı sıra kimya, petrokimya, gıda ve ilaç endüstrilerinde özellikle önemlidir.

çünkü tekniğin aşağıdaki özelliklerinden dolayı bir takım çok özel gereksinimlerin dikkate alınması gerekmektedir.

a. HPLC kolonları, çok küçük partikül çaplı ortamlarla paketlenir. Sonuç olarak, numunenin hızlı ayrılması için gerekli olan çözücünün hacimsel hızlarında kolon üzerinde yüksek basınç üretilir.

B. HPLC dedektörleri, eluent akışındaki ve basınçtaki (gürültü) dalgalanmalara karşı hassastır. Ayrıca, konsantrasyon detektörleri kullanıldığında, eluentin hacimsel hızının daha da yüksek bir kararlılığı gerekir.

v. Kromatografik ayırma işlemine bir dizi antagonistik etki eşlik eder, örneğin, örneğin mobil fazda numunenin dağılması, ayrılan bileşenlerin karıştırılmasına yol açar ve ayrıştırılan tepe noktasında (detektörde) maddenin maksimum konsantrasyonunu azaltır. Enjeksiyon noktasından dedektöre kadar sistemin tüm bölümlerinde dispersiyon gözlemlenir.

d. Mobil faz olarak hareket eden çözücüler genellikle ekipman için aşındırıcıdır. Bu öncelikle biyokimyasal HPLC uygulamalarında tercih edilen ters faz kromatografisinde kullanılan solventler için geçerlidir.

Enstrümantal bir teknik olarak HPLC'nin özgünlüğü, bu sistemlerin geliştirilmesi, yaratılması ve işletilmesinde dikkate alınmalıdır. Fiyat ve teknik özellikler arasında kabul edilebilir bir oranla çalışmak için yeterince güvenilir, basit ve güvenli olan kromatografik sistemlerin ve bileşenlerinin ticari örneklerini oluşturmak için on yıldan fazla araştırma ve araştırma yapıldı. Sütunlarda (hem uzunluk hem de çapta) azalmaya yönelik son eğilimler, aletler için yeni gereksinimleri zorlamaktadır.

1.1. YETERLİKVESEÇİCİLİK

Kromatografi, biri sabit diğeri hareketli iki "karışmayan faz arasındaki denge dağılımlarındaki farka dayalı olarak bir karışımın bileşenlerini ayırma yöntemidir. Numune bileşenler hareketli fazdayken kolon boyunca hareket eder ve Bileşenin sabit faz için afinitesi ne kadar büyük ve mobil faz için o kadar az olursa, kolon boyunca o kadar yavaş hareket eder ve içinde o kadar uzun süre kalır. Bileşenlerin afinitesindeki farklılıktan dolayı Karışımın sabit ve kabul edilebilir zaman periyodunda karışımın ayrı bantlara (tepe) kadar olan bileşenleri hareketli faz ile kolon boyunca hareket ederken.

Bu genel kavramlardan, kromatografik ayırmanın ancak numune enjeksiyonu sırasında kolona giren numune bileşenlerinin ilk olarak hareketli fazda çözünmesi ve ikinci olarak sabit faz ile etkileşime girmesi (tutması) halinde mümkün olduğu açıktır. . Numune enjeksiyonu sırasında bazı bileşenler çözelti halinde değilse, filtre edilecek ve kromatografik işleme katılmayacaktır. Aynı şekilde durağan faz ile etkileşime girmeyen bileşenler de bileşenlerine ayrılmadan hareketli fazlı kolondan geçecektir.

Bazı iki bileşenin hareketli fazda çözünür olması ve durağan faz ile etkileşime girmesi, yani kroiatografik sürecin bozulma olmadan devam edebilmesi koşulunu kabul edelim. Bu durumda, karışımın kolondan geçirilmesinden sonra, formun kromatogramları elde edilebilir. bir, b veya v(şekil 1.1). Bu kromatogramlar, verimlilik açısından farklılık gösteren kromatografik ayrımları gösterir. (a ve b) eşit seçicilik ve seçicilik ile (B ve v) eşit verimlilikle.

Kolon ne kadar verimli olursa, aynı alıkonma süresi ile elde edilen pik o kadar dar olur. Kolon verimliliği teorik plaka sayısı (PTT) ile ölçülür. n: daha yüksek ef-

Pirinç. 1.2. Kromatografik pikin parametreleri ve teorik plaka sayısının hesaplanması:

t R - zirvenin alıkonma süresi; H - tepe yüksekliği; Wj / j - yarım yükseklikte tepe genişliği

Pirinç. 1.1. Kolonun verimliliğine ve seçiciliğine bağlı olarak kromatogram tipi:

a- geleneksel seçicilik, azaltılmış verimlilik (daha az teorik plakalar); b - geleneksel seçicilik ve verimlilik; v - geleneksel verimlilik, artan seçicilik (bileşenlerin daha yüksek tutma süreleri oranı)

verimlilik, FTT ne kadar büyük olursa, başlangıçtaki dar bandın tepe noktasının kolondan geçerken genişlemesi ne kadar az olursa, kolondan çıkıştaki tepe noktası o kadar dar olur. PTT, hareketli ve sabit fazlar arasında dengeyi kurmak için aşama sayısını karakterize eder.

Kolon başına teorik plaka sayısını ve kolon uzunluğunu bilmek L (μm) ve ayrıca sorbentin ortalama tane çapı gün (μm), teorik plakaya (VETT) eşdeğer yükseklik değerlerinin yanı sıra teorik plakaya (PVETT) eşdeğer azaltılmış yükseklik değerlerini elde etmek kolaydır:

HETT = L/ n

PVETT = B3TT / dc.

PTT, HETT ve PVETT değerlerine sahip olarak, farklı yapı ve tane boyutundaki sorbentlerle doldurulmuş farklı tiplerde, farklı uzunluklarda kolonların verimliliği kolayca karşılaştırılabilir. Aynı uzunluktaki iki sütunun CTT'si karşılaştırılarak performans karşılaştırılır. HETT'yi karşılaştırırken, aynı tane boyutuna ve farklı uzunluklara sahip emici maddelere sahip kolonlar karşılaştırılır. Son olarak, PVETT değeri, herhangi iki kolonun, ilk olarak sorbentin kalitesini ve kolonları doldurma kalitesini ve ikinci olarak kolonların uzunluğundan bağımsız olarak sorbentin doğası gereği granülasyonunu değerlendirmesini mümkün kılar.

Kolon seçiciliği, kromatografik ayırmanın sağlanmasında önemli bir rol oynar.

Bir sütunun seçiciliği birçok faktöre bağlıdır ve deneycinin becerisi büyük ölçüde ayırma seçiciliğini etkileme yeteneği ile belirlenir. Bunun için kromatografın üç çok önemli faktörü vardır: sorbentin kimyasal doğasının seçimi, çözücünün ve değiştiricilerinin bileşiminin seçimi ve ayrılan bileşenlerin kimyasal yapısı ve özelliklerinin dikkate alınması. Bazen kolon sıcaklığındaki bir değişiklik, hareketli ve sabit fazlar arasındaki maddelerin dağılım katsayılarını değiştiren seçicilik üzerinde gözle görülür bir etkiye sahiptir.

Bir kromatogramda iki bileşenin ayrılması düşünülürken ve değerlendirilirken çözünürlük önemli bir parametredir. R s, her iki ayrı bileşenin çıkış sürelerini ve tepe genişliklerini birbirine bağlayan

Piklerin ayrılmasını karakterize eden bir parametre olarak çözünürlük, paydaki bir artışla yansıtılan seçicilikteki bir artışla ve zirvelerin genişliğindeki bir azalma nedeniyle paydadaki bir azalmaya yansıyan verimlilikteki bir artışla artar. Bu nedenle, sıvı kromatografisinin hızlı ilerlemesi "yüksek basınçlı sıvı kromatografisi" kavramında bir değişikliğe yol açtı - bunun yerini "yüksek çözünürlüklü sıvı kromatografisi" aldı (terimin İngilizce'deki kısaltılmış hali kalırken). HPLC modern sıvı kromatografisinin gelişim yönünü en doğru karakterize eden olarak).

Böylece, daha ince bir sorbent kullanıldığında, bileşimde daha üniform (dar fraksiyon), aşılanmış fazın daha ince tabakaları, daha az viskoz çözücüler ve optimum akış kullanılarak kolonda daha yoğun ve eşit şekilde paketlendiğinde kolondaki bulaşma azalır ve verimlilik artar. oranlar.

Ancak kolonda ayırma işlemi sırasında kromatografik bölge bandının bulanıklaşması ile birlikte numunenin giriş cihazında, bağlantı kapilerleri enjektör - kolon ve kolon - detektöründe, detektör hücresinde ve detektör hücresinde de bulanıklaşabilmektedir. bazı yardımcı cihazlar (enjektörden sonra kurulan numunelerden mekanik partikülleri yakalamak için mikrofiltreler, koruma kolonları, bobin reaktörleri vb.) - Tutma tepe hacmine kıyasla ekstra kolon hacmi ne kadar fazlaysa, bulaşma o kadar büyük olur. Ölü hacmin nerede olduğu da önemlidir: kromatografik çağrı ne kadar darsa, bulanıklık o kadar büyük ölü hacmi verir. Bu nedenle, kromatografik bölgenin en dar olduğu (enjektör ve enjektörden kolona kadar olan cihazlar) kromatografın o bölümünün tasarımına özel dikkat gösterilmelidir - burada ekstrakolon erozyonu en tehlikeli ve en güçlü etkiye sahiptir. İyi tasarlanmış kromatograflarda, ilave kolon dışı seyreltme kaynaklarının en aza indirilmesi gerektiğine inanılsa da, yine de her yeni cihaz, kromatografın her değişikliği mutlaka kolon üzerinde test yapılması ve elde edilen kromatogramın pasaport ile karşılaştırılması ile sonuçlanmalıdır. Pik distorsiyon, verimlilikte keskin bir düşüş gözlemlenirse, yeni tanıtılan kapilerler ve diğer cihazlar dikkatle incelenmelidir.

Kolon dışı yıkama ve yanlış hesaplama, özellikle yüksek hızlı HPLC, mikro kolon HPLC ve mikroenjektör gerektiren diğer modern HPLC seçenekleri için nispeten uzun vadeli kromatografların kullanılmaya çalışıldığı durumlarda önemli (%50'den fazla) verim kaybına yol açabilir. , iç çapı 0,05-0,15 mm minimum uzunlukta birbirine bağlı kapilerler, 10-1000 µl kapasiteli kolonlar, 0,03-1 µl kapasiteli mikro küvetli dedektörler ve yüksek hızlı, yüksek hızlı kaydediciler ve entegratörler.

1.2. SOLVENTİN TUTMA VE GÜCÜ

Analitlerin kolonda ayrılabilmesi için yukarıda belirtildiği gibi kapasite faktörü k" 0'dan büyük olmalıdır, yani maddeler sabit faz olan sorbent tarafından tutulmalıdır. Ancak kabul edilebilir bir elüsyon süresi elde etmek için kapasitans faktörü çok yüksek olmamalıdır. Belirli bir madde karışımı için onları tutan sabit bir faz seçilirse, o zaman analitik bir yöntemin geliştirilmesi üzerinde daha fazla çalışma, ideal durumda tüm bileşenler için farklı, ancak kabul edilebilir şekilde çok fazla olmayan bir çözücünün seçilmesinden oluşur. büyük k". Bu, çözücünün ayrıştırma kuvveti değiştirilerek elde edilir.

Silika jel veya alümina üzerinde adsorpsiyon kromatografisi durumunda, bir kural olarak, iki bileşenli çözücünün (örneğin, izopropanol ilavesiyle heksan) gücü, polar bileşenin (izopropanol) içeriği artırılarak arttırılır veya izopropanol içeriğini azaltarak azalmıştır. İçeren polar bileşen çok küçük hale gelirse (%0,1'den az), ayrıştırma gücünde daha zayıf olanla değiştirilmelidir. Aynısı, polar veya polar olmayan bileşeni diğerleriyle değiştirerek ve verilen sistemin ilgili karışım bileşenlerine göre istenen seçiciliği sağlamaması durumunda yapılır. Çözücü sistemleri seçilirken, hem karışım bileşenlerinin çözünürlüğü hem de farklı yazarlar tarafından derlenen eluotropik çözücü serileri dikkate alınır.

Yaklaşık olarak aynı şekilde, aşılı polar fazlar (nitril, amino, diol, nitro vb.) kullanılması durumunda, olası kimyasal reaksiyonlar dikkate alınarak ve faz için tehlikeli çözücüler hariç tutularak çözücünün gücü seçilir ( örneğin, amino faz için ketonlar).

Ters faz kromatografisi durumunda, çözücüdeki organik bileşen (metanol, asetonitril veya THF) içeriği artırılarak çözücünün gücü arttırılır ve daha fazla su ilave edilerek azaltılır. İstenilen seçiciliği elde etmek mümkün değilse, farklı bir organik bileşen kullanın veya farklı katkı maddeleri (asitler, iyon çifti reaktifleri vb.) kullanarak değiştirmeyi deneyin.

İyon değiştirme kromatografisi ile ayırmalarda, çözücünün gücü, tampon çözeltisinin konsantrasyonu artırılarak veya azaltılarak veya pH değiştirilerek değiştirilir; bazı durumlarda organik maddelerle modifikasyon kullanılır.

Bununla birlikte, özellikle karmaşık doğal ve biyolojik karışımlar söz konusu olduğunda, çözücünün kuvvetini, numunenin tüm bileşenlerinin makul bir süre içinde ayrıştırılacağı şekilde seçmek çoğu zaman mümkün değildir. Ardından, gradyanlı elüsyona başvurmak, yani, önceden belirlenmiş bir programa göre sürekli olarak artacak şekilde, analiz sırasında elüsyon kuvveti değişen bir çözücü kullanmak gerekir. Bu teknik, karmaşık karışımların tüm bileşenlerinin nispeten kısa bir süre içinde ayrıştırılmasını ve bunların dar pikler şeklinde bileşenlere ayrılmasını mümkün kılar.

1.3. SORBENT PARÇACIKLARIN BOYUTU, GEÇİRİLİRLİK VE VERİMLİLİK

Kolon bulaşması düşünüldüğünde, kolon veriminin (HETP) sorbentin partikül boyutuna bağlı olduğunu belirttik. Büyük ölçüde, HPLC'nin son 10-12 yıldaki hızlı gelişimine, ilk olarak, 3 ila 10 μm partikül boyutuna ve dar bir fraksiyonel bileşime sahip sorbentlerin elde edilmesi için yöntemlerin geliştirilmesi, yüksek verim sağlayan, iyi geçirgenlik ve ikinci olarak, kolonları bu sorbentlerle doldurma yöntemlerinin geliştirilmesi ve üçüncü olarak, yüksek basınçlı pompalar, enjektörler ve küçük hacimli küvetlere sahip küçük hacimli küvetlere sahip dedektörler içeren sıvı kromatografların geliştirilmesi ve seri üretimi. hacim zirveleri

İyi paketlenmiş bulamaç kolonları için teorik plaka eşdeğer yüksekliği (PVETT), paketleme için 3, 5, 10 veya 20 µm partiküllerin kullanılmasına bakılmaksızın 2 olabilir. Bu durumda sırasıyla 41670, 25000, 12500 ve 6250 tt verimliliğe sahip kolonlar (standart uzunluk 250 mm) elde edeceğiz. 3 µm partiküllerle dolu en verimli kolonu seçmek doğal görünmektedir. Bununla birlikte, mevcut bir pompanın solventi bu tür bir kolondan yüksek bir uzay hızında pompalayabilmesi muhtemel olduğundan, bu verimlilik çok yüksek basınçlar ve nispeten düşük ayırma oranları pahasına gelecektir. Burada, emici parçacıkların boyutu, kolonların verimliliği ve geçirgenliği arasındaki ilişki sorusuyla karşı karşıyayız.

Bundan sütun direnç faktörünü - boyutsuz bir niceliği ifade edersek, aşağıdaki denklemi elde ederiz:

Aynı yöntem kullanılarak aynı tip mikropartiküllerle doldurulmuş kolonlar için direnç faktörü önemsiz bir şekilde değişir ve aşağıdaki değerlere karşılık gelir:

Parçacık tipi ".... Düzensiz Küresel

form formu

Kuru ambalaj. ... ... ... ... 1000-2000 800-1200

Süspansiyon ambalajı. ... ... 700-1500 500-700

Kolon giriş basıncı, lineer akış hızı, kolon direnç faktörü, solvent viskozitesi ve kolon uzunluğu ile orantılıdır ve partikül çapının karesi ile ters orantılıdır.

Bu bağımlılığı 3, 5, 10 ve 20 µm çapında partiküllere sahip yukarıdaki kolonlar için uygulayarak ve sabit lineer akış hızı, kolon direnç faktörü ve solvent viskozitesi varsayılarak, eşit uzunluktaki kolonlar için giriş basıncı oranını 44:16 elde ederiz: 4:1. Bu nedenle, çözücü sistemleri metanol kullanıldığında 10 mikron partikül boyutuna sahip ters fazlı bir sorbent için ise -. su (70:30), genellikle standart bir kolonda 1 ml / dak çözücü akış hızında, kolona girişteki basınç 5 MPa, daha sonra 5 μm partiküller için - 20 MPa ve 3 μm - 55 MPa için . Silika jel ve daha az viskoz bir solvent sistemi heksan - izopropanol (100: 2) kullanıldığında, değerler önemli ölçüde daha düşük olacaktır: sırasıyla 1, 4 ve 11 MPa. Ters fazlı bir sorbent durumunda, 3 μm boyutunda parçacıkların kullanımı çok sorunluysa ve 5 μm mümkünse, ancak tüm cihazlarda değilse, normal fazlı bir sorbent için herhangi bir sorun yoktur. baskı yapmak. Modern yüksek hızlı HPLC'nin, yukarıdaki örneğe göre daha yüksek solvent tüketimi kullanımı ile karakterize edildiğine ve dolayısıyla basınç gereksinimlerinin daha da arttığına dikkat edilmelidir.

Bununla birlikte, ayırmanın belirli sayıda teorik plaka gerektirdiği ve yüksek hızlı bir analizin yapılmasının istendiği durumlarda, resim biraz değişir. Tane boyutu 3, 5, 10 mikron olan ve eşit verimliliğe sahip sorbentli kolonların uzunlukları sırasıyla 7,5 olacağından; 12.5 ve 25 cm, daha sonra kolonlara girişteki basınç oranı 3: 2: 1 olarak değişecektir. Buna göre, bu tür eşit verimliliğe sahip sütunlardaki analiz süresi, 0,3: 0,5: 1 olarak ilişkilendirilecektir, yani, 10'dan 5'e ve 3 μm'ye giderken, analiz süresi 2 ve 3,3 kat azalacaktır. Analizin bu hızlandırılması, orantılı olarak daha yüksek kolon giriş basıncı pahasına gelir.

Sunulan veriler, farklı tane boyutundaki sorbentlerin aynı parçacık boyutu dağılım eğrilerine sahip olduğu, kolonların aynı şekilde paketlendiği ve aynı kolon direnç faktörüne sahip olduğu durumlar için geçerlidir. Sorbentin dar fraksiyonlarını elde etmenin zorluğunun azalan parçacık boyutu ile arttığı akılda tutulmalıdır. farklı üreticilerin kesirleri farklı bir kesirli bileşime sahiptir. Bu nedenle, kolon direnç faktörü tane boyutuna, sorbent tipine, kolon paketleme yöntemine vb. bağlı olarak değişecektir.

AYIRMA MEKANİZMASI İLE HPLC YÖNTEMLERİNİN SINIFLANDIRILMASI

HPLC yöntemiyle gerçekleştirilen ayırmaların çoğu, bileşenlerin kolonda az ya da çok tutulmasını sağlayan bir sorbent ile maddelerin karışık bir etkileşim mekanizmasına dayanır. Az ya da çok saf formdaki ayırma mekanizmaları pratikte oldukça nadirdir, örneğin aromatik hidrokarbonları ayırmak için kesinlikle susuz silika jel ve susuz heksan kullanıldığında adsorpsiyon mekanizmaları.

Farklı yapılara ve moleküler ağırlıklara sahip maddeler için karma bir tutma mekanizmasıyla, adsorpsiyon, dağıtım, dışlama ve diğer mekanizmaların tutulmasına katkısını tahmin etmek mümkündür. Bununla birlikte, HPLC'deki ayırma mekanizmalarını daha iyi anlamak ve anlamak için, bir mekanizmanın veya diğerinin baskın olduğu ayırmaların, örneğin iyon değiştirme kromatografisi gibi belirli bir kromatografi tipine ait olduğu düşünülmesi tavsiye edilir.

2.1.1 ADSORPSİYON KROMATOGRAFİSİ

Adsorpsiyon kromatografisi ile ayırma, bir maddenin yüzeyde aktif merkezleri olan silika jel veya alümina gibi adsorbanlarla etkileşiminin bir sonucu olarak gerçekleştirilir. Farklı numune moleküllerinin adsorpsiyon merkezleriyle etkileşime girme yeteneğindeki fark, kolon boyunca hareketli faz ile hareket sırasında bölgelere ayrılmalarına yol açar. Bu durumda elde edilen bileşenlerin bölgelerinin ayrılması, hem çözücü hem de adsorban ile etkileşime bağlıdır.

Hidroksil grupları ile bir adsorbanın yüzeyindeki absorpsiyon, adsorbanın polar yüzeyi ile polar (veya polarize olabilen) gruplar veya molekül bölgeleri arasındaki spesifik etkileşime dayanır. Bu etkileşimler, kalıcı veya indüklenmiş dipoller arasındaki dipol-dipol etkileşimini, n-komplekslerinin veya yük transfer komplekslerinin oluşumuna kadar bir hidrojen bağı oluşumunu içerir. Pratik çalışmada olası ve oldukça sık görülen bir durum, alıkonma süresinde önemli bir artışa, verimlilikte keskin bir düşüşe, ayrışma ürünlerinin ortaya çıkmasına veya bir maddenin geri döndürülemez şekilde emilmesine yol açabilen kemo-sorpsiyonun tezahürüdür.

Maddelerin adsorpsiyon izotermleri doğrusal, dışbükey veya içbükey bir şekle sahiptir. Doğrusal bir adsorpsiyon izoterminde, maddenin tepe noktası simetriktir ve alıkonma süresi numune boyutuna bağlı değildir. Çoğu zaman, maddelerin adsorpsiyon izotermleri doğrusal değildir ve dışbükey bir şekle sahiptir, bu da bir kuyruk oluşumu ile tepenin bazı asimetrisine yol açar.

Farklı gözenek hacimlerine, yüzeylerine ve gözenek çaplarına sahip silika jel adsorbanları, HPLC'de en yaygın şekilde kullanılır. Alümina çok daha az sıklıkla kullanılır ve çok nadiren klasik kolon ve ince tabaka kromatografisinde yaygın olarak kullanılan diğer adsorbanlar kullanılır. Bunun ana nedeni, diğer adsorbanların çoğunun, yüksek basınçlı kurutucular için tipik olan yüksek basınçlarda paketlenmelerine ve kullanılmalarına izin vermeyen yetersiz mekanik mukavemetidir.

Adsorpsiyondan sorumlu olan ve silika jel ve alüminyum oksit yüzeyinde bulunan polar gruplar, özellikler bakımından benzerdir. Bu nedenle, madde karışımlarının elüsyon sırası ve çözücülerin eluotropik aralığı onlar için genellikle aynıdır. Bununla birlikte, silika jel ve alüminanın kimyasal yapısındaki farklılık bazen seçicilikte farklılıklara yol açar; bu durumda, belirli bir görev için daha uygun olan bir veya başka bir adsorban tercih edilir. Örneğin, alümina, belirli polinükleer aromatik hidrokarbonların ayrılmasında daha fazla seçicilik sağlar.

Genellikle alümina yerine silika jele verilen tercih, gözeneklilik, yüzey ve gözenek çapı açısından daha geniş bir silika jel seçiminin yanı sıra alüminanın çok daha yüksek katalitik aktivitesi ile açıklanır, bu da genellikle aşağıdakilerden dolayı analiz sonuçlarının bozulmasına yol açar. numune bileşenlerinin ayrışması veya bunların geri döndürülemez kemisorpsiyonu. ...

2.1.2 Adsorpsiyon kromatografisinin kullanımını sınırlayan dezavantajları

Adsorpsiyon kromatografisinin popülaritesi, HPLC yönteminin gelişmesiyle kademeli olarak azaldı, giderek daha fazla değiştirildi ve aşılı fazlı sorbentler üzerinde ters fazlı ve normal fazlı HPLC gibi diğer seçeneklerle değiştirilmeye devam ediyor. Adsorpsiyon kromatografisinin buna yol açan dezavantajları nelerdir?

Her şeyden önce, bu, adsorbanların eser miktarlarda su içeren çözücülerle dengelenmesi işlemlerinin uzun sürmesi, belirli ve tekrarlanabilir bir nem içeriğine sahip bu tür çözücüleri hazırlamanın zorluğudur. Bu, tutma parametrelerinin, çözünürlüğün, seçiciliğin zayıf tekrarlanabilirliği ile sonuçlanır. Aynı nedenden dolayı, gradyan elüsyonu kullanmak mümkün değildir - başlangıç durumuna dönüş o kadar uzundur ki, gradyan kullanımından kaynaklanan zaman kazancından önemli ölçüde daha ağır basar.

Adsorbanların, özellikle alüminyum oksitin, katalize duyarlı bileşiklerin sık sık yeniden düzenlenmesi, bunların ayrışması, geri döndürülemez sorpsiyon ile bağlantılı önemli dezavantajları da iyi bilinmektedir ve literatürde defalarca belirtilmiştir. Kolonun ilk bölümünde biriken geri dönüşü olmayan bir şekilde emilen maddeler, sorbentin yapısını değiştirir, kolonun direncinde bir artışa ve hatta tamamen tıkanmasına neden olabilir. Son dezavantaj, bir koruma sütunu kullanılarak ortadan kaldırılabilir. üzerinde- Direnç arttıkça ve tıkanma meydana geldiğinde, yenisiyle değiştirilir * veya yeni bir sorbent ile doldurulur. Bununla birlikte, bu durumda da meydana gelen tersinmez sorpsiyon, sorpsiyona veya katalitik bozunmaya duyarlı numune bileşenlerinin tamamen veya kısmen bulunmadığı bir kromatogram ile sonuçlanır.

2.2. DAĞILIM KROMATOGRAFİSİ

Bölme kromatografisi, bir karışımın bileşenlere ayrılmasının, karışmayan iki faz arasındaki dağılım katsayılarındaki farktan dolayı gerçekleştirildiği bir HPLC çeşididir: bir çözücü (hareketli faz) ve bir sorbent üzerindeki bir faz (sabit faz). Tarihsel olarak, ilki, gaz-sıvı kromatografisi (GLC) için sorbentlerin hazırlanma ve hazırlanma şekline benzer şekilde, sıvı fazların (oksidipropionitril, parafin yağı, vb.) gözenekli taşıyıcılar üzerinde biriktirilmesiyle elde edilen bu tip sorbentlerdi. Bununla birlikte, ana fazın taşıyıcıdan nispeten hızlı bir şekilde yıkanması olan bu tür sorbentlerin dezavantajları hemen keşfedildi. Buna bağlı olarak kolondaki faz miktarı giderek azalmış, alıkonma süreleri de azalmış ve kolonun ilk bölümünde fazın kapsamadığı adsorpsiyon merkezleri belirerek tepe kuyruklarının oluşmasına neden olmuştur. Bu dezavantaj, çözücünün kolona girmeden önce çöken faz ile doyurulmasıyla giderildi. Daha viskoz ve daha az çözünür polimer fazları kullanıldığında, taşıma da azaldı, ancak bu durumda kalın polimer filmlerden difüzyon nedeniyle kolonların verimliliği önemli ölçüde azaldı.

Sıvı fazı taşıyıcıya kimyasal bağlarla, sürüklenmesi fiziksel olarak imkansız hale gelecek şekilde, yani taşıyıcıyı ve fazı bir bütün haline - sözde aşı fazına dönüştürecek şekilde aşılamanın mantıklı olduğu ortaya çıktı. sorbent.

Gelecekte, araştırmacıların çabaları, aşılama oldukça hızlı ve eksiksiz bir şekilde devam edecek olan reaktifleri aramaya yönlendirildi ve oluşan bağlar mümkün olduğunca stabildi. Alkilklorosilanlar ve türevleri, benzer bir teknoloji kullanılarak yüzey üzerinde farklı tiplerde ve farklı hem polar hem de polar olmayan gruplara sahip aşı fazlı sorbentlerin elde edilmesini mümkün kılan reaktifler haline geldi.

HPLC için ikinci tip sorbentlerin başarılı kullanımı, çeşitli üreticiler tarafından üretimlerinin büyümesini teşvik etti. Her şirket bu tür sorbentleri, kural olarak, kendi silika jel tipi temelinde ve genellikle üretimin "know-how"ını oluşturan kendi teknolojisine göre üretti. Sonuç olarak, kimyasal olarak tamamen aynı olarak adlandırılan çok sayıda sorbent (örneğin, aşılanmış oktadesilsilanlı silika jel) çok farklı kromatografik özelliklere sahiptir. Bunun nedeni silika jelin daha geniş veya daha dar gözeneklere sahip olabilmesi, farklı yüzey, gözeneklilik, aşılamadan önceki yüzeyinin hidroksile edilip edilmemesi, mono-, di- veya triklorosilan aşılanabilmesi, aşılama koşullarının monomerik, polimerik veya karışık faz katmanı, kalıntı reaktiflerin çıkarılması için farklı yöntemler kullanılır, silanol ve diğer aktif grupların ek deaktivasyonu kullanılabilir veya kullanılmayabilir.

Reaktifleri aşılama teknolojisinin ve hammadde ve malzemelerin hazırlanmasının karmaşıklığı, çok aşamalı doğası, aynı üretim şirketinden aynı teknoloji kullanılarak elde edilen sorbent partilerinin bile biraz farklı kromatografik özelliklere sahip olabileceği gerçeğine yol açmaktadır. Bu, özellikle, bu tür sorbentler, işlevsellik açısından, işlevsel grupların sayısı ve konumu açısından önemli ölçüde farklılık gösteren maddeler içeren çok bileşenli karışımların analizi için kullanıldığında geçerlidir.

Yukarıdakileri göz önünde bulundurarak, literatürde açıklanan analiz yöntemini kullanırken her zaman * tamamen aynı sorbent ve aynı çalışma koşullarını kullanmaya çalışmalısınız. Bu durumda, eserin yeniden üretilememesi olasılığı minimumdur. Bu mümkün değilse, ancak benzer aşılanmış faza sahip başka bir şirketten bir sorbent alınırsa, tekniği değiştirmenin uzun zaman alacağı gerçeğine hazırlıklı olmanız gerekir. Aynı zamanda, uzun vadeli geliştirmeden sonra bile bu sorbent üzerinde gerekli ayırmanın sağlanamaması olasılığı vardır (ve dikkate alınmalıdır). Literatürde, uzun süredir üretilen eski sorbentler üzerinde tarif edilen birçok ayırma tekniğinin varlığı, bu nedenle daha fazla üretim ve kullanımlarını teşvik eder. Ancak, özellikle bozunmaya, kimyasal soğuruma, yeniden düzenlenmeye meyilli maddelerle ilgili olarak orijinal yöntemlerin geliştirilmesine devam edilmesinin gerekli olduğu durumlarda, yakın zamanda geliştirilmiş ve yeni kullanılarak üretilmiş sorbentler üzerinde çalışmaya başlanması tavsiye edilir, gelişmiş teknoloji seçenekleri. Yeni sorbentler daha muntazam bir fraksiyonel bileşime, aşılanmış faz ile yüzeyin daha muntazam ve tam bir kaplamasına ve sorbent işlemenin daha mükemmel son aşamalarına sahiptir.

2.3. İYON DEĞİŞİM KROMATOGRAFİSİ

İyon değiştirme kromatografisinde, iyonlaşabilen maddelerin sorbentin iyonik gruplarıyla tersinir etkileşimi nedeniyle karışım bileşenlerinin ayrılması sağlanır. Sorbentin elektronötralitesinin korunması, yüzeyin hemen yakınında bulunan iyon değişimi yapabilen karşı iyonların mevcudiyeti ile sağlanır. Sorbentin sabit bir yükü ile etkileşime giren sokulan numunenin iyonu, bir karşı iyon ile değişir. Sabit yüklere "farklı afiniteye sahip maddeler, anyonitler veya katyonitler üzerinde ayrılır. Anyonitler, yüzeyde pozitif yüklü gruplara sahiptir ve mobil fazdan anyonları emer. Katyonlar, sırasıyla, katyonlarla etkileşime giren negatif yüklü gruplar içerir.

Mobil faz olarak, sıvı amonyak gibi asitlerin, bazların ve çözücülerin tuzlarının sulu çözeltileri, yani yüksek dielektrik sabiti e ve bileşikleri iyonize etme eğilimi büyük olan çözücü sistemleri kullanılır. pH değerinin ayarlanmasına izin verin.

Kromatografik ayırmada, analitin iyonları, eluentte bulunan iyonlarla rekabet ederek, sorbentin zıt yüklü gruplarıyla etkileşime girmeye çalışır. İyon değiştirme kromatografisinin, herhangi bir şekilde iyonize olabilen herhangi bir bileşiği ayırmak için kullanılabileceği izler. Borat iyonu ile kompleksleri şeklinde nötr şeker moleküllerini bile analiz etmek mümkündür:

Şeker + VO 3 2 - = Şeker -VO 3 2 -.

İyon değişim kromatografisi, GLC tarafından türevlere dönüştürülmeden analiz edilemeyen yüksek polar maddelerin ayrılması için vazgeçilmezdir. Bu tür bileşikler arasında amino asitler, peptitler, şekerler bulunur.

İyon değişim kromatografisi tıpta, biyolojide, biyokimyada, çevre kontrolü için, kan ve idrardaki ilaç ve metabolitlerinin, gıda hammaddelerindeki pestisitlerin içeriğinin analizinde ve ayrıca inorganik bileşiklerin ayrılması için yaygın olarak kullanılmaktadır. radyoizotoplar, lantanitler, aktinitler vb. Genellikle saatler veya günler süren biyopolimerlerin (proteinler, nükleik asitler vb.) analizi, iyon değişim kromatografisi kullanılarak 20-40 dakikada daha iyi ayrılma ile gerçekleştirilir. Biyolojide iyon değişim kromatografisinin kullanılması, örneklerin biyolojik ortamda doğrudan gözlemlenmesini mümkün kıldı ve nihai sonucun yanlış yorumlanmasına yol açabilecek yeniden düzenleme veya izomerizasyon olasılığını azalttı. Biyolojik sıvılardaki değişiklikleri kontrol etmek için bu yöntemi kullanmak ilginçtir. Silika jele dayalı gözenekli zayıf anyon değiştiricilerin kullanılması, peptitlerin ayrılmasını mümkün kılmıştır. V

İyon değiştirme mekanizması aşağıdaki denklemler şeklinde temsil edilebilir:

anyon değişimi için

X- + R + Y- H ->■ Y- + R + X-.

katyon değişimi için |

X + + R-Y + h = * Y ++ R-X +.

İlk durumda, X ~ numunesinin iyonu, iyon değiştiricinin iyonik merkezleri R + için mobil faz Y ~ iyonu ile rekabet eder ve ikincisinde, X + numunesinin katyonları ile rekabete girer. R ~ iyonik merkezleri için mobil faz Y + iyonları.

Doğal olarak, bu rekabet ile iyon değiştirici ile zayıf bir şekilde etkileşime giren numunenin iyonları, kolonda zayıf bir şekilde tutulacak ve ondan ilk yıkanacak ve tersine, daha güçlü tutulan iyonlar en son olacaktır. sütundan elute edin. Genellikle, iyonik olmayan doğadaki BTqpH4Hbie etkileşimleri, numunenin matrisin iyonik olmayan kısmı ile adsorpsiyonu veya hidrojen bağları veya numunenin hareketli fazdaki sınırlı çözünürlüğü nedeniyle ortaya çıkar. "Klasik" iyon değişim kromatografisini "saf" bir biçimde izole etmek zordur ve bu nedenle bazı kromatograflar iyon değişim kromatografisindeki teorik ilkelerden ziyade ampirik ilkelerden yola çıkarlar.

Spesifik maddelerin ayrılması, öncelikle en uygun sorbent ve hareketli fazın seçimine bağlıdır. İyon değiştirme kromatografisinde sabit fazlar olarak, iyon değiştirme reçineleri ve aşılanmış iyonojenik gruplara sahip silika jeller kullanılır.

2.4. ÖZEL KROMATOGRAFİ

Dışlama kromatografisi bir seçenektir! Sıvı kromatografisi, moleküllerin sorbentin gözenekleri içindeki çözücü ile akan çözücü arasındaki dağılımı nedeniyle ayrılmanın meydana geldiği sıvı kromatografisi " parçacıkları arasında.

Diğer HPLC seçeneklerinden farklı olarak, ayırma gitmek Bileşenlerin sorbent yüzeyi ile farklı etkileşimleri nedeniyle, boyut dışlama kromatografisinde katı dolgunun rolü sadece belirli bir boyutta gözeneklerin oluşumundadır ve durağan faz bu gözenekleri dolduran çözücüdür. Bu nedenle, "sorbent" teriminin bu dolgu maddelerine uygulanması bir dereceye kadar keyfidir.

Yöntemin temel bir özelliği, molekülleri, pratik olarak herhangi bir moleküler ağırlık aralığında - 102 ila 108 arasında çözelti içindeki boyutlarına göre ayırma yeteneğidir, bu da onu sentetik ve biyopolimerlerin incelenmesi için vazgeçilmez kılar.

Geleneksel olarak, organik çözücülerde gerçekleştirilen işleme hala genellikle jel geçirgenlik kromatografisi ve sulu sistemlerde - jel filtrasyon kromatografisi denir. Bu kitapta, her iki seçenek için de İngilizce "Boyut Hariç Tutma" dan gelen tek bir terim benimsenmiştir - boyuta göre bir istisnadır - ve sürecin mekanizmasını tam olarak yansıtır.

Boyut dışlama kromatografisi sürecinin çok karmaşık bir teorisi hakkında mevcut fikirlerin ayrıntılı bir analizi, monograflarda gerçekleştirilir.

Kolondaki toplam çözücü hacmi VT (buna genellikle toplam sütun hacmi denir, çünkü Vd kromatografik süreçte yer almaz), hareketli ve sabit fazların hacimlerinin toplamıdır.

Moleküllerin dışlama sütununda tutulması, gözeneklere difüzyon olasılığı ile belirlenir ve Şek. 2.15. dağılım katsayısı ka, kromatografinin diğer varyantlarında olduğu gibi, bir maddenin sabit ve hareketli fazlardaki konsantrasyonlarının oranıdır.

Hareketli ve durağan fazlar aynı bileşime sahip olduğundan, kd her iki fazın da eşit olarak erişilebilir olduğu bir madde bire eşittir. Bu durum, tüm gözeneklere nüfuz eden (bkz. Şekil 2.15) ve bu nedenle kolonda en yavaş hareket eden en küçük C molekülleri (çözücü molekülleri dahil) için gerçekleşir. Tutma hacimleri, çözücünün toplam hacmine eşittir. vt-

Pirinç. 2.15. Boyut dışlama kromatografisinde ölçü ile moleküllerin ayrılması için model

Boyutu sorbentin gözenek boyutundan daha büyük olan tüm moleküller bunlara giremez (tam dışlama) ve partiküller arasındaki kanallardan geçemez. Hareketli fazın hacmine eşit aynı tutma hacmiyle kolondan ayrılırlar V 0 - Bu moleküller için bölme katsayısı sıfırdır.

Gözeneklerin sadece bir kısmına nüfuz edebilen orta büyüklükteki moleküller, boyutlarına göre kolonda tutulur. Bu moleküllerin dağılım katsayısı sıfırdan bire değişir ve belirli bir boyuttaki moleküller için mevcut gözenek hacminin fraksiyonunu karakterize eder, bunların tutma hacmi, gözenek hacminin mevcut kısmı ve yaklaşık Y toplamı ile belirlenir.

KALİTATİF ANALİZ

Yüksek performanslı sıvı kromatografisine başlayan bir kromatograf, kalitatif analizin temellerine aşina olmalıdır. Kalitatif analiz, yeni bir şekilde veya diğer ürünlerle karışım halinde elde edilen bilinen bir ürünün tanımlanması için kullanılmaktadır. "Özellikle tıp, adli bilim, ekoloji alanlarında önemli olan karmaşık biyolojik, kimyasal karışımlardan çeşitli bileşenlerin izolasyonu için gereklidir. , bazı tıbbi kimyasal ürünlerin ve bunların metabolitlerinin biyomateryallerdeki yerini kontrol etmek için .. „." Kalitatif "analizin temellerine aşinalık, örneğin / bir numunedeki safsızlıkları bir çözücüdeki safsızlıklardan ayırt etmeye veya bir maddenin saflığını birden fazla dalga boyu spektrofotometresinde ve farklı vb.'de kontrol edin.

Analize geçmeden önce, örneğin tamamının bu solvent sistemi ile kolondan ayrıştırılıp yıkanmadığının belirlenmesi gerekir. Tam elüsyondan emin olmak için kolondan akan tüm sıvıyı toplamak, çözücüyü buharlaştırmak, tortuyu tartmak ve numune geri kazanım derecesini bulmak gerekir.

HPLC'de bileşen tanımlaması üç şekilde yapılabilir: 1) saklama bilgilerinin kullanılması; 2) spektral veya kimyasal analiz yöntemlerini kullanarak sıvı kromatograf kolonunda ayırma sırasında elde edilen bölgeleri incelemek; 3) spektrum analizörünü doğrudan kolona bağlayın.

Tutma hacmi, kromatografide zirveleri kaydetmek için kullanılır. VR veya saklama süresi t R. Her iki miktar da belirli bir kromatografik sistemdeki bir maddenin karakteristiğidir. Ayrıştırılacak maddenin alıkonma süresi kolondaki etkileşim süresi ile tüpün boş bölümlerinin geçiş süresinden oluştuğu için cihazdan cihaza değişiklik göstermektedir. Alıkonma süresi ve hacmi standart olarak alındığında, belirli bir sütun tarafından tutulmayan bir maddeye sahip olmak uygundur. T 0 , V o. Madde ve standardın kromatografisi aynı koşullar altında (basınç ve akış hızı) gerçekleştirilmelidir. Saklama verileri ile tanımlandığında, numunelerde bulunabilecek bilinen tekil maddeler aynı kromatografik sistemde ayrıştırılır ve bunlar için değerler elde edilir. t R. Bu değerlerin karşılaştırılması t R Bilinmeyen zirvenin alıkonma süresi ile, bunların ya çakıştığını bulabilir ve o zaman zirvelerin aynı maddeye karşılık gelmesi muhtemeldir veya t R bilinen madde eşleşmiyor t R bilinmeyen bölge O zaman değerlerin kaba bir tahmini hala mümkündür t R tutulma derecesinin doğrudan ölçülmesi için mevcut olmayan maddeler. Her iki seçeneği de ele alalım.

İlk durumda, numunenin içinde belirli maddelerin varlığını varsaymak için bir ön çalışma açıkça gereklidir. Basit karışımlarla çalışırken, numune bölgelerinin ve bilinen maddelerin alıkonma derecesinin uyuşup uyuşmadığını, yani değerlerle örtüşüp örtüşmediğini belirlemek kolaydır. tB aynı veya farklıdır. Karmaşık karışımlar söz konusu olduğunda, birkaç madde aynı anda benzer değerlere sahip olabilir. t R, ve kromatografik ayırma ile fiilen elde edilen bölgeler örtüşür. Sonuç olarak, doğru değerlerin elde edilmesi t R farklı bölgeler için imkansız hale gelir. Çözünürlüğün artması, ayırma koşullarının daha dikkatli kontrolü ve değerlerin çoklu ölçümü ile tanımlamanın güvenilirliği artar. t R ve bulunan değerlerin ortalaması alınır. Bu durumda, bilinen ve bilinmeyen maddelerin kromatografik ayrımı değişmelidir. Karmaşık karışımları ayırırken, değer t R maddeler, numunenin kendisinin matrisinin etkisi altında değişebilir. Bu etki, kromatogramın başlangıcında ve örtüşen piklerle mümkündür; daha önce bahsedilen bölgelerin daraltılması da mümkündür.

Bu gibi durumlarda standardı örneğe 1:1 oranında ekleyin.Maddeler aynı ise değer t R başlangıç materyali değişmez ve kromatogramda sadece bir pik elde edilir. Döngüsel kromatografi sistemine sahip bir alet varsa, tanımlamanın güvenilirliği için karışımın kolondan birkaç kez geçirilmesi arzu edilir.

Alıkoyma bilgileri literatürde de bulunabilir, ancak bu bilgilerin değeri sınırlıdır. Bir partinin sütunları bile zayıf tekrarlanabilirlik sağladığından, edebi değerler her zaman gerçek değere karşılık gelmez. t R bu sütunda. Bununla birlikte, adsorpsiyon kromatografisi için tahmin etmek mümkündür. t R literatür verilerine dayanmaktadır. Edebi anlamların kullanımıyla ilgili bir başka zorluk t R, - Kromatografi Dergisi'nde yayınlanan bibliyografik incelemeler, madde türlerinin güncellenmiş bir indeksine sahip olmasına rağmen, özel literatürdeki araştırmalarının karmaşıklığı.

İkinci durumda, bilinen bileşiklerin ve numune bölgelerinin alıkonma süreleri çakışmadığında, bilinmeyen bileşenin alıkonma zamanını tahmin etmek mümkündür. Göreceli tutma tahminleri, boşluk dışlama kromatografisindeki yapı verilerine dayalı olarak oldukça güvenilirdir. Adsorpsiyonda, dağılım kromatografisinde ve özellikle kimyasal olarak bağlı bir faz üzerinde çalışırken daha az hassastırlar. Bilinen p ile maddelerin iyonik ve iyon çifti kromatografisi için Ka sadece yaklaşık değerler mümkündür tr. Göreceli tutma veya * x değerini tahmin etmek mutlak değerlerden her zaman daha kolaydır k". göreli değerler t R ikame edilmiş alkil karboksilik asitler veya benzen türevleri gibi ilgili bileşikler veya türevler için değerlendirilmesi daha kolaydır.

Homologların veya oligomerlerin izokratik olarak ayrılmasıyla, bazen aşağıdaki model gözlemlenir:

\ gk" = A + bin,

nerede A ve V- bir dizi seçilmiş numune ve belirli bir kromatografik sistem için sabitler (aynı kolon üzerinde, aynı hareketli ve sabit fazlar ile); NS- numune molekülündeki özdeş yapısal birimlerin sayısı.

Fonksiyonel grubun / numune molekülüne girmesi bir değişikliğe yol açacaktır. k" ilk denklemde belirli bir kromatografik sistemde bir sabit katsayı a / ile. a / çeşitli ikame grupları için / değerleri, sabitlerin değerlerinin olduğu ters fazlı kromatografi hariç, her türlü kromatografide fonksiyonel grupların artan polaritesi ile artacak olan grup sabitleri elde etmek mümkündür. artan polarite ile azalır.

Bazı grup sabitleri a / çeşitli ikame grupları için / tabloda verilmiştir. 9.1.

Adsorpsiyon kromatografisinde, tüm izomerlerin aynı anlama sahip olması şartıyla geçerli olduğundan, ilk denklem her zaman uygulanabilir değildir. k", ki her zaman gözlenmez. Bununla birlikte, "bir sütundaki aynı bileşiklerin, aynı bileşiklerin lgfe'sine karşı", ancak farklı bir sütunda veya ince tabaka kromatografisinde karşılık gelen özelliklere karşı lgfe bağımlılığını çizmek mümkündür, örneğin, lg [(l - Rf) IRf].

Maddelerin tutulmasına ilişkin verileri karşılaştırırken, kapasite faktörünün değerleri kullanılabilir. k", ondan beri, aksine t R hareketli fazın hızı ve kolonun geometrik özellikleri etkilenmez.

Kimyasal olarak bağlı fazda ayırma, benzer fazlar ile ayırma kromatografisi ayırmasına benzer ve bu nedenle, alıkonma sürelerini tahmin etmek için denge ekstraksiyon verileri kullanılabilir.

İyon değişim kromatografisinde tutma, üç faktörden etkilenir: asitlerin ve bazların iyonlaşma derecesi, iyonize molekülün yükü ve iyon değişim kromatografisinde kullanılan sulu mobil fazdan bir maddenin organik faza göç etme yeteneği. . İkincisi, bileşiğin moleküler ağırlığına ve hidrofobikliğine bağlıdır. Bu nedenle, daha güçlü asitler veya bazlar, anyon değişimi veya katyon değişimi ayrımında daha güçlü bir şekilde tutulur. azalırken pK bir Numuneye dahil edilen tek bir asidin, anyon değişimi nedeniyle bir takım asitlerin ayrılmasıyla alıkonma artar ve p / C o'daki bir artışla, katyon değişimi nedeniyle ayrılmaları sırasında bazların tutulması artar.

Böylece, bilinen maddenin alıkonma sürelerinin gözlenen madde ile çakışması, onların kimliğinin varsayılmasını mümkün kılmaktadır. Bilinen bir maddenin ve bilinmeyen bir bileşenin kromatogramları farklı koşullar altında karşılaştırılırsa, tanımlamanın güvenilirliği artar. Adsorpsiyon ve ters faz veya iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisindeki maddeler aynı şekilde davranırsa, tanımlamanın güvenilirliği artar. Eşit göreceli kalıcılık ile tanımlamanın güvenilirliği %90 ise, aynı maddelerin önemli ölçüde farklı koşullar altında davranışını incelerken, tanımlamanın güvenilirliği zaten %99'dur.

Tanımlamada kullanılan bir maddenin değerli bir özelliği, belirli bir madde için elde edilen sinyallerin iki farklı dedektör üzerindeki oranıdır. Analit kolondan çıktıktan sonra önce birinci detektörden, ardından ikinciden geçer ve detektörlerden gelen sinyaller aynı anda çok kalemli bir kaydedici veya iki kaydedici kullanılarak kaydedilir. Genellikle, bir ultraviyole dedektörünün (daha hassas, ancak seçici) bir refraktometre veya bir floresan dedektörlü bir ultraviyole dedektörü veya farklı dalga boylarında çalışan iki ultraviyole dedektörü ile seri bağlantısı kullanılır. Göreceli yanıt, yani refraktometre sinyalinin fotometre sinyaline oranı, her iki dedektörün de kendi lineer aralığında çalışması koşuluyla, maddenin bir özelliğidir; bu, aynı maddenin farklı miktarlarının eklenmesiyle doğrulanır. Kalitatif bilgi, "akış hücresindeyken kolondan çıkan pikin spektrumunu, bilinen bir bileşiğin spektrumuyla karşılaştırarak" kaydeden bir Stop flow cihazı ile donatılmış fotometrik dedektörler çalıştırılarak elde edilebilir.

Modern, hala pahalı, diyot dizili spektrofotometreler, tanımlamada büyük ilgi görmektedir.

Tamamen bilinmeyen bir madde tek başına yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tanımlanamaz ve başka yöntemlere ihtiyaç vardır.

KANTİTATİF ANALİZ

Kantitatif sıvı kromatografisi, kantitatif gaz kromatografisinden daha düşük olmayan ve TLC veya elektroforez doğruluğunu önemli ölçüde aşan iyi geliştirilmiş bir analitik yöntemdir.Bu nedenle, kantitatif sonuçlar elde etmek için cihazın kalibre edilmesi gerekir.

Kantitatif analiz aşağıdaki aşamalardan oluşur: 1) kromatografik ayırma; 2) tepe alanlarının veya yüksekliklerinin ölçülmesi; 3) kromatografik verilere dayalı olarak karışımın kantitatif bileşiminin hesaplanması; 4) elde edilen sonuçların yorumlanması, yani istatistiksel işleme. Tüm bu aşamaları ele alalım.

4.1. KMATOGRAFİK AYIRMA

Örnekleme hataya açık olabilir. Hatadan kaçınmak ve homojen olmayan katı numunelerin, uçucu veya kararsız maddelerin yanı sıra tarım ürünleri ve biyomateryallerin yeterli temsili numunesini elde etmek özellikle önemlidir. Gıda ürünleri gibi homojen olmayan numuneler iyice karıştırılır ve dörde bölünür. Bu işlem defalarca yapılarak numunenin homojenliği sağlanır.

Ekstraksiyon, izolasyon, saflaştırma vb. aşamalarda maddelerin hata ve kayıpları kabul edilebilir.

Numuneler tamamen çözülmeli ve çözeltileri ± %0,1 doğrulukla hazırlanmalıdır. Numunenin, kromatografa girdikten sonra çökelme olasılığını ortadan kaldıran mobil fazda çözülmesi arzu edilir. Mobil fazda çözünme mümkün değilse, onunla karışabilen bir çözücü kullanılmalı ve numune hacimleri (25 µl'den az) kromatografa verilmelidir.

Fraksiyonasyonu, sızıntısı ve pik bulaşması nedeniyle numune enjeksiyonu sırasında önemli yanlışlıklar meydana gelebilir. Pik bulanıklığı, kuyruk oluşumuna neden olarak tepe noktalarının kısmen örtüşmesine ve sonuç olarak algılamada hatalara yol açar. Kantitatif enjeksiyon için, daha yüksek doğruluk ve daha az operatör bağımlılığı nedeniyle şırıngalara göre döngü valfi cihazları tercih edilir.

Maddelerin kromatografik olarak ayrılmasında, verilerin bozulmasına yol açan komplikasyonlar da ortaya çıkabilir: nicel analiz. Kromatografik işlem sırasında numunenin ayrışması veya transformasyonu veya maddenin bu kolon üzerinde geri döndürülemez şekilde adsorpsiyonu mümkündür. Bu istenmeyen fenomenlerin olmamasını sağlamak ve gerekirse kolonu yenilemek veya değiştirmek önemlidir. Pik örtüşmesi ve kuyruklanma, kromatografik koşullar değiştirilerek de azaltılabilir.

Kantitatif analizde sahte veya bulanık tepe noktaları ve ayrıca serbest bırakma süresi yakın olan tepe noktaları kullanamazsınız. ile, çünkü yetersiz ayırma olabilir. Tipik olarak, ^ 0,5 değerinde pikler kullanılır.En yüksek kolon verimliliği, sorbent gramı başına 10 ~ 5 -10 ~ 6 g çözünen maddenin eklenmesiyle elde edilir. Büyük miktarlarda numune enjekte edilirken, tepe yüksekliğinin bağımlılığı yükte doğrusal olmayabilir ve pik alanları tarafından nicelleştirme gereklidir.

Tespit veya amplifikasyonla ilgili hatalar, kromatografik ayırma sonuçlarında önemli bir bozulmaya yol açar. Her dedektör özgüllük, doğrusallık ve hassasiyet ile karakterize edilir. Seçicilik testi özellikle eser kirlilikleri analiz ederken önemlidir. UV dedektörlerinin tepkisi, benzer fonksiyonel gruplara sahip maddelere 10 4 faktörü ile değişebilir. Her analit için dedektör yanıtını kalibre etmek gerekir. Doğal olarak UV bölgesinde absorbe etmeyen maddeler detektör olarak fotometre kullanıldığında kayıt cihazına sinyal vermeyecektir. Bir refraktometre kullanılırken negatif tepe noktaları görünebilir. Ayrıca, UV dedektörü için gerekli olmayan bu dedektörün termostatlı olması gerekir.

Dedektörün doğrusallığı, enjekte edilen numunenin boyutunu belirler. Kolon akış hızının, kolon ve dedektör sıcaklığının ve tasarımın kantitasyonun doğruluğunu etkileyeceği unutulmamalıdır. Bir elektrik sinyalinin bir çıkış cihazına (kaydediciye), bir entegratöre veya bir bilgisayara iletilmesinde hatalar, gürültü alımı, topraklama eksikliği, ağdaki voltaj dalgalanmaları vb.

4.2. ÖLÇÜM ALANI VEYA PİK YÜKSEKLİK

tepe yüksekliği H (Şekil 10.1) Zirvenin tepesinden taban çizgisine kadar olan mesafe denir, doğrusal olarak ölçülür veya kayıt cihazında bölme sayısı sayılır. Bazı elektronik entegratörler ve bilgisayarlar, tepe yükseklikleri hakkında bilgi sağlar. Yer değiştiren tepe noktalarının taban çizgisinin konumu, tepe noktasının başlangıcına ve sonuna (tepe noktası) karşılık gelen ordinat değerlerinin enterpolasyonu ile bulunur. 1 ve 3 bkz. şek. 10.1). Doğruluğu artırmak için yumuşak, istikrarlı bir temeliniz olmalıdır. Ayrılmamış tepe noktaları durumunda, taban çizgisi, bir sıfır çizgisi ile değiştirilmek yerine tepe noktasının başlangıcı ve sonu arasında çizilir. Pik yüksekliği, bitişik örtüşen tepe noktalarının etkisine daha az bağımlı olduğundan, tepe yüksekliği tahmini daha doğrudur ve neredeyse her zaman iz analizi için kullanılır.

Pik alanı çeşitli şekillerde belirlenebilir. Bunlardan bazılarına bir göz atalım.

1. Planimetrik yöntem, tepe noktasının, tepe alanını mekanik olarak belirleyen bir cihaz olan elle tutulan bir planimetre ile çevrelenmesi gerçeğinden oluşur. Yöntem doğru, ancak zahmetli ve yetersiz tekrarlanabilir. Bu yöntem istenmeyen bir durumdur.

2. Kağıt siluetleri yöntemi - tepe kesilir ve tartılır. Yöntem iyi tekrarlanabilir, ancak zahmetlidir ve kromatogram yok edilir. Uygulanabilirliği, grafik şeridinin tekdüzeliğine bağlıdır. Yöntem ayrıca yaygın olarak tavsiye edilemez.

4. Üçgenleme yöntemi, tepenin kenarlarına teğet çizgiler çizerek bir üçgen oluşturmayı içerir. Üçgenin tepesi, tepenin tepesinden daha yüksektir. Bu uzatılmış tepe noktasının oluşturduğu alandaki artış, kromatogram boyunca tutarlı olacak ve doğruluğu çok fazla etkilemeyecektir. Ek olarak, teğet çizerken kaybedilen bazı alanlar telafi edilecektir. Üçgenin tabanı, taban çizgisi ile teğetlerin kesişimi ile belirlenir ve alan, taban ile yüksekliğin 7g çarpımı ile belirlenir. Bu yöntem, asimetrik tepe noktalarının alanlarını belirlemek için en iyisidir. Ancak, farklı operatörler tarafından tanjantların oluşturulmasındaki tekrarlanabilirlik farklıdır ve bu nedenle; düşük.

5. Disk entegratörü yöntemi, bir kayıt cihazına bağlı bir elektromekanik cihaza dayanmaktadır. Entegratöre takılan kalem, kayıt cihazı kaleminin hareketiyle orantılı bir hızda bandın altındaki şerit boyunca hareket eder.

Manuel ölçümde olduğu gibi, tepe noktası kaydedici ölçeğinde kalmalıdır, ancak taban çizgisi kaymasını ve bitişik tepe noktalarının eksik ayrılmasını telafi etmek için yapılan ayarlamalar güvenilirliği azaltır ve analiz süresini artırır.

Yöntem, özellikle asimetrik piklerde manuel ölçüm yöntemlerinden daha doğrudur ve hız avantajı sunar. Ek olarak, analizin sürekli nicel bir kaydını sağlar.

6. Pik alanlarını belirlemek ve o alan ve alıkoyma süreleri hakkında bilgi yazdırmak için elektronik entegratörleri kullanan yöntemler, taban çizgisi sapmasının düzeltilmesini ve yalnızca kısmen ayrılmış tepe noktalarının alanının belirlenmesini içerebilir. Başlıca avantajları doğruluk, hız, eylemin kaydedicinin çalışmasından bağımsızlığıdır. Entegratörlerin hafızası vardır ve önceden programlanmış bir program kullanılarak belirli bir analiz için programlanabilirler. Entegratörün avantajları arasında, farklı maddelere karşı dedektör duyarlılığındaki farkı telafi ederek, tepe alanlarındaki ilk verileri yeniden hesaplarken dedektör yanıtı için düzeltme faktörlerini kullanma yeteneği yer alır. Bu tür sistemler zamandan tasarruf sağlar, analitik doğruluğu artırır ve rutin analitik analiz için faydalıdır.

7. Sıvı kromatografisinde, tepe alanları ölçmek için bilgisayarlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Maddelerin adı, pik alanları, alıkonma süreleri, dedektör yanıtı için düzeltme faktörleri ve çeşitli numune bileşenleri için içerik (ağırlıkça % olarak) dahil olmak üzere eksiksiz bir mesaj yazdırırlar.