Princíp metódy kvapalinovej chromatografie. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia prírodných a odpadových vôd

Úvod

Kapitola 1. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

Kapitola 2. Podstata HPLC

2.1 Aplikácia

Kapitola 3. Príklady použitia HPLC pri analýze objektov životného prostredia

Kapitola 4. Zariadenie pre HPLC

Literatúra

Aplikácia

Úvod

Chromatografické metódy sú často nevyhnutné na identifikáciu a kvantifikáciu organických látok s podobnou štruktúrou. Súčasne najpoužívanejšie na rutinnú analýzu látok znečisťujúcich životné prostredie sú plynová a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Plynovochromatografická analýza organických polutantov v pitnej a odpadovej vode bola najskôr založená na použití náplňových kolón, neskôr sa rozšírili aj kremenné kapilárne kolóny. Vnútorný priemer kapilárnych kolón je zvyčajne 0,20-0,75 mm, dĺžka je 30-105 m Optimálne výsledky pri analýze kontaminantov vo vode sa dosahujú najčastejšie pri použití kapilárnych kolón s rôznou hrúbkou filmu z metylfenylsilikónov s fenylovými skupinami 5 a 50%... Systém zavádzania vzorky sa často stáva zraniteľným miestom v chromatografických technikách využívajúcich kapilárne kolóny. Systémy zavádzania vzoriek možno rozdeliť do dvoch skupín: univerzálne a selektívne. Všestranné aplikácie zahŕňajú splitové a splitless vstrekovacie systémy, vstrekovanie do „studenej“ kolóny a teplotne programované odparovanie. Pri selektívnom vstrekovaní sa používa fúkanie so stredným zachytávaním, analýza headspace atď. Pri použití univerzálnych vstrekovacích systémov sa do kolóny privádza celá vzorka, pri selektívnom vstrekovaní sa vstrekuje len určitá časť. Výsledky získané selektívnym vstrekovaním sú oveľa presnejšie, pretože frakcia vstupujúca do kolóny obsahuje iba prchavé látky a technika môže byť plne automatizovaná.

Plynovochromatografické detektory používané pri monitoringu škodlivín sa často delia na univerzálne detektory, ktoré reagujú na každú zložku v mobilnej fáze, a selektívne detektory, ktoré reagujú na prítomnosť určitej skupiny látok s podobnými chemickými vlastnosťami v mobilnej fáze. Medzi univerzálne patrí plameňová ionizácia, atómová emisia, hmotnostné spektrometrické detektory a infračervená spektrometria. Selektívne detektory používané pri analýze vody sú elektrónový záchyt (selektívny pre látky obsahujúce atómy halogénu), termoiónový (selektívny pre zlúčeniny obsahujúce dusík a fosfor), fotoionizačný (selektívny pre aromatické uhľovodíky), detektor elektrolytickej vodivosti (selektívny pre zlúčeniny, obsahujúci atómy halogénov síry a dusíka). Minimálne zistiteľné množstvá látok sú od nanogramov po pikogramy za sekundu.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia(HPLC) je ideálna metóda na stanovenie veľkého množstva tepelne labilných zlúčenín, ktoré nie je možné analyzovať plynovou chromatografiou. Moderné agrochemikálie, vrátane metylkarbonátov a organofosfátových insekticídov a iných neprchavých látok, sa často stávajú predmetom analýzy kvapalinovou chromatografiou. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia si získava na popularite medzi inými metódami používanými pri monitorovaní životného prostredia, aj preto, že má dobré vyhliadky v oblasti automatizácie prípravy vzoriek.

KAPITOLA 1. ZÁKLADNÉ POJMY A KLASIFIKÁCIA METÓD KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE

Kvapalinová chromatografia je rozdelená do niekoľkých tried v závislosti od typu stacionárnej fázy. Jednoduchý hardvérový dizajn papierovej a tenkovrstvovej chromatografie viedol k širokému použitiu týchto metód v analytickej praxi. Veľké možnosti kvapalinovej stĺpcovej chromatografie však podnietili zlepšenie vybavenia pre túto klasickú metódu a viedli k rýchlemu zavedeniu HPLC. Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožnil dramaticky zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne dispergovaného sorbentu. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izolovať, kvantitatívne a kvalitatívne analyzovať zložité zmesi organických zlúčenín.

Podľa mechanizmu interakcie separovanej látky (eluátu) so stacionárnou fázou sa rozlišuje adsorpčná, distribúcia, iónomeničová, veľkostne vylučovacia, iónovo-párová, ligandová a afinitná chromatografia.

Adsorpčná chromatografia... Separácia adsorpčnou chromatografiou sa uskutočňuje ako výsledok interakcie separovanej látky s adsorbentom, ako je oxid hlinitý alebo silikagél, ktorý má na povrchu aktívne polárne centrá. Rozpúšťadlo (eluent) je nepolárna kvapalina. Sorpčný mechanizmus spočíva v špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (resp. schopnými polarizácie) oblasťami molekúl analyzovanej zložky (obr. 1).

Ryža. 1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia.

Deliaca chromatografia... V distribučnom variante kvapalinovej chromatografie sa separácia zmesi látok uskutočňuje v dôsledku rozdielu v ich distribučných koeficientoch medzi dvoma nemiešateľnými fázami - eluentom (mobilná fáza) a fázou na sorbente (stacionárna fáza).

o normálna fáza Vo variante distribučnej kvapalinovej chromatografie sa používa nepolárny eluent a polárne skupiny naočkované na povrch sorbentu (najčastejšie silikagél). Ako modifikátory povrchu silikagélu (vrúbľované fázy) sa používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupiny atď. (obr. 2). Použitie očkovaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Ryža. 2. Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (variant s normálnou fázou).

Obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) navrúbľované na povrch sorbentu (obr. 3).

Ryža. 3. Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s obrátenými fázami).

Menej používaná verzia kvapalinovej chromatografie s nanesenými fázami je, keď sa kvapalná stacionárna fáza nanáša na stacionárny podklad.

Exkluzívne (prenikajúce do gélu) chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k separácii látok v dôsledku distribúcie molekúl medzi rozpúšťadlom v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami.

Afinný chromatografia je založená na špecifických interakciách separovaných proteínov (protilátok) s látkami (antigénmi) navrúbľovanými na povrch sorbentu (syntetickej živice), pričom selektívne tvoria komplexy (konjugáty) s proteínmi.

Iónová výmenná chromatografia, iónovýmenná chromatografia a chromatografia na výmene ligandov sa používajú hlavne v anorganickej analýze.

Základné parametre chromatografickej separácie.

Hlavnými parametrami chromatografickej separácie sú retenčný objem a retenčný čas zložky zmesi (obr. 4).

Retenčný čas tR je čas, ktorý uplynie od momentu vstreknutia vzorky do kolóny, kým sa neobjaví maximum zodpovedajúceho píku. Vynásobením retenčného času objemovou rýchlosťou eluentu F získame retenčný objem VR:

Opravený retenčný čas - čas, ktorý uplynul od okamihu objavenia sa maximálneho píku nesorbovanej zložky po vrchol zodpovedajúcej zlúčeniny:

tR"= tR-to;

Znížený alebo upravený retenčný objem je retenčný objem korigovaný na mŕtvy objem kolóny V0, t. j. retenčný objem nesorbovanej zložky:

VR = VR - V0;

Retenčnou charakteristikou je aj kapacitný koeficient k ", definovaný ako pomer hmotnosti látky v stacionárnej fáze k hmotnosti látky v mobilnej fáze: k" = mn / mp;

Hodnota k sa dá ľahko určiť z chromatogramu:

Najdôležitejšími parametrami chromatografickej separácie sú jej účinnosť a selektivita.

Účinnosť kolóny, meraná výškou teoretických poschodí (HETT) a nepriamo úmerná ich počtu (N), čím vyššia, tým užší je pík látky vystupujúcej v rovnakom retenčnom čase. Hodnotu účinnosti možno vypočítať z chromatogramu pomocou nasledujúceho vzorca:

N = 5,54 . (tR / 1/2) 2 ,

kde tR- retenčný čas,

w 1/2 - šírka píku v polovici výšky

Keď poznáme počet teoretických poschodí na kolónu, dĺžku kolóny L a priemerný priemer zŕn sorbentu dc, je ľahké získať hodnoty výšky ekvivalentnej teoretickej úrovni (HETT) a zníženej výšky (PVETT):

VETT = L / N PVETT = VETT / d c

Tieto charakteristiky umožňujú porovnať účinnosť rôznych typov kolón, posúdiť kvalitu sorbentu a kvalitu plnenia kolón.

Selektivita separácie dvoch látok je určená rovnicou:

Pri uvažovaní o separácii zmesi dvoch zložiek je dôležitým parametrom aj stupeň separácie RS:

;

Píky sa považujú za povolené, ak je hodnota RS väčšia alebo rovná 1,5.

Hlavné chromatografické parametre sú spojené nasledujúcou rovnicou pre rozlíšenie:

;

Faktory určujúce selektivitu separácie sú:

1) chemická povaha sorbentu;

2) zloženie rozpúšťadla a jeho modifikátorov;

3) chemická štruktúra a vlastnosti zložiek zmesi, ktorá sa má oddeliť;

4) teplota kolóny

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú zariadenia rôzneho stupňa zložitosti - od najjednoduchších systémov až po chromatografy vysokej triedy vybavené rôznymi prídavnými zariadeniami.

Na obr. 4. je uvedená bloková schéma kvapalinového chromatografu, ktorá obsahuje minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

Ryža. 4. Bloková schéma kvapalinového chromatografu.

Čerpadlo (2) je navrhnuté tak, aby vytváralo konštantný prietok rozpúšťadla. Jeho dizajn je primárne určený prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú piestové (striekačky) alebo piestové čerpadlá. Nevýhodou prvého je potreba pravidelných prestávok na plnenie eluentom a druhého veľká zložitosť konštrukcie a v dôsledku toho vysoká cena. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa úspešne používajú lacné peristaltické čerpadlá, ale keďže je ťažké dosiahnuť konštantný tlak a prietok, ich použitie je obmedzené na prípravné úlohy.

Injektor (3) zaisťuje, že vzorka zmesi zložiek, ktoré sa majú separovať, je vstrekovaná do kolóny s dostatočne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché systémy odberu vzoriek so zastavením prietoku vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako dávkovače Reodyne so slučkou.

HPLC kolóny (4) sú hrubostenné rúrky z nehrdzavejúcej ocele, ktoré vydržia vysoký tlak. Dôležitú úlohu zohráva hustota a rovnomernosť náplne kolóny so sorbentom. Pre nízkotlakovú kvapalinovú chromatografiu sa úspešne používajú hrubostenné sklenené kolóny. Teplotnú stálosť zabezpečuje termostat (5).

Detektory (6) pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej sa kontinuálne merajú niektoré vlastnosti prúdiaceho eluentu. Najpopulárnejšími typmi detektorov na všeobecné použitie sú refraktometre, ktoré merajú index lomu, a spektrofotometrické detektory, ktoré merajú absorbanciu rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). Medzi výhody refraktometrov (a nevýhody spektrofotometrov) patrí nízka citlivosť na typ stanovovanej zlúčeniny, ktorá nemusí obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla v tomto prípade nie je možné.

HPLC kolóny, ktoré sa najčastejšie používajú pri analýze látok znečisťujúcich životné prostredie, majú dĺžku 25 cm a vnútorný priemer 4,6 mm, sú naplnené sférickými časticami silikagélu s veľkosťou 5-10 µm s naočkovanými oktadecylovými skupinami. V posledných rokoch sa objavili kolóny s menšími vnútornými priemermi, plnené menšími časticami. Použitie takýchto kolón vedie k zníženiu spotreby rozpúšťadiel a trvania analýzy, zvýšeniu citlivosti a účinnosti separácie a tiež uľahčuje problém pripojenia kolón k spektrálnym detektorom. Kolóny s vnútorným priemerom 3,1 mm sú vybavené bezpečnostnou patrónou (predkolónou) pre zvýšenie životnosti a zlepšenie reprodukovateľnosti analýz.

Ako detektory v moderných HPLC prístrojoch sa zvyčajne používa UV detektor na diódovej matrici, fluorescenčný a elektrochemický.

Treba mať na pamäti, že v praktickej práci separácia často prebieha nie jeden po druhom, ale prostredníctvom niekoľkých mechanizmov súčasne. Vylučovacia separácia je teda komplikovaná adsorpčnými efektmi, adsorpčnou - distribúciou a naopak. Navyše, čím väčší je rozdiel medzi látkami vo vzorke z hľadiska stupňa ionizácie, zásaditosti alebo kyslosti, molekulovej hmotnosti, polarizovateľnosti a iných parametrov, tým väčšia je pravdepodobnosť rozdielneho separačného mechanizmu pre takéto látky.

V praxi je najrozšírenejšia „reverzná fázová“ (distribučná) chromatografia, pri ktorej stacionárna fáza nie je polárna, ale mobilná fáza je polárna (čiže reverzná chromatografia s „priamou fázou“).

Vo väčšine laboratórií na svete sa skupina 16 prioritných PAH analyzuje pomocou HPLC alebo CMS.

KAPITOLA 2. PODSTATA HPLC

Pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) je povaha procesov prebiehajúcich v chromatografickej kolóne vo všeobecnosti identická s procesmi v plynovej chromatografii. Jediným rozdielom je použitie kvapaliny ako stacionárnej fázy. Vzhľadom na vysokú hustotu kvapalných mobilných fáz a vysoký odpor kolóny sa plynová a kvapalinová chromatografia značne líšia svojim hardvérovým dizajnom.

V HPLC sa ako mobilné fázy zvyčajne používajú čisté rozpúšťadlá alebo ich zmesi.

Na vytvorenie prúdu čistého rozpúšťadla (alebo zmesí rozpúšťadiel), ktorý sa v kvapalinovej chromatografii nazýva eluent, sa v hydraulickom systéme chromatografu používajú čerpadlá.

Adsorpčná chromatografia sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich rozdeleniu do zón počas pohybu s mobilnou fázou pozdĺž kolóny. Oddelenie zón zložiek dosiahnuté v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami, povrchmi a priemermi pórov sa najčastejšie používajú v HPLC. Oxid hlinitý a iné adsorbenty sa používajú oveľa menej často. Hlavným dôvodom je:

nedostatočná mechanická pevnosť, ktorá neumožňuje balenie a použitie pri zvýšených tlakoch typických pre HPLC;

silikagél má v porovnaní s oxidom hlinitým širší rozsah pórovitosti, plochy povrchu a priemeru pórov; výrazne vyššia katalytická aktivita oxidu hlinitého vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie.

HPLC detektory

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa používa na detekciu polárnych neprchavých látok, ktoré sa z nejakého dôvodu nedajú previesť do formy vhodnej pre plynovú chromatografiu, a to ani vo forme derivátov. Medzi tieto látky patria najmä sulfónové kyseliny, vo vode rozpustné farbivá a niektoré pesticídy, ako sú deriváty fenylmočoviny.

Detektory:

UV - diódový detektor poľa. „Matrica“ fotodiód (je ich viac ako dvesto) neustále registruje signály v UV a viditeľnej spektrálnej oblasti, čím zabezpečuje záznam UV-B spektier v režime skenovania. To umožňuje nepretržite zaznamenávať s vysokou citlivosťou neskreslené spektrá komponentov rýchlo prechádzajúcich špeciálnou bunkou.

V porovnaní s detekciou jednej vlnovej dĺžky, ktorá neposkytuje informácie o „čistote“ píku, možnosť porovnať celé spektrá diódového poľa poskytuje výsledok identifikácie s oveľa väčšou mierou spoľahlivosti.

Fluorescenčný detektor. Veľká obľuba fluorescenčných detektorov je spôsobená veľmi vysokou selektivitou a citlivosťou a tým, že mnohé látky znečisťujúce životné prostredie fluoreskujú (napríklad polyaromatické uhľovodíky).

Elektrochemický detektor sa používa na detekciu látok, ktoré sa ľahko oxidujú alebo redukujú: fenoly, merkaptány, amíny, aromatické nitro a halogénderiváty, ketónaldehydy, benzidíny.

Chromatografická separácia zmesi na kolóne v dôsledku pomalého postupu PP trvá dlho. Na urýchlenie procesu sa chromatografia uskutočňuje pod tlakom. Táto metóda sa nazýva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Modernizácia zariadenia používaného v klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografii z nej urobila jednu z najsľubnejších a najmodernejších metód analýzy. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je vhodná metóda na separáciu, preparatívnu izoláciu a kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu neprchavých termolabilných zlúčenín s nízkou aj vysokou molekulovou hmotnosťou.

V závislosti od typu sorbentu použitého pri tejto metóde sa používajú 2 možnosti chromatografie: na polárnom sorbente s nepolárnym eluentom (možnosť s priamou fázou) a na nepolárnom sorbente s použitím polárneho eluentu - tzv. fázová vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Keď eluent prechádza do eluentu, rovnováha v podmienkach HPLC sa ustanoví mnohonásobne rýchlejšie ako v podmienkach polárnych sorbentov a nevodných PP. V dôsledku toho, ako aj pohodlnosti práce s vodnými a vodno-alkoholickými eluentmi, si v súčasnosti Off-HPLC získala veľkú popularitu. Väčšina analýz HPLC sa uskutočňuje pomocou tejto metódy.

Detektory. Registrácia výstupu z kolóny samostatného komponentu sa vykonáva pomocou detektora. Na registráciu môžete použiť zmenu akéhokoľvek analytického signálu prichádzajúceho z mobilnej fázy a súvisiaceho s povahou a množstvom zložky zmesi. V kvapalinovej chromatografii sa využívajú analytické signály ako absorpcia svetla alebo emisia svetla výstupného roztoku (fotometrické a fluorometrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivosť (elektrochemické detektory) atď.

Priebežne detekovaný signál je zaznamenávaný záznamníkom. Chromatogram je sekvencia signálov detektora zaznamenaná na záznamovej páske, generovaná, keď jednotlivé zložky zmesi opúšťajú kolónu. V prípade separácie zmesi sú na vonkajšom chromatograme viditeľné jednotlivé píky. Poloha píku na chromatograme sa používa na účely identifikácie, výška alebo plocha píku sa používa na účely kvantifikácie.

2.1 Aplikácia

HPLC sa najčastejšie používa v nasledujúcich oblastiach chemickej analýzy (predmety analýzy sú zvýraznené, kde HPLC prakticky nemá konkurenciu):

Kontrola kvality potravín - tonizujúce a dochucovacie prísady, aldehydy, ketóny, vitamíny, cukry, farbivá, konzervačné látky, hormóny, antibiotiká, triazín, karbamát a iné pesticídy, mykotoxíny, nitrozamíny, polycyklické aromatické uhľovodíky atď.

Ochrana životného prostredia - fenoly, organické nitrozlúčeniny, mono- a polycyklické aromatické uhľovodíky, množstvo pesticídov, hlavné anióny a katióny.

Forenzná veda – drogy, organické výbušniny a farbivá, silné liečivá.

Farmaceutický priemysel - steroidné hormóny, takmer všetky produkty organickej syntézy, antibiotiká, polymérne prípravky, vitamíny, proteínové prípravky.

Medicína - uvedené biochemické a liečivé látky a ich metabolity v biologických tekutinách (aminokyseliny, puríny a pyrimidíny, steroidné hormóny, lipidy) pri diagnostike ochorení, zisťovaní rýchlosti vylučovania liečiv z organizmu za účelom ich individuálneho dávkovania.

Poľnohospodárstvo - stanovenie dusičnanov a fosforečnanov v pôdach na stanovenie potrebného množstva aplikovaných hnojív, stanovenie nutričnej hodnoty krmív (aminokyseliny a vitamíny), rozbor pesticídov v pôde, vode a poľnohospodárskych produktoch.

Biochémia, bioorganická chémia, genetické inžinierstvo, biotechnológia - cukry, lipidy, steroidy, proteíny, aminokyseliny, nukleozidy a ich deriváty, vitamíny, peptidy, oligonukleotidy, porfyríny atď.

Organická chémia - všetky stabilné produkty organickej syntézy, farbivá, termolabilné zlúčeniny, neprchavé zlúčeniny; anorganická chémia (takmer všetky rozpustné zlúčeniny vo forme iónov a komplexných zlúčenín).

kontrola kvality a bezpečnosti potravinárskych výrobkov, alkoholických a nealkoholických nápojov, pitnej vody, chemikálií pre domácnosť, parfumov vo všetkých fázach ich výroby;

určenie povahy znečistenia na mieste katastrofy spôsobenej ľudskou činnosťou alebo mimoriadnej udalosti;

detekcia a analýza omamných, silných, jedovatých a výbušných látok;

stanovenie prítomnosti škodlivých látok (polycyklické a iné aromatické uhľovodíky, fenoly, pesticídy, organické farbivá, ióny ťažkých kovov, alkalických kovov a kovov alkalických zemín) v kvapalných odpadoch, emisiách do ovzdušia a tuhých odpadoch z podnikov a v živých organizmoch;

monitorovanie procesov organickej syntézy, spracovania ropy a uhlia, biochemického a mikrobiologického priemyslu;

analýza kvality pôdy na hnojenie, prítomnosť pesticídov a herbicídov v pôde, vode a produktoch, ako aj nutričná hodnota krmív; komplexné výskumné analytické úlohy; získanie stopového množstva ultračistej látky.

KAPITOLA 3. PRÍKLADY POUŽITIA HPLC PRI ANALÝZE ENVIRONMENTÁLNYCH OBJEKTOV

HPLC - metóda na monitorovanie PAU v objektoch životného prostredia

Pre polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH), ekotoxické látky 1. triedy nebezpečnosti, boli stanovené extrémne nízke hladiny maximálnych povolených koncentrácií (MPC) v prírodných objektoch. Stanovenie PAH na úrovni MPC a nižšej je jednou z veľmi zložitých analytických úloh a na ich riešenie sa využívajú high-tech metódy analýzy (GC-MS, GC, HPLC). Pri výbere metódy monitorovania sa k hlavným uvažovaným charakteristikám - citlivosť a selektivita, rýchlosť a hospodárnosť pridávajú od r monitorovanie zahŕňa sériovú analýzu. Možnosť HPLC na krátkych kolónach s malým priemerom tieto požiadavky do značnej miery spĺňa. Pomocou tejto metódy autori vyvinuli a certifikovali metódy na monitorovanie benzo[a]pyrénu v troch prírodných prostrediach: aerosól, snehová pokrývka a povrchové vody. Techniky sa vyznačujú: jednoduchou unifikovanou prípravou vzorky, vrátane extrakcie PAU organickými rozpúšťadlami a zahustením extraktu, priamym zavedením koncentrovaného extraktu do chromatografickej kolóny, využitím viacvlnovej fotometrickej detekcie v UV oblasti. spektrum, identifikácia píkov PAH v chromatogramoch pomocou dvoch parametrov, retenčného času a spektrálneho pomeru ... Celková chyba nepresahuje 10 % pri stanovení benzo [a] pyrénu v aerosóle v koncentračnom rozsahu od 0,3 do 450 ng / m 3, v povrchových vodách v koncentračnom rozsahu od 10 do 1 000 ng / l, v snehovej pokrývke v r. rozsah povrchovej hustoty od 0,5 do 50 μg/m2. Pre prípad súčasného stanovenia prioritných PAH (do 12 zlúčenín) a registrácie nehomogénnych píkov analytov sa navrhuje preseparácia extraktu so zmenou selektivity mobilnej fázy, vlnovej dĺžky detekcie a teploty kolóny, s prihliadnutím na jednotlivé vlastnosti stanovených PAU.

1 ... Kvalita okolitého vzduchu. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2000.

2 ... Kvalita povrchových a čistených odpadových vôd. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2001.

3 ... Kvalita snehu. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 02-2001.

Odstránenie anilínu z vodných roztokov pomocou odpadovej alumotermálnej redukcie valcovaného medeného okují

Problém odstraňovania uhľovodíkov z odpadových vôd je naliehavou úlohou. V mnohých chemických, petrochemických a iných priemyselných odvetviach vzniká anilín a jeho deriváty, čo sú toxické látky. Anilín je vysoko toxická látka, maximálna koncentrácia je 0,1 mg/m3. Anilín a jeho deriváty sú rozpustné vo vode, a preto ich nemožno odstrániť gravitačným usadzovaním.

Jednou z najlepších metód na čistenie odpadových vôd od organických polutantov je použitie anorganických a organických adsorbentov schopných regenerácie (hlinitosilikáty, modifikované íly, drevo, vlákna atď.) a neschopných regenerácie (aktívne uhlie, makroporézne polymérne materiály atď.) .).

Regenerované adsorbenty dokážu z vody odstrániť organické látky rôznej polarity. Hľadanie účinných adsorbentov je naliehavou úlohou.

Táto správa prezentuje výsledky štúdie v oblasti aplikácie valcovaných medených okují Jerevanského závodu na výrobu káblov (OPMOERKZ) ako anilínových sorbentov.

Chromatografické štúdie sa uskutočnili na HPLC chromatografe / vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii / systémoch (Waters 486 - detektor, Waters 600S - kontrolér, Waters 626 - Pump), na kolóne 250 x 4 mm naplnenej skúmanými sorbentmi, mobilnom fázová rýchlosť 1 ml / m / mobilná fáza sú nami skúmané rozpúšťadlá /, detektor je UV-254. UV spektroskopická analýza sa uskutočnila na spektrofotometri Specord-50, spektrá sa získali pomocou počítačového programu ASPECT PLUS.

K určitým objemom anilínu vo vode sa pridávali presne navážené dávky sorbentov, ktorých počiatočné koncentrácie sa menili. Zmes sa dôkladne pretrepáva 6 hodín a potom sa vzorka nechá usadiť. Adsorpcia je ukončená prakticky do 48 hodín Množstvo vyzrážaného anilínu bolo stanovené UV spektrofotometrickou a refraktometrickou analýzou.

Najprv sa skúmali adsorpčné vlastnosti OPMOErKZ, keď sa anilín odstránil z roztoku v tetrachlórmetáne. Ukázalo sa, že anilín najlepšie absorbuje sorbent 3 (tabuľka).

Merania boli vykonané aj pre vodné roztoky anilínu v koncentráciách 0,01-0,0001 mol/l. V tabuľke sú uvedené údaje pre 0,01 M roztok.

Absorpcia anilínu rôznymi sorbentmi z 0,01 M vodného roztoku anilínu pri 20 °C

Predtým sa zistilo, že adsorpcia sa zvyšuje v rámci špecifikovaného koncentračného rozsahu a lineárne závisí od indexu lomu. Množstvo anilínu sa určilo z grafického vzťahu "index lomu - molárna koncentrácia" a korigovalo sa údajmi kvapalinovej chromatografie a UV spektrálnej analýzy.

Pre vodné roztoky je najaktívnejší sorbent 3. Množstvo adsorbovanej škodliviny bolo vypočítané ako rozdiel medzi celkovým množstvom znečisťujúcej látky pridanej do pôvodného roztoku a jej zvyškom v konečnom roztoku.

Metódy stanovenia PAU v objektoch životného prostredia

Na stanovenie PAH sa zvyčajne používajú metódy plynovej chromatografie (GC) a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). separácia hlavných 16 PAH, postačujúca na kvantitatívnu analýzu, sa dosiahne použitím buď kapilárnych kolón v plynovej chromatografii, alebo vysokovýkonných kolón používaných v HPLC. Malo by sa pamätať na to, že kolóna, ktorá dobre separuje kalibračné zmesi šestnástich PAH, nezaručuje, že sa budú dobre separovať aj na pozadí sprievodných organických zlúčenín v testovaných vzorkách.

V záujme zjednodušenia analýzy, ako aj dosiahnutia vysokej kvality získaných výsledkov väčšina analytických postupov obsahuje štádium predbežnej izolácie (separácie) PAU od ostatných skupín príbuzných zlúčenín vo vzorkách. Najbežnejšie používané metódy na tento účel sú kvapalinová-tuhá alebo kvapalinová-kvapalina nízkotlaková kvapalinová chromatografia využívajúca adsorpčné mechanizmy, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, niekedy zmiešané mechanizmy, ako je adsorpcia a eliminácia pomocou Sephadexu.

Použitie predbežného čistenia vzoriek umožňuje vyhnúť sa vplyvu:

Úplne nepolárne zlúčeniny, ako sú alifatické uhľovodíky;

Stredne až vysoko polárne zlúčeniny, ako sú ftalány, fenoly, viacsýtne alkoholy, kyseliny;

Vysokomolekulárne zlúčeniny, ako sú živice.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) využíva najmä dva typy detektorov: fluorometrický detektor alebo spektrofotometrický detektor s fotodiódovým poľom. Detekčný limit pre PAH pri fluorometrickej detekcii je veľmi nízky, čo robí túto metódu obzvlášť vhodnou na stanovenie stopových množstiev polyaromatických zlúčenín. Klasické fluorometrické detektory však neposkytujú prakticky žiadne informácie o štruktúre skúmanej zlúčeniny. Moderné konštrukcie umožňujú zaznamenať fluorescenčné spektrá, ktoré sú charakteristické pre jednotlivé zlúčeniny, no v praxi rutinných meraní sa zatiaľ nerozšírili. Spektrofotometrický detektor s fotodiódovým pravítkom (PDL) umožňuje registrovať absorpčné spektrá v UV a viditeľnom spektrálnom rozsahu, tieto spektrá možno použiť na identifikáciu. Podobné informácie možno získať pomocou detektorov rýchleho skenovania.

Pri výbere analytickej techniky na separáciu, identifikáciu a kvantitatívnu analýzu uvedených PAH je potrebné vziať do úvahy nasledujúce podmienky:

hladina stanovených obsahov v skúšobných vzorkách;

Počet príbuzných látok;

Použitý analytický postup (technika merania);

Schopnosti sériového zariadenia.

Vývoj metódy na stanovenie prvkov alkalických zemín a horčíka iónovou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou

Vývoj a zdokonaľovanie metód, ktoré umožňujú riešiť problémy analýzy vody, je dôležitým problémom analytickej chémie. Rozvoj vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie pri vysokom tlaku podnietil vývoj nového smeru v iónovo-výmennej chromatografii, takzvanej iónovej chromatografii. Syntéza sorbentov pre iónovú chromatografiu je náročná, pretože je na ne kladených veľa požiadaviek. Pre nedostatok komerčne dostupných vysoko účinných katexov bola použitá dynamicky modifikovaná reverzná fáza, pre ktorú bol syntetizovaný modifikátor: kyselina N-hexadecyl-N-dekanoyl-paraminobenoylsulfónová etyl-diizopropylamónium (DHDASK), kde hydrofóbny amín obsahujúci SO 3 - skupina, schopná výmeny katiónov. Po prechode roztokom modifikátora dosiahla absorpcia pri l = 260 nm 6,4 jednotiek optickej hustoty (°E) s plató. Vypočítaná kapacita výmeny iónov je 15,65 μmol. Keďže katióny prvkov alkalických zemín a horčíka neabsorbujú v UV oblasti spektra, bola použitá nepriama UV detekcia s použitím syntetizovaného UV absorbujúceho eluentu 1,4-dipyridíniumbutánbromidu (DPB bromid). Pretože halogénové ióny ničia oceľové časti kolóny, bol bromidový ión 1,4-dipyridíniumbutánu nahradený acetátovým iónom. Keď sa kolóna premyje eluentom, protiión modifikátora, etyldiizopropylamónium, sa nahradí UV-absorbujúcim 1,4-dipyridíniumbutánovým iónom. Separácia katiónov bola uskutočnená pri optimálnej vlnovej dĺžke l = 260 nm na stupnici 0,4 A v režime „skladanie mierky“; polarita rekordéra bola obrátená. Separácia všetkých študovaných katiónov bola dosiahnutá zavedením komplexotvornej prísady, kyseliny šťaveľovej. Detekčné limity pre Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ sú 8 μg / l; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 μg/l, resp. Za zvolených podmienok bola analyzovaná voda z vodovodu, v ktorej je obsah Ca 2+ 10,6 + 1,9 mg iónu / l, Mg 2 + -2,5 + mg iónu / l. Chyba reprodukovateľnosti nepresahuje -2,2 % pre Ca2+ a 1,4 % pre Mg2+.

Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

Na štúdium mechanizmov migrácie ťažkých kovov v biosfére sú potrebné údaje o chemických formách existencie kovov v prírode. Ťažkosti pri analýze zlúčenín jedného z najtoxickejších kovov – kadmia – sú spojené s tým, že vytvára krehké komplexy a pri pokuse o ich izoláciu dochádza k narušeniu prirodzenej rovnováhy. V tejto práci boli skúmané zlúčeniny kadmia v pôde a rastlinách pomocou techniky založenej na chromatografickej separácii extraktov s následnou identifikáciou zložiek chemickou analýzou. Tento prístup umožnil nielen identifikovať chemické formy kadmia, ale aj sledovať ich premeny v objektoch životného prostredia.

OH-skupiny sacharidov a polyfenolov (vrátane flavonoidov), C = O, fosfáty, NH 2, NO 2, SH-skupiny sú koordinované s kadmiom v objektoch biosféry. Na účely tejto štúdie bol zostavený súbor modelových ligandov reprezentujúcich tieto triedy zlúčenín. Interakcia modelových ligandov s vo vode rozpustnými soľami kadmia bola skúmaná UV spektroskopiou a HPLC.

Na izoláciu zlúčenín kadmia sme použili extrakciu špeciálne vybranými (netvoriacimi komplexy s Cd) rozpúšťadlami. Kadmium je teda možné oddeliť od všetkých ťažkých kovov, okrem jeho blízkeho chemického analógu – zinku. Píky obsahujúce kadmium a zinok v chromatogramoch získaných extraktov boli detekované väzbou kovov vo forme ich ditizonátov. Na separáciu od zinku bol použitý rozdiel v stabilite komplexov Cd a Zn pri pH 6-8. Izolované Cd zlúčeniny boli identifikované pomocou HPLC so zmenou pH počas elúcie. Uskutočnila sa analýza zlúčenín kadmia so zložkami pôd a rastlinných tkanív a identifikovali sa látky produkované rastlinami v reakcii na zvýšený príjem kadmia z pôdy. Ukázalo sa, že flavonoidy, najmä tricín, sú ochrannými činidlami v obilninách, alkoxyderiváty cysteínu v strukovinách a polyfenoly aj tioly v krížoch.

KAPITOLA 4. VYBAVENIE HPLC

SÉRIA ACCELA

Nový ultra-výkonný kvapalinový chromatograf ACCELA je schopný pracovať v najširšom rozsahu prietokov a tlakov, pričom poskytuje typickú HPLC separáciu na konvenčných kolónach a ultrarýchlu a efektívnu separáciu na kolónach s veľkosťou častíc sorbentu menšou ako 2 μm pri ultravysokých tlakoch (nad 1000 atm.).

Systém obsahuje vstupné čerpadlo so štvrťročným gradientom schopné dosahovať tlaky presahujúce 1000 barov a so zásobným objemom iba 65 µl na vysokorýchlostnú chromatografickú separáciu. Autosampler ACCELA je schopný pracovať v 30 sekundovom cykle vstrekovania vzorky a poskytuje najvyššiu reprodukovateľnosť vstrekovania. Detektor diódového poľa Accela PDA s minimalizovaným objemom prietokovej kyvety (2 μL) je optimalizovaný pre režim vysokorýchlostnej chromatografie, využíva patentovanú technológiu LightPipe a zachováva si symetrický tvar piku, ktorý je výsledkom použitia bezchybného chromatografického systému a kolón.

Systém sa dokonale integruje s hmotnostnými spektrometrami a vytvára najvýkonnejšie a najlepšie systémy HPLC / MS dostupné na svete.

UHP kolóny s veľkosťou zrna 1,9 μm dostupné od Thermo Electron pre akúkoľvek aplikáciu

SÉRIA TSP

Modulárny princíp konštrukcie HPLC prístrojov umožňuje zákazníkovi flexibilne dopĺňať vybavenie pre riešenie akýchkoľvek analytických úloh a v prípade ich zmeny je možné ho rýchlo a ekonomicky upraviť. Široká škála modulov zahŕňa čerpadlá od izokratických až po štvorzložkové gradienty, od mikrokolón až po semipreparatívne, všetky dostupné detektory, systémy vstrekovania vzoriek od ručných injektorov po autosamplery s akoukoľvek možnosťou manipulácie so vzorkami, výkonný softvér na spracovanie výsledkov meraní a riadenie všetkých systémové moduly. Všetky moduly sú certifikované podľa CSA, TUF/GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sú kompaktné, majú moderný dizajn, ľahko sa ovládajú, sú vybavené vstavaným displejom a samost. -diagnostický systém, umožňuje vytvárať a ukladať parametre problémových metód. Spĺňajú kritériá „Správnej laboratórnej praxe“ (SLP) a sú uvedené v Registri meracích prístrojov Ruskej federácie. Správy o meraní sa vydávajú v súlade s liekopismi Anglicka, USA, Nemecka a Francúzska.

Modulárne systémy TSP sa vyznačujú najvyššou spoľahlivosťou a prevádzkovou stabilitou.

Kombinácia modulov poskytuje analytikovi všetky výhody integrovaného systému na jednej strane a flexibilitu modulárneho systému na strane druhej. V akejkoľvek oblasti použitia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) - farmakológia, biotechnológia, environmentálna analýza, klinická analýza,

Vnútorný vzduch: metódy kontroly a čistenia. Kontrola zdroja škodlivých látok a životného prostredia. Analyzátory plynov: aplikácia a ich moderné typy na sledovanie zloženia plynnej zmesi - univerzálna fotometrická kvapalina a páska.

Monitoring ako systém sledovania a kontroly prostredia. Metódy monitorovania polutantov v objektoch životného prostredia.

Separácia aniónov jednostĺpcovou iónovou chromatografiou. Obrázok štruktúry častice iónomeničovej živice. Príklady použitia iónomeničovej chromatografie pri analýze objektov životného prostredia. Vlastnosti analýzy piva iónovou chromatografiou.

Všeobecná charakteristika organochlórových zlúčenín, ich hlavné fyzikálne a chemické vlastnosti a aplikácie, negatívny vplyv na životné prostredie, organizmus zvierat, rýb a ľudí. Organochlórové pesticídy v potravinách a metódy ich stanovenia.

Základy planárnej (tenkovrstvovej) chromatografie: stav a perspektívy využitia moderných inštrumentálnych metód analýzy pesticídov, organochlórových pesticídov vo vode, potravinách, krmivách a tabakových výrobkoch chromatografiou v tenkej vrstve.

Dostupné metódy na odber vzoriek vnútorného vzduchu na analýzu. Princíp činnosti kolorimetrických trubíc. Zmena farby konkrétneho činidla pri kontakte s konkrétnym kontaminantom. Detekcia prchavých organických zlúčenín.

Teoretické základy fluometrie (luminiscencie), oblasti jej aplikácie pri analýze objektov životného prostredia a moderné výskumné zariadenia. Mimoriadna citlivosť a rýchlosť luminiscenčnej analýzy. Problémy s dodávkou excitačnej energie.

Vývoj chemických analytických zariadení nielenže neodstraňuje problém s kvalitou vykonávaných meraní, ale naopak kladie stále vyššie nároky na všetky aspekty meraní.

Všeobecné informácie o priemyselnom zariadení. Klimatické podmienky oblasti. Technologický reťazec. Zdroje znečistenia a narušenia prírodného prostredia. Znečistenie prírodných vôd. Pozorovacie miesta kvality povrchovej vody. Metódy odberu vzoriek a analýzy vody.

Široká škála organických zlúčenín vnášaných do životného prostredia v rámci hospodárskej činnosti človeka vedie k tomu, že tieto látky sa stali hlavnými znečisťujúcimi látkami, ktoré určujú charakter technogénneho znečistenia hydrosféry.

Charakteristika spektroskopických metód analýzy. Podstata extrakčných fotometrických metód. Príklady použitia metódy na stanovenie ťažkých kovov v prírodných vodách. Metóda detekcie bromidových iónov, dusičnanových iónov. Moderné vybavenie.

Pojem a účel plynovej chromatografie, parametre jej retencie. Retenčný čas a retenčný objem. Rovnice v plynovej chromatografii. Prídavné zariadenia na plynovú chromatografiu. Kontrola znečistenia ovzdušia v núdzových situáciách.

Pojem a charakteristika metódy hmotnostnej spektrometrie. Dvojité fokusačné hmotnostné spektrometre v hmotnostnej spektrometrii s indukčne viazanou plazmou. Využitie chromatografie-hmotnostnej spektrometrie pri identifikácii látok znečisťujúcich životné prostredie, zariadenia.

Metódy hodnotenia znečistenia prúdov plynov. Základné požiadavky na odber vzoriek plynov a metódy analýzy a merania. Metódy hodnotenia parametrického znečistenia. Metódy hodnotenia znečistenia vodného prostredia, pôdy, pôdy a vegetácie. Identifikácia zmien.

Stanovenie tisícin percent obsahu látok v čistých kovoch optickými analytickými metódami adsorpčnými metódami spektrofotometriou, fotokolorimetriou a kolorimetriou. Predaj chemických analytických zariadení prostredníctvom webových stránok.

Účel a základné princípy implementácie metód konduktometrických analýz. Rôzne používané metódy a vlastnosti ich aplikácie. Príklady použitia konduktometrie pri analýze objektov životného prostredia a zariadení potrebných na to.

Pokiaľ ide o prírodné vody, uvažuje sa o problémoch kvantitatívneho stanovenia a separácie na antropogénne a prírodné zložky uhľovodíkov (CH).

Sorpčné metódy čistenia vody sa v súčasnosti čoraz viac využívajú a jedným z najčastejšie používaných sorbentov je aktívne uhlie.

Hlavné typy chromatografie. Aplikácia chromatografických metód pri monitorovaní životného prostredia. Aplikácia chromatografie pri analýze objektov životného prostredia. Moderný dizajn hardvéru. Metódy na vytváranie chromatogramov a práca chromatografu.

Monitorovanie prírodných vôd fyzikálno-chemickými metódami: planárna (tenkovrstvová chromatografia) a jej využitie pri lýze vody. Separácia zmesi látok v plochej vrstve sorbentu a rozpúšťadla. Intenzita luminiscencie ropných produktov na fluorometri.

(OFS 42-0096-09)

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je technika stĺpcovej chromatografie, v ktorej je mobilná fáza (PF) kvapalina

kosť sa pohybuje cez chromatografickú kolónu naplnenú

mobilná fáza (sorbent). HPLC kolóny majú vysoké hydraulické tlaky na vstupe do kolóny, preto sa HPLC niekedy označuje ako

vyvayut "vysokotlaková kvapalinová chromatografia".

V závislosti od mechanizmu separácie látok sa rozlišujú:

Možnosti HPLC: adsorpcia, distribúcia, iónová výmena,

exkluzívne, chirálne a pod.

Pri adsorpčnej chromatografii dochádza k separácii látok v dôsledku ich rozdielnej schopnosti adsorbovať a desorbovať s

povrch adsorbenta s rozvinutým povrchom, napríklad silikagél.

Pri distribučnej HPLC dochádza k separácii v dôsledku rozdielu v distribučných koeficientoch látok, ktoré sa majú separovať, medzi stacionárnymi

(zvyčajne chemicky vrúbľované na povrch imobilného nosiča) a

mobilné fázy.

Podľa polarity PP a NF sa HPLC delí na normálnu fázu a obj.

rozšírená fáza.

Chromatografia na normálnej fáze sa nazýva variant, v ktorom

použite polárny sorbent (napríklad silikagél alebo silikagél s

skrútené NH2 - alebo CN-skupiny) a nepolárne PF (napríklad hexán s vyvinutým

osobné doplnky). Pri chromatografii na reverznej fáze sa

používať nepolárne chemicky modifikované sorbenty (napr.

nepolárny alkylový radikál C18) a polárne mobilné fázy (napr.

metanol, acetonitril).

Pri iónovo-výmennej chromatografii molekuly látok v zmesi, disociácia

tvorené v roztoku na katióny a anióny, sa pri prechode oddeľujú

sorbentu (katión alebo anión) v dôsledku ich rôznych výmenných kurzov s iónovými

mi skupiny sorbentov.

Pri vylúčení (sito, gélová penetrácia, gélová filtrácia)

chromatografiou sa molekuly látok oddeľujú podľa veľkosti v dôsledku ich rozdielnej schopnosti prenikať do pórov stacionárnej fázy. V tomto prípade prvý zo spolu-

vznikajú najväčšie molekuly (s najvyššou molekulovou hmotnosťou), schopné preniknúť do minimálneho počtu pórov stacionárnej fázy,

a posledné sú látky s malými veľkosťami molekúl.

Separácia často prebieha nie jeden po druhom, ale niekoľkými mechanizmami súčasne.

Metódu HPLC možno použiť na kontrolu kvality akéhokoľvek negatívu

zygomatických analytov. Na analýzu použite vhodné prístroje - kvapalinové chromatografy.

Zloženie kvapalinového chromatografu zvyčajne zahŕňa nasledujúce základy -

ny uzly:

– Jednotka na prípravu PF vrátane nádoby s mobilnou fázou (alebo kapacitným

s jednotlivými rozpúšťadlami, ktoré sú súčasťou mobilnej fázy

zy) a odplyňovací systém PF;

– čerpací systém;

– mixér mobilnej fázy (ak je to potrebné);

– systém vstrekovania vzoriek (injektor);

– chromatografická kolóna (môže byť inštalovaná v termostate);

- detektor;

– systém zberu a spracovania údajov.

Čerpací systém

Čerpadlá zabezpečujú prívod PF do kolóny pri danej konštantnej rýchlosti. Zloženie mobilnej fázy môže byť konštantné alebo variabilné.

počas analýzy. V prvom prípade sa proces nazýva izokratický,

a v druhom - gradient. Niekedy je inštalovaný pred čerpacím systémom

filtre s priemerom pórov 0,45 µm na filtráciu mobilnej fázy. Moderné

Čerpací systém kvapalinového chromatografu pozostáva z jedného alebo viacerých čerpadiel riadených počítačom. To vám umožňuje zmeniť ko-

stáva PF podľa určitého programu počas gradientovej elúcie. Sme-

Zložky PF v mixéri sa môžu vyskytovať pri nízkom tlaku

lening (pred čerpadlami) a pri vysokom tlaku (za čerpadlami). Miešač je možné použiť na prípravu PP a na izokratickú elúciu,

presnejší pomer zložiek sa však dosiahne predbežným

miešanie PP komponentov pre izokratický proces. Čerpadlá pre analytickú HPLC umožňujú udržiavať konštantný prietok PP do kolóny v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na vstupe kolóny do 50 MPa. Je však vhodné, aby táto hodnota neprekročila

šalo 20 MPa. Tlakové pulzácie sú minimalizované špeciálnym tlmením

železné systémy zahrnuté v konštrukcii čerpadiel. Pracovné diely zapnuté

čerpadlá sú vyrobené z materiálov odolných voči korózii, čo umožňuje použitie agresívnych zložiek v zložení PF.

Miešačky

Miešačky môžu byť svojou konštrukciou statické alebo dynamické

duševný.

V mixéri sa vytvorí jedna mobilná fáza z

samostatné rozpúšťadlá dodávané čerpadlami, ak požadovaná zmes nebola vopred pripravená. Miešanie rozpúšťadiel sa zvyčajne vyskytuje spontánne, ale niekedy sa používajú systémy núteného miešania.

šitie.

Injektory

Injektory môžu byť všestranné na vstrekovanie vzoriek z

1 μl až 2 ml alebo diskrétne na vstreknutie vzorky len určitého objemu

ema. Oba typy vstrekovačov môžu byť automatické („automatické vstrekovače“ alebo „autosamplery“). Injektor na vstrekovanie vzorky (roztoku) nie je umiestnený

priamo pred chromatografickou kolónou. Konštrukcia injektora umožňuje zmeniť smer toku PF a vykonať predbežné vstreknutie vzorky do slučky určitého objemu (zvyčajne od 10 do 100 μl).

Tento objem je uvedený na štítku pántu. Konštrukcia injektora umožňuje výmenu slučky. Na uvedenie analyzovaného riešenia do neznáma

paradajkový injektor je ručná mikrostriekačka s objemom, ktorý je

výrazne prevyšuje objem slučky. Prebytok injekčného roztoku, nie

v slučke sa vyhodí a do kolóny sa vstrekne presný a vždy rovnaký objem vzorky. Ručné neúplné naplnenie slučky znižuje presnosť

presnosť a reprodukovateľnosť dávkovania, a preto zhoršuje presnosť

a reprodukovateľnosť chromatografickej analýzy.

Chromatografický stĺpec

Chromatografické kolóny sú zvyčajne nerezové, sklenené alebo plastové rúrky naplnené sorbentom a uzavreté

na oboch stranách s filtrami s priemerom pórov 2–5 µm. Analytická dĺžka

kolóna, v závislosti od chromatografického separačného mechanizmu, môže byť v rozsahu od 5 do 60 cm alebo viac (zvyčajne je to

10-25 cm), vnútorný priemer - od 2 do 10 mm (zvyčajne 4,6 mm). V mikrostĺpci chrómu sa používajú kolóny s vnútorným priemerom menším ako 2 mm

tografia. Používajú sa aj kapilárne kolóny s vnútornými priemermi.

rum asi 0,3-0,7 mm. Kolóny pre preparatívnu chromatografiu majú vnútorný priemer do 50 mm alebo viac.

Krátke káble môžu byť inštalované pred analytickou kolónou.

stĺpy (strážne stĺpy) vykonávajúce rôzne pomocné funkcie

(častejšie - ochrana analytickej kolóny). Zvyčajne sa analýza vykonáva pomocou

teplotu, avšak na zvýšenie účinnosti separácie a

skrátenie doby trvania analýzy je možné použiť termostat

tirovanie kolón pri teplotách nie vyšších ako 60 C. Pri vyšších teplotách je možná deštrukcia sorbentu a zmena zloženia PF.

Stacionárna fáza (sorbent)

Zvyčajne sa používajú ako sorbenty:

1. V normálnom prípade sa používa silikagél, oxid hlinitý, porézny grafit

malofázová chromatografia. V tomto prípade prídržný mechanizmus

čaj - zvyčajne adsorpcia;

2. Živice alebo polyméry s kyslými alebo zásaditými skupinami. Oblasť použitia - iónomeničová chromatografia;

3. porézny silikagél alebo polyméry (vylučovacia chromatografia);

4. Chemicky modifikované sorbenty (sorbenty s vrúbľovanými

zami), pripravované najčastejšie na báze silikagélu. Retenčný mechanizmus je vo väčšine prípadov distribúcia medzi

noah a stacionárne fázy;

5. Chemicky modifikované chirálne sorbenty, napr.

vodné celulózy a amylózy, proteíny a peptidy, cyklodextríny,

používa sa na separáciu enantiomérov (chirálna chromatografia

Sorbenty s navrúbľovanými fázami môžu mať rôzne stupne chemického zloženia

technická úprava. Častice sorbentu môžu byť sférické alebo nie

pravidelný tvar a rôzna pórovitosť.

Najčastejšie používané vrúbľované fázy sú:

– oktylových skupín(sorbent oktylsilán alebo C8);

– oktadecylové skupiny(sorbent oktadecylsilán

(ODS) alebo C18);

– fenylové skupiny(fenylsilánový sorbent);

– kyanopropylové skupiny(CN sorbent);

– aminopropylové skupiny(sorbent NH2);

- diolové skupiny (sorbent diol).

Najčastejšie sa analýza vykonáva na nepolárnych vrúbľovaných fázach v

režim s reverznou fázou s použitím sorbentu C18.

V niektorých prípadoch je vhodnejšie použiť normálne

fázová chromatografia. V tomto prípade sa používa silikagél alebo polárne očkované fázy ("CN", "NH2", "diol") v kombinácii s nepolárnymi rozpúšťadlami.

Sorbenty s navrúbľovanými fázami sú chemicky stabilné pri hodnotách pH od 2,0 do 8,0, pokiaľ výrobca neurčí inak.

Častice sorbentu môžu mať guľovitý alebo nepravidelný tvar a rôznu pórovitosť. Veľkosť častíc sorbentu pri analytickej HPLC je zvyčajne 3–10 µm, pri preparatívnej HPLC - až 50 µm alebo viac.

Používajú sa aj monolitické sorbenty.

Vysoká separačná účinnosť je zabezpečená veľkým povrchom častíc sorbentu (čo je dôsledkom ich mikroskopickosti

veľkosť a prítomnosť pórov), ako aj jednotnosť zloženia sorbentu a jeho husté a rovnomerné balenie.

Detektory

Používajú sa rôzne metódy detekcie. Vo všeobecnom prípade PP so zložkami rozpustenými v ňom po chromatografickej kolóne

Ki vstupuje do detektorovej cely, kde sa nachádza jedna z jej vlastností (absorpcia v UV alebo viditeľnej oblasti spektra, fluorescencia,

index lomu, elektrická vodivosť atď.). Výsledný chromatogram je graf závislosti nejakého fyzikálneho

alebo fyzikálno-chemický parameter PF v závislosti od času.

Najbežnejšie sú spektrofotometrické de-

tektorov (vrátane diódovej matrice), ktoré zaznamenávajú zmenu v optike

hustota v ultrafialovom, viditeľnom a často blízkom infračervenom svetle

spektrálne oblasti od 190 do 800 alebo 900 nm. V tomto prípade chromatogram

čaj predstavuje závislosť optickej hustoty PF od času.

Tradične používaný spektrofotometrický detektor umožňuje

Môže vykonávať detekciu pri akejkoľvek vlnovej dĺžke vo svojom pracovnom rozsahu.

zónu. Používajú sa aj detektory s viacerými vlnovými dĺžkami, čo umožňuje

poskytnúť detekciu na niekoľkých vlnových dĺžkach súčasne.

Pomocou detektora diódového poľa je možné vykonávať nielen detekciu na niekoľkých vlnových dĺžkach naraz, ale aj prakticky okamžitú

získať optické spektrum FS v akomkoľvek okamihu (bez skenovania), čo značne zjednodušuje kvalitatívnu analýzu separovaných zložiek.

komponentov.

Citlivosť fluorescenčných detektorov je asi 1000-krát vyššia ako citlivosť spektrofotometrických. V tomto prípade sa použije buď vnútorná fluorescencia alebo fluorescencia zodpovedajúcich derivátov, ak samotná látka, ktorá sa má stanoviť, nefluoreskuje. Moderné

fluorescenčné detektory umožňujú nielen získavanie chromatografických

gramov, ale aj na zaznamenávanie excitačných a fluorescenčných spektier analýzy

spojenia.

Refraktometrické detektory sa používajú na analýzu vzoriek, ktoré neabsorbujú v UV a viditeľnej spektrálnej oblasti (napr. sacharidy).

(refraktometre). Nevýhodou týchto detektorov je ich nízka (v porovnaní so spektrofotometrickými detektormi) citlivosť a značná teplotná závislosť intenzity signálu (detektor musí byť termostatovaný).

Používajú sa aj elektrochemické detektory (konduktometrické

obloha, amperometrická atď.), hmotnostná spektrometria a Fourierova IČ

detektory, detektory rozptylu svetla, rádioaktivita a niektoré ďalšie

Mobilná fáza

V Ako PP je možné použiť rôzne rozpúšťadlá – jednotlivé aj ich zmesi.

V normálna fáza chromatografia zvyčajne používa kvapalný uhlík

levodorody (hexán, cyklohexán, heptán) a iné relatívne nepolárne

rozpúšťadlá s malými prídavkami polárnych organických zlúčenín,

ktoré regulujú elučný výkon PF.

V chromatografii na reverznej fáze obsahuje PF polárny

ganické rozpúšťadlá (zvyčajne acetonitril a metanol) a voda. Pre opt-

separácie často využívajú vodné roztoky s určitým

pH, najmä tlmivé roztoky. Prísady sa používajú anorganické

chemické a organické kyseliny, zásady a soli a iné zlúčeniny (napr

napríklad chirálne modifikátory na separáciu enantiomérov na achirálne

sorbent).

Kontrola hodnoty pH sa musí vykonávať oddelene pre vodnú zložku a nie pre jej zmes s organickým rozpúšťadlom.

PF môže pozostávať z jedného rozpúšťadla, často z dvoch, ak je to potrebné

dosah - tri alebo viac. Zloženie PP je uvedené ako objemový pomer rozpúšťadiel, ktoré sú v ňom obsiahnuté. V niektorých prípadoch mas

pomer, ktorý by mal byť osobitne stanovený.

Pri použití UV spektrofotometrického detektora by PF nemal mať výraznú absorpciu pri vlnovej dĺžke zvolenej na detekciu. Limit priehľadnosti alebo optickej hustoty pri určovaní

často sa uvádza špecifická vlnová dĺžka rozpúšťadla konkrétneho výrobcu

nájdete na obale.

Chromatografická analýza je značne ovplyvnená stupňom čistoty PF, preto je vhodnejšie použiť rozpúšťadlá vyrobené

špeciálne pre kvapalinovú chromatografiu (vrátane vody).

PP a analyzované roztoky by nemali obsahovať nerozpustné

častice a bubliny plynu. Voda získaná v laboratórnych podmienkach

vodné roztoky, vopred zmiešané s vodou, organické roztoky

Prístroje, ako aj analyzované roztoky, musia byť podrobené jemnej filtrácii a odplyneniu. Na tieto účely sa zvyčajne používa filtrácia.

vo vákuu cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm inertný vzhľadom na dané rozpúšťadlo alebo roztok.

Systém zberu a spracovania údajov

Moderný systém spracovania údajov je rozhranie

osobný počítač pripojený k chromatografu s nainštalovaným

softvér, ktorý vám umožňuje registrovať a spracovávať chro-

matogram, ako aj ovládať činnosť chromatografu a monitorovať hl

parametre chromatografického systému.

Zoznam chromatografických podmienok, ktoré treba uviesť

V súkromnej monografii sú veľkosti ko-

kolóny, typ sorbentu s uvedením veľkosti častíc, teplota kolóny (v prípade potreby termostatovanie), objem vstrekovanej vzorky (objem slučky),

stáva PF a spôsob jeho prípravy, rýchlosť posuvu PF, podmienky detektora a detekcie, popis gradientového režimu (ak sa používa), čas chromatografie.

iónová výmena a iónová HPLC

Na analýzu oboch organických látok sa používa iónomeničová chromatografia

(heterocyklické zásady, aminokyseliny, bielkoviny atď.) a inor-

ganické (rôzne katióny a anióny) zlúčeniny. Oddelenie komponentov

Obsah analyzovanej zmesi v iónovo-výmennej chromatografii je založený na reverzibilnej interakcii iónov analyzovaných látok s iónovými skupinami.

pami sorbent. Anionity alebo katión-

vy. Tieto sorbenty sú prevažne buď polymérne iónové

výmenné živice (zvyčajne kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s očkovanými

iónové skupiny) alebo silikagély s naočkovanými iónomeničovými skupinami. Sorbenty so skupinami - (СН2) 3 N + X– sa používajú na oddelenie aniónov a sorbenty so skupinami - (СН2) SO3 - Н + sa používajú na oddelenie katiónov.

Zvyčajne sa polymérové živice používajú na oddelenie aniónov a

vylúhovanie katiónov - modifikované silikagély.

Ako PF v iónomeničovej chromatografii sa používajú vodné roztoky kyselín, zásad a solí. Bežne sa používajú vyrovnávacie rasy.

krémy, ktoré umožňujú udržiavať určité hodnoty pH. Je tiež možné použiť malé prísady, organické miešateľné s vodou

chemické rozpúšťadlá - acetonitril, metanol, etanol, tetrahydrofurán.

Iónová chromatografia- variant iónomeničovej chromatografie, v

ktorá na určenie koncentrácie iónov analytu je

používa konduktometrický detektor. Pre vysoko citlivé op-

Stanovenie zmien vo vodivosti prechádzajúcej cez detektor PF, vodivosť pozadia PF by mala byť nízka.

Existujú dve hlavné možnosti iónovej chromatografie.

Prvý z nich je založený na potlačení elektrickej vodivosti elektrolýzy

PF pomocou druhej iónomeničovej kolóny umiestnenej medzi ana-

lytický stĺpec a detektor. V tomto stĺpci dochádza k neutralizácii

PF a analyzované zlúčeniny vstupujú do detekčnej bunky v deiónovej bunke

voda. Detegované ióny sú jediné ióny

poskytujúce PF vodivosť. Nevýhodou supresorovej kolóny je potreba jej regenerácie v pomerne krátkych intervaloch.

ja. Supresorový stĺpik môže byť nahradený kontinuálne pôsobiacim

membránový supresor, v ktorom je zloženie membrány kontinuálne

sa obnovuje prúdením regeneračného roztoku pohybujúcim sa v smere,

proti smeru toku PF.

Druhým variantom iónovej chromatografie je jednostĺpcová iónová chromatografia.

matografia. V tejto verzii je použitý PF s veľmi nízkou elektrickou vodivosťou.

obsah vody. Slabé organické zlúčeniny sa široko používajú ako elektrolyty.

skic kyseliny - benzoová, salicylová alebo izoftalová.

EXKLUZÍVNA HPLC

Veľkostná vylučovacia chromatografia (veľkostná vylučovacia chromatografia) je špeciálny typ HPLC založený na separácii molekúl podľa ich veľkosti. Distribúcia

molekúl medzi stacionárnou a mobilnou fázou je založený na veľkosti mo-

lekuly a čiastočne na ich tvare a polarite. Na oddelenie použite a

porézne sorbenty - polyméry, silikagél, porézne sklá a polysacharidy.

Veľkosť častíc sorbentov je 5–10 µm.

Výhodou poréznych skiel a silikagélu je rýchla difúzia molekúl PP a analytu do pórov, stabilita za rôznych podmienok (aj pri vysokých teplotách). Polymérny sorbén -

ste kopolyméry styrénu a divinylbenzénu (to sú hydro-

fobické sorbenty používané s nepolárnymi mobilnými fázami) a

hydrofilné gély vyrobené zo sulfónovaných divinylbenzénových alebo polyakrylamidových živíc.

Sú možné dva limitujúce typy interakcie molekúl s poréznou stacionárnou fázou. Molekuly, ktorých veľkosť je väčšia ako stredný priemer pórov a, vôbec neprenikajú do sorbentu a sú eluované spolu s mobilnou fázou.

Choď prvý. Molekuly s priemerom oveľa menším ako je veľkosť pórov sor-

benta do nej voľne prenikajú, zostávajú najdlhšie v stacionárnej fáze a sú eluované ako posledné. Stredne veľké molekuly prenikajú do pórov sorbentu v závislosti od veľkosti a čiastočne v závislosti od ich tvaru. Eluujú s rôznymi retenčnými časmi medzi cca-

naše najväčšie a najmenšie molekuly. K separácii zložiek chromatografovanej vzorky dochádza v dôsledku opakovaných ak-

difúziu zložiek vzorky do pórov sorbentu a naopak.

Pri vylučovacej chromatografii na charakterizáciu retencie

používa retenčný objem rovný súčinu prietoku PF a retenčného času.

Mobilná fáza. Výber PP závisí od typu sorbentu. exkluzívne-

Každá chromatografia sa vo všeobecnosti delí na gélovú filtráciu a gélovú filtráciu

penetračná chromatografia.

Na separáciu sa používa metóda gélovej filtračnej chromatografie

vo vode rozpustných zlúčenín na hydrofilných sorbentoch. Mobilné fázy sú vodné tlmivé roztoky s danou hodnotou pH.

Pri gélovej permeačnej chromatografii sa hydrofóbny resp.

ohyby a nepolárne organické rozpúšťadlá (toluén, dichlórmetán, tet-

rahydrofurán). Táto metóda sa používa na analýzu zlúčenín s nízkou rozpustnosťou.

okraj vo vode.

Detektory. Diferenciálne refraktometrické detektory, ako aj spektrofotometrické detektory (vrátane detektorov v infračervenej oblasti spektra) sa používajú ako detektory pri vylučovacej chromatografii.

Používajú sa aj viskozimetrické a prietokové laserové detektory.

Tieto detektory v kombinácii s refraktometrom alebo inou koncentráciou

detektor vám umožňuje nepretržite určovať molekulovú hmotnosť

vápno v PF.

ULTRA ÚČINNÁ KVAPALNÁ CHROMATOGRAFIA

Ultravýkonná kvapalinová chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, ktorý je účinnejší

v porovnaní s klasickou HPLC.

Charakteristickým znakom ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie je

Používa sa použitie sorbentov s veľkosťou častíc 1,5 až 2 mikróny. Rozmery chro-

matematické stĺpce majú zvyčajne dĺžku od 50 do 150 mm a od 1

do priemeru 4 mm. Objem vstreknutej vzorky môže byť od 1 do 50 μl.

Chromatografické zariadenia používané v klasickom

riante HPLC, zvyčajne špeciálne upravená pre tento typ chromatografie

Zariadenie určené pre ultravýkonnú kvapalinovú chromatografiu je možné použiť aj v klasickej verzii HPLC.

Kvapalinová chromatografia

Kvapalinová chromatografia je typ chromatografie, v ktorej mobilná fáza, nazývaný eluent, je kvapalina. Stacionárna fáza možno pevný sorbent, pevný nosič s kvapalinou nanesenou na jeho povrchu alebo gél.

Rozlišovať stĺpovitý a tenká vrstva kvapalinovou chromatografiou. V kolónovej verzii časť zmesi látok, ktoré sa majú oddeliť, prechádza cez kolónu naplnenú stacionárnou fázou v prúde eluentu, ktorý sa pohybuje pod tlakom alebo pôsobením gravitácie. Pri chromatografii na tenkej vrstve sa eluent pohybuje pôsobením kapilárnych síl pozdĺž plochej vrstvy sorbentu nanesenej na sklenenú platňu alebo kovovú fóliu, po poréznom polymérnom filme alebo po páse špeciálneho chromatografického papiera. Bola vyvinutá aj metóda tenkovrstvovej kvapalinovej chromatografie pod tlakom, keď sa eluent čerpá cez vrstvu sorbentu vloženú medzi platne.

Existujú také typy kvapalinovej chromatografie ako napr analytické(na analýzu zmesí látok) a prípravný(na izoláciu čistých zložiek).

Rozlišovať kvapalinovou chromatografiou (LC) vo svojej klasickej verzii, uskutočnenej o atmosferický tlak a vysoká rýchlosť) vykonaná o vysoký krvný tlak... Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) využíva kolóny s priemerom do 5 mm, tesne naplnené sorbentom s malými časticami (3-10 mikrónov). Na čerpanie eluentu cez kolónu použite tlak až 3,107 Pa. Tento typ chromatografie sa nazýva vysokotlaková chromatografia... Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožňuje dramaticky zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne dispergovaného sorbentu.

Možnosti HPLC sú mikrokolónová chromatografia na kolónach malého priemeru naplnených sorbentom a kapilárna chromatografia na dutých a sorbentom naplnených kapilárnych kolónach. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izolovať, kvantitatívne a kvalitatívne analyzovať zložité zmesi organických zlúčenín.

Kvapalinová chromatografia je najdôležitejšou fyzikálno-chemickou výskumnou metódou v chémii, biológii, biochémii, medicíne a biotechnológii. Používa sa na:

· Štúdium metabolických procesov v živých organizmoch liečiv;

· Diagnostika v medicíne;

· Analýza produktov chemickej a petrochemickej syntézy, medziproduktov, farbív, palív, mazív, ropy, odpadových vôd;

· Štúdium izoterm sorpcie z roztoku, kinetiky a selektivity chemických procesov;

Vypúšťanie

· Analýza a separácia zmesí, ich čistenie a izolácia mnohých biologických látok z nich, ako sú aminokyseliny, bielkoviny, enzýmy, vírusy, nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy, hormóny.

V chémii makromolekulových zlúčenín a pri výrobe polymérov sa kvalita monomérov analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie, študuje sa distribúcia molekulových hmotností a distribúcia podľa typov funkcionality oligomérov a polymérov, ktoré sú potrebné pre kontrolu produktu.

Kvapalinová chromatografia sa používa aj v parfumérii, potravinárstve, na analýzu znečistenia životného prostredia, vo forenznej vede.

Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) bola vyvinutá a zavedená v polovici 70. rokov 20. storočia. Potom sa objavili prvé kvapalinové chromatografy.

Kvapalinová chromatografia je optimálna metóda na analýzu chemicky a tepelne nestabilných molekúl, vysokomolekulárnych látok so zníženou prchavosťou. To možno vysvetliť špeciálnou úlohou mobilnej fázy v LC, na rozdiel od plynovej chromatografie: eluent neplní len transportnú funkciu.

2. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie.

Autor: mechanizmus retencie separovaných látok stacionárnou fázou LC rozlíšiť medzi:

sedimentačná chromatografia

· adsorpčná chromatografia , v ktorom sa separácia uskutočňuje ako výsledok interakcie látky, s ktorou sa má separovať adsorbent ako je oxid hlinitý alebo silikagél, majúci na povrchu aktívne polárne centrá. Solventný(eluent) - nepolárna kvapalina.

Ryža. Schéma separácie zmesi látok adsorpčnou chromatografiou

http://www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

Sorpčný mechanizmus spočíva v špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (resp. schopnými polarizácie) oblasťami molekúl analyzovanej zložky (obr.). K interakcii dochádza v dôsledku interakcie donor-akceptor alebo tvorby vodíkových väzieb.

Ryža. Diagram adsorpčnej kvapalinovej chromatografie

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "width =" 219 "height =" 200 ">

Ryža. ... Deliaca chromatografia na očkovanej fáze (variant s normálnou fázou).

http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

o normálna fáza Vo variante deliacej kvapalinovej chromatografie sa ako modifikátory povrchu silikagélu (štepené fázy) používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupiny atď. Použitie očkovaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) naočkované na povrch sorbentu (obr.). Menej často sa používa variant kvapalinovej chromatografie s fázami na nosiči, keď sa na stacionárny nosič nanáša kvapalná stacionárna fáza.

Ryža. ... Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s obrátenými fázami). http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

Deliaca kvapalinová chromatografia zahŕňa extrakčná kvapalina chromatografia, v ktorom je stacionárnou fázou organický extraktant nanesený na pevnom nosiči a mobilnou fázou je vodný roztok zlúčenín, ktoré sa majú separovať. Ako extrakčné činidlá sa používajú napríklad fenoly, trialkylfosfáty, amíny, kvartérne amóniové zásady, ako aj organofosforové zlúčeniny obsahujúce síru. Extrakčná kvapalinová chromatografia sa používa na separáciu a koncentráciu anorganických zlúčenín, napríklad iónov alkalických kovov, aktinoidov a iných prvkov s podobnými vlastnosťami, pri spracovaní vyhoreného jadrového paliva.

iónomeničová chromatografia,

iónomeniče.

katiónové výmenníky

anionity.

amfotérne iónomeniče

amfolyty

Ionit

Výmenník katiónov

anionity

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (výmena katiónov)

R-OH + Na + + Сl - → R-Сl + Na + + OH - (výmena aniónov)

Iónomeniče musia spĺňať nasledovné požiadavky: byť chemicky stabilné v rôznych prostrediach, mechanicky pevné v suchom a najmä napučanom stave, majú vysokú absorpčnú schopnosť a schopnosť dobre sa regenerovať.

Pri iónovo-výmennej (iónovej) chromatografii sa separované anióny (katióny) detegujú ako kyseliny (zodpovedajúce zásady) vysoko citlivým konduktometrickým detektorom, kde sú vysokovýkonné kolóny naplnené povrchovo aktívnym iónomeničom s malou kapacitou.

iónová párová chromatografia

chromatografia na výmenu ligandov

rozdielna schopnosť separovaných zlúčenín vytvárať komplexy s katiónmi prechodných kovov

rozmerovo vylučovacia chromatografia

rozdiely vo veľkosti molekúl

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" right "width =" 429 "height =" 319 ">

Ryža. Schéma gélovej permeačnej chromatografie

afinitná chromatografia

Ryža. Schéma afinitnej chromatografie

http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

Potom sa z polyméru odstráni prechodom roztoku zlúčeniny s ešte väčšou afinitou k makromolekule. Takáto chromatografia je obzvlášť účinná v biotechnológii a biomedicíne na izoláciu enzýmov, proteínov, hormónov.

Záleží na na spôsobe prepravy látky rozlišujú sa tieto možnosti kvapalinovej chromatografie: expresívne, frontálne a posunutie.
Najčastejšie používané expresívne variant, v ktorom sa časť zmesi, ktorá sa má separovať, zavádza do kolóny v prúde eluentu. Výťažok zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme ako píky. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "width =" 291 "height =" 165 ">

Ryža. Schéma vyvíjacieho variantu chromatografie

Výška alebo oblasť vrcholu charakterizuje koncentrácia komponentov, a držané zväzkov – kvalitatívne zloženie zmesi... Komponenty sa zvyčajne identifikujú podľa zhody retenčných časov so štandardnými látkami, používajú sa aj chemické alebo fyzikálno-chemické metódy.

o čelný Vo variante (obr.) kolónou kontinuálne prechádza zmes separovaných látok, ktorá plní úlohu mobilnej fázy. Výsledkom je, že len látka, ktorá je najmenej sorbovaná v kolóne, môže byť získaná v čistej forme.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "width =" 279 "height =" 145 ">

Ryža. Schéma frontálnej chromatografie

Chromatogram v tomto prípade predstavuje stupne, ktorých výšky sú úmerné koncentráciám zložiek; retenčné objemy sú určené retenčným časom zložiek. Pri diferenciácii takého chromatogramu sa získa obraz, ktorý je podobný obrazu získanému vo vyvolávacej verzii.

V posunutie V jednom variante sú zložky zmesi zavedené do kolóny vytesnené eluentom, ktorý je adsorbovaný silnejšie ako ktorákoľvek zložka. V dôsledku toho sa získajú susediace frakcie látok, ktoré sa majú oddeliť, Poradie uvoľňovania zložiek je určené silou ich interakcie s povrchom sorbentu (obr.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "width =" 320 "height =" 175 ">

Ryža. Schéma vytesňovacej chromatografie

3. Základné chromatografické veličiny a ich stanovenie.

Pri separácii látok pomocou kvapalinovej chromatografie sa môžu použiť vyvolávacie, čelné a vytesňovacie varianty, ako je uvedené vyššie. Najčastejšie sa používa vyvolávacia verzia, pri ktorej sa časť zmesi, ktorá sa má oddeliť, zavádza do kolóny v prúde eluentu. Výťažok zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme ako píky. Z chromatogramu (obr.) určte:

retenčné časy neabsorbovateľných (t0), separovaných zložiek (tR1, tR2, tR3 atď.); šírka základne vrcholov (tw1, tw2 atď.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "width =" 61 "height =" 24 src = ">;

b) korigovaný objem držania komponentov ,

kde t "R - opravený retenčný čas komponentu;

c) pomer kapacity kolóny k danej zložke ;

d) účinnosť kolóny vyznačujúce sa tým počet ekvivalentných teoretických etáp

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "width =" 129 "height =" 51 src = ">;

f) povolenie https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "width =" 203 výška = 51 "height =" 51 ">

Kapacitný faktor k " má významný vplyv na hodnotu R S: na zmenu k"od 0 do 10 (optimálne limity) R S silne rastie. Význam k " je určená zdvojeným povrchom sorbentu a jeho množstvom v kolóne, ako aj konštantou adsorpčnej rovnováhy (Henryho konštanta).

Koeficient selektivity α je určená rozdielom v adsorpčných rovnovážnych konštantách dvoch oddelených zložiek. So zvyšujúcim sa α (od 1 do ~ 5) R S sa prudko zvyšuje, s ďalším zvýšením α - sa mení len málo. Selektivita kolóny závisí od faktorov, ako je chemická štruktúra povrchu sorbentu, zloženie eluentu, teplota kolóny a štruktúra zlúčenín, ktoré sa majú separovať. Keďže sorpcia chromatografovaných látok v kvapalinovej chromatografii je určená párovou interakciou troch hlavných zložiek systému – sorbentu, látok, ktoré sa majú separovať, a eluentu, je zmena zloženia eluentu vhodným spôsobom optimalizácie separačný proces.

Účinnosť stĺpca závisí od veľkosti častíc a štruktúry pórov adsorbenta, od rovnomernosti náplne kolóny, viskozity eluentu a rýchlosti prenosu hmoty. Predĺženie kolóny nie vždy vedie k zlepšeniu separácie, pretože odpor kolóny sa zvyšuje, tlak eluentu na vstupe a čas experimentu sa zvyšujú a citlivosť a presnosť analýzy klesá v dôsledku rozšírenia píku analyzovanej zložky. . Ak, potom sú píky týchto dvoch látok na chromatograme takmer úplne oddelené. S rastom R S sa zvyšuje doba separácie. o R S < 1 - oddelenie je nevyhovujúce. Pri preparatívnej chromatografii v spojení so zavádzaním relatívne veľkého množstva separovaných látok sa kolóna prevádzkuje s preťažením. Tým sa znižuje kapacitný pomer, zvyšuje sa výška ekvivalentná teoretickej platni, čo vedie k zníženiu rozlíšenia.

4. Adsorbenty

Chromatografická separácia zmesi bude účinná, ak sa správne vyberie adsorbent a rozpúšťadlo (eluent).

Adsorbent by nemal chemicky interagovať s oddelenými zložkami, mal by vykazovať katalytický účinok na rozpúšťadlo. Je tiež potrebné, aby bol adsorbent selektívny vzhľadom na zložky zmesi. Správne zvolené vysúšadlo musí mať maximálnu nasiakavosť.

Rozlišovať polárny (hydrofilný) a nepolárne (hydrofóbne) adsorbenty... Malo by sa pamätať na to, že adsorpčná afinita polárnych látok k polárnym sorbentom je oveľa vyššia ako afinita nepolárnych.

Ako adsorbenty sa používajú oxid hlinitý, aktívne uhlie, silikagél, zeolity, celulóza a niektoré minerály.

Oxid hlinitýAl2O3 – amfotérny adsorbent(obr.) Na ňom zmesi je možné oddeliť látky v pol a v nepolárnych rozpúšťadlách... Neutrálny oxid hlinitý sa zvyčajne používa na chromatografiu z nevodných roztokov nasýtených uhľovodíkov, aldehydov, alkoholov, fenolov, ketónov a éterov.

Ryža. Oxid hlinitý pre chromatografiu

http: // obrázky. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktivita Al2O3 závisí od jeho vlhkosti. Najvyššiu aktivitu má bezvodý oxid hlinitý. Bežne sa berie ako jednotka. V prípade potreby môžete pripraviť oxid hlinitý s rôznym obsahom vlhkosti zmiešaním čerstvo pripraveného oxidu hlinitého s vodou (Brockmannova stupnica).

Závislosť aktivity oxidu hlinitého od obsahu vlhkosti

Napríklad Al2O3 s aktivitou 1,5-2 sa používa na separáciu uhľovodíkov; na separáciu alkoholov a ketónov - 2-3,5.

Špecifický povrch oxidu hlinitého 230-380 m2 / g.

Silikagél(hydroxylovaný alebo chemicky modifikovaný) je sušený želatínový oxid kremičitý, ktorý sa získava z presýtených roztokov kyselín kremičitých ( n Si02 m H20) pri pH > 5-6. (obr.) Pevný hydrofilný sorbent.

Ryža. Silikagél

http://www. silikagél. /

http://silikagel. ru / obrázky / askg. gif

Veľkosť častíc silikagélu v analytických kolónach je 3-10 mikrónov, v preparatívnych kolónach - 20-70 mikrónov. Malá veľkosť častíc zvyšuje rýchlosť prenosu hmoty a zlepšuje účinnosť kolóny. Moderné analytické stĺpce sú dlhé 10-25 cm. Sú naplnené silikagélom s veľkosťou častíc 5 mikrónov a umožňujú separáciu zložitých zmesí 20-30 zložiek. Keď sa veľkosť častíc zmenšuje na 3-5 mikrónov, zvyšuje sa účinnosť kolóny, ale zvyšuje sa aj jej odpor. Takže na dosiahnutie prietoku eluentu 0,5-2,0 ml/min je potrebný tlak (1-3) · 107Pa. Silikagél vydrží takýto pokles tlaku, zatiaľ čo granule polymérneho sorbentu sú elastickejšie a deformovateľnejšie. Nedávno boli vyvinuté mechanicky pevné polymérne sorbenty s makroporéznou štruktúrou s hustou sieťou, ktoré sa svojou účinnosťou približujú silikagélom. Tvar častíc sorbentu s veľkosťou 10 μm a viac nemá veľký vplyv na účinnosť kolóny, uprednostňujú sa však guľovité sorbenty, ktoré poskytujú priepustnejšiu náplň.(obr.)

Ryža. Sférický silikagél

http: // obrázky. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Vnútornou štruktúrou častice silikagélu je systém komunikačných kanálov. Na kvapalinovú chromatografiu sa používajú sorbenty s priemerom pórov 6-25 nm. Separácia kvapalinovou chromatografiou sa uskutočňuje najmä na silikagéloch modifikovaných reakciou alkyl a arylchlórsilánov alebo alkyletoxysilánov so silanolovými povrchovými skupinami. Pomocou takýchto reakcií sa navrúbľujú skupiny C8H17-, C18H37- alebo C6H5- (na získanie sorbentov s hydrofobizovaným povrchom), nitrilové, hydroxylové skupiny atď. (obr.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "width =" 166 "height =" 116 src = ">

Ryža. Upravená štruktúra silikagélu

Silikagély používané v chromatografii na separáciu zmesí ropných produktov, vyš mastné kyseliny, ich estery, aromatické amíny, nitroderiváty Organické zlúčeniny. Silikagél – hydrofilný sorbent, ľahko zmáčateľné vodou. Preto sa nemôže použiť na sorpciu z vodných roztokov. Aktivita silikagélu závisí od obsahu vody: čím menej vody obsahuje, tým väčšia je aktivita (Brockmannova stupnica).

Závislosť aktivity silikagélu od obsahu vlhkosti

Špecifický povrch silikagélu je 500-600 m2 / g.

Aktívne uhlie sú formou uhlíka, ktorá sa počas spracovania stáva extrémne poréznou a získava veľmi veľký povrch pre adsorpciu alebo chemické reakcie.(obr.) Majú špecifický povrch 1300-1700 m2/g.

Ryža. Aktívne uhlie

http: // elektronický katalóg. rusbiznis. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

Hlavný vplyv na štruktúru pórov aktívneho uhlia majú východiskové suroviny na ich výrobu. Aktívne uhlie na báze kokosových škrupín sa vyznačujú väčším podielom mikropórov (do 2 nm), na báze uhlia - väčším podielom mezopórov (2-50 nm). Veľký podiel makropórov je charakteristický pre aktívne uhlie na báze dreva (viac ako 50 nm). Mikropóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu malých molekúl a mezopóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu väčších organických molekúl.

Zeolity (molekulárne sitá)- porézne kryštalické hlinitokremičitany alkalických kovov a kovov alkalických zemín prírodného a syntetického pôvodu. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "width =" 211 výška = 211 "height =" 211 ">

Ryža. zeolity

http://www. zeolit. spb. ru / _img / _36 mm. jpg

http: // kntgroup. ru / palec. php? súbor = / uploads / produkty / 6.jpg & x_width = 250

Existujú štyri typy zeolitov (A, X, Y, M) s rôznymi kryštálovými štruktúrami. V závislosti od katiónu sú zeolity označené nasledovne: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Vlastnosti zeolitov je to? póry kryštálov majú veľkosť rádovo 0,4-1 nm, zodpovedajúcu veľkosti molekúl veľa kvapalných alebo plynných látok. Ak sú molekuly látky schopné preniknúť do týchto pórov, dochádza k adsorpcii v póroch kryštálov zeolitu. Väčšie molekuly látky nie sú adsorbované. Výberom zeolitov s rôznou veľkosťou pórov je možné jasne oddeliť zmesi rôznych látok.

Špecifický povrch zeolitov je 750-800 m2 / g.

Pri výbere adsorbenta je potrebné vziať do úvahy štruktúru látok a ich rozpustnosť. Napríklad nasýtené uhľovodíky sa adsorbujú zle, zatiaľ čo nenasýtené (majú dvojité väzby) sa adsorbujú lepšie. Funkčné skupiny zvyšujú adsorpčnú kapacitu látky.

5. Eluenty

Pri výbere rozpúšťadla (eluentu) je potrebné vziať do úvahy povahu adsorbenta a vlastnosti látok v zmesi, ktorá sa má oddeliť. Eluenty by mali dobre rozpúšťať všetky zložky chromatografovanej zmesi, mať nízku viskozitu, poskytovať požadovanú úroveň selektivity, byť lacné, netoxické, inertné a kompatibilné s detekčnými metódami (napríklad benzén nemožno použiť ako eluent s UV detektor).

Chromatografia na normálnej fáze zvyčajne používa uhľovodíky (hexán, heptán, izooktán, cyklohexán) s prídavkom malého množstva chloroformu CHCl3, izopropanol izo-C3H7OH, diizopropyléter; v chromatografii na reverznej fáze - zmes vody s acetonitrilom CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxán, tetrahydrofurán, dimetylformamid. Aby sa izolovali jednotlivé zložky zmesi, oddelené počas chromatografie, často sa postupne vymývajú (eluujú). Na tento účel sa používajú rozpúšťadlá s rôznymi desorpčnými kapacitami. Rozpúšťadlá sú v polárnych adsorbentoch usporiadané v klesajúcom poradí podľa desorpčnej kapacity - eluotropná séria Trappe... Ak zložky zmesi, ktorá sa má oddeliť, majú blízke hodnoty k "( pomer kapacity kolóny vzhľadom na danú zložku), potom chromatografia s jedným eluentom. Ak sú jednotlivé zložky zmesi silne zadržané sorbentom, použije sa séria eluentov so zvyšujúcou sa silou.

Eluotropný rozsah rozpúšťadiel

6. Zariadenie na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú zariadenia rôzneho stupňa zložitosti - od najjednoduchších systémov až po chromatografy vysokej triedy.
Súčasťou moderného kvapalinového chromatografu sú: nádoby na eluenty, vysokotlakové čerpadlá, dávkovač, chromatografická kolóna, detektor, záznamové zariadenie, riadiaci systém a matematické spracovanie výsledkov.

Na obr. predstavuje blokovú schému kvapalinového chromatografu obsahujúceho minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "width =" 361 "height =" 254 src = ">

Ryža. Schéma kvapalinového chromatografu: 1- zásobník na mobilnú fázu, 2- čerpadlo, 3- injektor, 4- kolóna, 5- termostat, 6- detektory, 7- záznamový systém, 8- počítač.

Zásobník pre mobilnú fázu, musí mať dostatočnú kapacitu na analýzu a zariadenie na odplyňovanie rozpúšťadla aby sa vylúčila tvorba bublín plynov rozpustených v eluente v kolóne a detektore.

Pumpa zamýšľané aby sa vytvoril konštantný tok rozpúšťadla... Jeho dizajn je primárne určený prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú čerpadlá typu piest (striekačky). Ich nevýhodou je nutnosť periodických prestávok pri plnení eluentom. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa používajú lacné peristaltické čerpadlá. Eluenty vstupujú do čerpadla cez filter, ktorý zadržiava prachové častice (viac ako 0,2 mikrónu). Niekedy cez eluenty prechádza malý prúd hélia, aby sa odstránil rozpustený vzduch a zabránilo sa tvorbe bublín v detektore (najmä v prípade vodných a polárnych eluentov). V analytických chromatografoch sa na dodávanie eluentu do kolóny používajú piestové čerpadlá so spätnoväzbovým systémom, ktoré umožňujú vyhladenie pulzácie prietoku v rozmedzí 1–2 % a poskytujú objemové rýchlosti od 0,1 do 25 ml/min pri tlakoch až ~ 3,107 Pa. Pri mikrokolónovej chromatografii sú objemové prietoky eluentu oveľa nižšie - 10-1000 μl / min. V prípade gradientovej elúcie sa používa niekoľko čerpadiel, ktoré sú riadené programátorom a dodávajú 2-3 zložky eluentu do zmiešavacej komory, pričom celkový prietok zostáva konštantný. Na vstreknutie vzorky do kolóny pod vysokým tlakom bez zastavenia prietoku použite špeciálne mikrodávkovacie kohútiky pripojené k slučke so známym objemom skúmaného roztoku. Boli vyvinuté dávkovacie systémy s automatickým odberom vzoriek a vstrekovaním vzoriek pomocou mikrodávkovacích ventilov alebo striekačiek.

Injektor poskytuje vstrekovanie vzorky zmesi zložky, ktoré sa majú rozdeliť do kolóny s dostatočne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché systémy odberu vzoriek so zastavením prietoku vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako dávkovače Reodyne so slučkou.

Reproduktory pre HPLC sa najčastejšie vyrábajú z leštenej nerezovej rúrky s dĺžkou 10-25 cm a vnútorným priemerom 3-5 mm.

Ryža. Chromatografické kolóny pre kvapalinovú chromatografiu

Tiež použiť sklenené stĺpy umiestnené v kovovom obale; v mikrostĺpcovej chromatografii - tlačené kovové stĺpy s vnútorným priemerom 1,0-1,5 mm, tlačené sklenené mikrokolóny s priemerom 70-150 mikrónov a duté kapilárne stĺpce s priemerom 10-100 mikrónov; v preparatívnej chromatografii - kolóny s priemerom 2 až 10 cm a viac. Na rovnomerné a husté plnenie kolón sorbentom sa používa metóda suspenzného balenia. Suspenzia sa pripravuje zo sorbentu a vhodnej organickej kvapaliny, ktorá sa privádza pod tlakom do 5 × 107 Pa do kolóny. Na určenie oddelených zložiek opúšťajúcich kolónu použitie detektory. Teplotná stálosť poskytnuté termostat.

Detektory pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej je kontinuálne meranie akejkoľvek vlastnosti prúdiaceho eluentu. Musia byť veľmi citlivé. Na zvýšenie citlivosti detektora sa niekedy používa derivatizácia zložiek zmesi za kolónou. Na tento účel sa s prúdom eluentu zavádzajú také činidlá, ktoré pri interakcii s oddelenými látkami tvoria deriváty s výraznejšími vlastnosťami, napríklad silnejšie absorbujú v UV alebo viditeľnej oblasti spektra alebo majú väčšiu fluorescenčná schopnosť. Niekedy sa derivatizácia uskutočňuje pred chromatografickou analýzou a skôr sa oddeľujú deriváty ako východiskové materiály. Najobľúbenejšie typy detektory všeobecné účely sú refraktometre meranie index lomu a spektrofotometrické detektory definovanie optická hustota rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). TO výhody refraktometrov(a nevýhody spektrofotometrov) treba pripísať nízka citlivosť na typ spojenia, ktoré môžu alebo nemusia obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla v tomto prípade nie je možné.

Diferenciálny "href =" / text / kategória / diferenčný / "rel =" záložka "> diferenciálny zosilňovač a záznamník. integrátor, ktorý umožňuje vypočítať relatívne plochy výsledných píkov. Použitie komplexných chromatografických systémov jednotka rozhrania prepojenie chromatografu s osobný počítač, ktorá vykonáva nielen zber a spracovanie informácií, ale tiež riadi zariadenie, vypočítava kvantitatívne charakteristiky a v niektorých prípadoch aj kvalitatívne zloženie zmesí. Mikroprocesor poskytuje automatické vstrekovanie vzorky, zmeniť o daný program zloženia eluentu s gradientovou elúciou, udržiavanie teplota kolóny.

Bruker“. Ryža. Kvapalinový chromatograf Jasco

Samotestovacie otázky

Čo je kvapalinová chromatografia? Vymenujte jeho typy, oblasti použitia. Zoznam o Hlavné chromatografické veličiny a ich stanovenie Aké typy kvapalinovej chromatografie existujú v závislosti od mechanizmu retencie separovaných látok stacionárnou fázou LC? Aké typy chromatografie existujú v závislosti od spôsobu prepravy látky? Aké látky sa používajú ako adsorbenty? V čom je rozdiel? Čo slúži ako tekutá mobilná fáza – eluent? Požiadavky na rozpúšťadlá. Aký je rozdiel medzi deliacou chromatografiou a adsorpčnou chromatografiou? Uveďte hlavné časti okruhu kvapalinového chromatografu, ich účel.

Zoznam použitej literatúry

1 "Kvapalinová chromatografia v medicíne"

Http: // denník. issep. rssi. ru / články / pdf / 0011_035.pdf

2 „Úvod do metód vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie“

Http: // www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

3 "Kvapalinová chromatografia"

Http: // e-science. ru / index /? id = 1540

4 "Chromatografia"

Http: // belchem. narod. ru / chromatografia1.html

V HPLC sa ako mobilné fázy zvyčajne používajú čisté rozpúšťadlá alebo ich zmesi.

Na vytvorenie prúdu čistého rozpúšťadla (alebo zmesí rozpúšťadiel), ktorý sa v kvapalinovej chromatografii nazýva eluent, sa v hydraulickom systéme chromatografu používajú čerpadlá.

nedostatočná mechanická pevnosť, ktorá neumožňuje balenie a použitie pri zvýšených tlakoch typických pre HPLC;

silikagél má v porovnaní s oxidom hlinitým širší rozsah pórovitosti, plochy povrchu a priemeru pórov; výrazne vyššia katalytická aktivita oxidu hlinitého vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie.

HPLC detektory

Detektory:

Fluorescenčný detektor. Veľká obľuba fluorescenčných detektorov je spôsobená veľmi vysokou selektivitou a citlivosťou a tým, že mnohé látky znečisťujúce životné prostredie fluoreskujú (napríklad polyaromatické uhľovodíky).

Elektrochemický detektor sa používajú na detekciu látok, ktoré sa ľahko oxidujú alebo redukujú: fenoly, merkaptány, amíny, aromatické nitro- a halogénderiváty, ketónaldehydy, benzidíny.

Detektory. Registrácia výstupu z kolóny samostatného komponentu sa vykonáva pomocou detektora. Na registráciu môžete použiť zmenu akéhokoľvek analytického signálu prichádzajúceho z mobilnej fázy a súvisiaceho s povahou a množstvom zložky zmesi. V kvapalinovej chromatografii sa využívajú analytické signály ako absorpcia svetla alebo emisia svetla výstupného roztoku (fotometrické a fluorometrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivosť (elektrochemické detektory) atď.

Úvod.

Prudký rozvoj kvapalinovej chromatografie za posledných 10 rokov je spôsobený najmä intenzívnym rozvojom teoretických základov a praktickým využívaním jej vysoko účinnej verzie, ako aj tvorbou a priemyselnou výrobou potrebných sorbentov a zariadení.

Charakteristickým znakom vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) je použitie sorbentov s veľkosťou zŕn 3-10 mikrónov, ktoré poskytujú rýchly prenos hmoty s veľmi vysokou separačnou účinnosťou.

V súčasnosti je HPLC na vrchole z hľadiska rýchlosti vývoja medzi inštrumentálnymi metódami a prekonáva dokonca aj plynovú chromatografiu. Najdôležitejšou výhodou HPLC oproti plynovej chromatografii je schopnosť študovať takmer akýkoľvek objekt bez akýchkoľvek obmedzení ich fyzikálno-chemických vlastností, napríklad bodov varu alebo molekulovej hmotnosti.

Dnes je HPLC dobre definovaná inštrumentálna metóda, ktorá je široko používaná v rôznych oblastiach vedy a techniky. Je obzvlášť dôležitá v takých kritických oblastiach, ako je biochémia, molekulárna biológia, kontrola znečistenia životného prostredia, ako aj v chemickom, petrochemickom, potravinárskom a farmaceutickom priemysle.

pretože je potrebné vziať do úvahy množstvo veľmi špecifických požiadaviek v dôsledku nasledujúcich vlastností techniky.

a. HPLC kolóny sú naplnené médiom s veľmi malým priemerom častíc. V dôsledku toho vzniká na kolóne vysoký tlak pri objemových rýchlostiach rozpúšťadla, ktoré sú potrebné na rýchle oddelenie vzorky.

b. HPLC detektory sú citlivé na kolísanie prietoku eluentu a tlaku (šum). Navyše pri použití detektorov koncentrácie je potrebná ešte vyššia stabilita objemovej rýchlosti eluentu.

v. Proces chromatografickej separácie je sprevádzaný množstvom antagonistických efektov, napríklad disperzia vzorky v mobilnej fáze vedie k zmiešaniu separovaných zložiek a znižuje maximálnu koncentráciu látky v eluovanom píku (v detektore). Disperzia sa pozoruje vo všetkých častiach systému od bodu vstrekovania až po detektor.

d) Rozpúšťadlá pôsobiace ako mobilná fáza sú často korozívne pre zariadenia. To platí predovšetkým pre rozpúšťadlá používané v chromatografii na reverznej fáze, ktorá je preferovaná v biochemických aplikáciách HPLC.

Pri vývoji, vytváraní a prevádzke týchto systémov sa musí brať do úvahy špecifickosť HPLC ako inštrumentálnej techniky. Vytvorenie komerčných vzoriek chromatografických systémov a ich komponentov, ktoré sú dostatočne spoľahlivé, jednoduché a bezpečné na prácu s prijateľným pomerom medzi cenou a technickými vlastnosťami, si vyžiadalo viac ako desať rokov hľadania a výskumu. Nedávne trendy smerujúce k znižovaniu počtu stĺpcov (dĺžky aj priemeru) si vynucujú nové požiadavky na prístroje.

1.1. EFEKTÍVNOSŤASELEKTIVITA

Chromatografia je metóda separácie zložiek zmesi na základe rozdielu v ich rovnovážnom rozdelení medzi dve "nemiešateľné fázy, z ktorých jedna je stacionárna a druhá je mobilná. Zložky vzorky sa pohybujú po kolóne, keď sú v mobilnej fáze a zostávajú na mieste, keď sú Čím väčšia je afinita zložky k stacionárnej fáze a čím menšia k mobilnej fáze, tým pomalšie sa pohybuje po kolóne a tým dlhšie v nej zostáva.V dôsledku rozdielu v afinite zložiek zmesi do stacionárneho a prijateľného časového obdobia zmesi do samostatných pásov (píkov) zložiek pri ich pohybe kolónou s mobilnou fázou.

Z týchto všeobecných konceptov je zrejmé, že chromatografická separácia je možná len vtedy, ak zložky vzorky vstupujúce do kolóny počas vstrekovania vzorky sa po prvé rozpustia v mobilnej fáze a po druhé budú interagovať (zadržať sa) so stacionárnou fázou... . Ak počas vstrekovania vzorky nie sú niektoré zložky vo forme roztoku, budú filtrované a nezúčastňujú sa na chromatografickom procese. Podobne zložky, ktoré neinteragujú so stacionárnou fázou, prejdú kolónou s mobilnou fázou bez toho, aby sa rozdelili na zložky.

Prijmime podmienku, že niektoré dve zložky sú rozpustné v mobilnej fáze a interagujú so stacionárnou fázou, to znamená, že chroiatografický proces môže prebiehať bez porúch. V tomto prípade je možné po prechode zmesi cez kolónu získať chromatogramy formy a, b alebo v(obr. 1.1). Tieto chromatogramy ilustrujú chromatografické separácie, ktoré sa líšia účinnosťou. (a a b) s rovnakou selektivitou a selektivitou (b a v) s rovnakou účinnosťou.

Čím je kolóna efektívnejšia, tým užší pík sa získa pri rovnakom retenčnom čase. Účinnosť kolóny sa meria počtom teoretických poschodí (PTT) N: čím vyšší je ef-

Ryža. 1.2. Parametre chromatografického píku a výpočet počtu teoretických poschodí:

t R - retenčný čas píku; h - výška vrcholu; Wj / j - šírka píku v polovičnej výške

Ryža. 1.1. Typ chromatogramu v závislosti od účinnosti a selektivity kolóny:

a- konvenčná selektivita, znížená účinnosť (menej teoretických etáp); b - konvenčná selektivita a účinnosť; v - konvenčná účinnosť, zvýšená selektivita (väčší pomer retenčných časov komponentov)

účinnosť, čím väčšia je FTT, tým menšia je expanzia píku pôvodne úzkeho pásma pri prechode kolónou, tým užší je pík na výstupe z kolóny. PTT charakterizuje počet stupňov na vytvorenie rovnováhy medzi mobilnou a stacionárnou fázou.

Poznať počet teoretických poschodí na kolónu a dĺžku kolóny L (μm), ako aj stredný priemer zŕn sorbentu d c (μm), je ľahké získať hodnoty výšky ekvivalentnej teoretickej úrovni (VETT), ako aj zníženej výšky ekvivalentnej teoretickej úrovni (PVETT):

HETT = L/ N

PVETT = B3TT / d c.

S hodnotami PTT, HETT a PVETT je možné jednoducho porovnať účinnosť kolón rôznych typov, rôznych dĺžok, naplnených sorbentmi rôzneho charakteru a zrnitosti. Porovnaním CTT dvoch stĺpcov rovnakej dĺžky sa porovnáva výkon. Pri porovnávaní HETT sa porovnávajú kolóny so sorbentmi rovnakej zrnitosti a rôznych dĺžok. Nakoniec, hodnota PVETT umožňuje pre ktorékoľvek dve kolóny posúdiť kvalitu sorbentu, po prvé, kvalitu plnenia kolón a po druhé, bez ohľadu na dĺžku kolón, granuláciu sorbentu podľa jej povahy.

Kolónová selektivita hrá dôležitú úlohu pri dosahovaní chromatografickej separácie.

Selektivita kolóny závisí od mnohých faktorov a zručnosť experimentátora je do značnej miery určená schopnosťou ovplyvniť selektivitu separácie. Na to má chromatograf tri veľmi dôležité faktory: výber chemickej povahy sorbentu, výber zloženia rozpúšťadla a jeho modifikátorov a zváženie chemickej štruktúry a vlastností separovaných zložiek. Niekedy má na selektivitu citeľný vplyv zmena teploty kolóny, ktorá mení distribučné koeficienty látok medzi mobilnou a stacionárnou fázou.

Pri uvažovaní o oddelení dvoch zložiek v chromatograme a jeho hodnotení je rozlíšenie dôležitým parametrom. R s, ktorý spája výstupné časy a šírky vrcholov oboch oddelených komponentov

Rozlíšenie, ako parameter charakterizujúci separáciu píkov, sa zvyšuje so zvyšovaním selektivity, čo sa prejavuje zvýšením čitateľa, a zvýšením účinnosti, ktoré sa prejavuje znížením menovateľa v dôsledku zmenšenia šírky píkov. Rýchly pokrok kvapalinovej chromatografie preto viedol k zmene pojmu „vysokotlaková kvapalinová chromatografia“ – nahradila ju „kvapalinová chromatografia s vysokým rozlíšením“ (pričom skrátená forma výrazu v angličtine zostala HPLC ako najsprávnejšie charakterizujúce smer vývoja modernej kvapalinovej chromatografie).

Tým sa znižuje rozmazávanie v kolóne a zvyšuje sa účinnosť pri použití jemnejšieho sorbentu, rovnomernejšieho zloženia (úzka frakcia), hustejšieho a rovnomernejšieho uloženia v kolóne, použitia tenších vrstiev naočkovanej fázy, menej viskóznych rozpúšťadiel a optimálneho prietoku sadzby.

Spolu s rozmazaním pásu chromatografickej zóny pri separačnom procese v kolóne však môže dôjsť aj k jeho rozmazaniu v zariadení na zavádzanie vzorky, v spojovacích kapilárach injektor - kolóna a kolóna - detektor, v detektorovej cele a v niektoré pomocné zariadenia (mikrofiltre na zachytávanie mechanických častíc zo vzoriek inštalovaných za injektorom, ochranné kolóny, špirálové reaktory atď.) - Čím väčší je objem mimo kolóny v porovnaní s objemom retenčného vrcholu, tým väčší je rozmaz. Záleží tiež na tom, kde sa mŕtvy objem nachádza: čím užšie je chromatografické volanie, tým väčšie rozmazanie poskytne mŕtvy objem. Preto je potrebné venovať osobitnú pozornosť konštrukcii tej časti chromatografu, kde je chromatografická zóna najužšia (injektor a zariadenia od injektora po kolónu) – tu je najnebezpečnejšia a najsilnejšie pôsobí extrakolónová erózia. Aj keď sa predpokladá, že v dobre navrhnutých chromatografoch by mali byť zdroje dodatočného extrakolónového riedenia minimalizované, napriek tomu každé nové zariadenie, každá zmena chromatografu musí nevyhnutne skončiť testovaním na kolóne a porovnaním získaného chromatogramu s pasovým. Ak sa pozoruje špičkové skreslenie, prudký pokles účinnosti, novozavedené kapiláry a ďalšie zariadenia by sa mali starostlivo skontrolovať.

Vymývanie mimo kolóny a nesprávny výpočet môže viesť k významnej (viac ako 50 %) strate účinnosti, najmä v prípadoch, keď sa pokúšajú použiť relatívne dlhodobé chromatografy na vysokorýchlostnú HPLC, mikrokolónovú HPLC a iné moderné možnosti HPLC, ktoré vyžadujú mikroinjektory. , prepojovacie kapiláry s vnútorným priemerom minimálnej dĺžky 0,05-0,15 mm, kolóny s kapacitou 10-1000 μl, detektory s mikrokyvetami s kapacitou 0,03-1 μl as vysokorýchlostnými, vysokorýchlostné zapisovače a integrátory.

1.2. ZADRŽANIE A SILA ROZPÚŠŤADLA

Aby sa analyty separovali na kolóne, ako je uvedené vyššie, kapacitný faktor k" musí byť väčšia ako 0, t.j. látky musia byť zadržiavané stacionárnou fázou, sorbentom. Kapacitný faktor by však nemal byť príliš vysoký, aby sa dosiahol prijateľný čas elúcie. Ak sa pre danú zmes látok zvolí stacionárna fáza, ktorá ich zadrží, potom ďalšia práca na vývoji analytickej metódy spočíva vo výbere rozpúšťadla, ktoré by v ideálnom prípade poskytovalo pre všetky zložky rozdielne, ale prijateľne málo veľký k". To sa dosiahne zmenou elučnej sily rozpúšťadla.

Pri adsorpčnej chromatografii na silikagéli alebo oxide hlinitom sa spravidla sila dvojzložkového rozpúšťadla (napríklad hexán s prídavkom izopropanolu) zvyšuje zvýšením obsahu polárnej zložky (izopropanol), príp. znížená znížením obsahu izopropanolu. Ak je polárna zložka príliš malá (menej ako 0,1 %), mala by sa nahradiť zložkou so slabšou elučnou silou. To isté sa urobí, pričom sa nahradí buď polárna alebo nepolárna zložka inými, a v prípade, že daný systém neposkytuje požadovanú selektivitu vzhľadom na zložky zmesi, o ktoré je záujem. Pri výbere systémov rozpúšťadiel sa berie do úvahy tak rozpustnosť zložiek zmesi, ako aj eluotropné série rozpúšťadiel zostavené rôznymi autormi.

Približne rovnakým spôsobom sa volí sila rozpúšťadla v prípade použitia očkovaných polárnych fáz (nitril, amino, diol, nitro atď.), pričom sa berú do úvahy možné chemické reakcie a vylúčenie rozpúšťadiel nebezpečných pre fázu (napr. ketóny pre amino fázu).

V prípade chromatografie na reverznej fáze sa sila rozpúšťadla zvyšuje zvýšením obsahu organickej zložky (metanol, acetonitril alebo THF) v eluente a znižuje sa pridaním väčšieho množstva vody. Ak nie je možné dosiahnuť požadovanú selektivitu, použite inú organickú zložku alebo ju skúste zmeniť pomocou iných prísad (kyseliny, iónové párové činidlá atď.).

Pri separáciách iónomeničovou chromatografiou sa sila rozpúšťadla mení zvýšením alebo znížením koncentrácie tlmivého roztoku alebo zmenou pH, v niektorých prípadoch sa používa modifikácia organickými látkami.

Najmä v prípade zložitých prírodných a biologických zmesí však často nie je možné zvoliť silu rozpúšťadla tak, aby sa všetky zložky vzorky eluovali v primeranom čase. Potom je potrebné pristúpiť k gradientovej elúcii, teda použiť rozpúšťadlo, ktorého elučná sila sa počas analýzy mení tak, že sa neustále zvyšuje podľa vopred určeného programu. Táto technika umožňuje dosiahnuť elúciu všetkých zložiek komplexných zmesí v relatívne krátkom čase a ich rozdelenie na zložky vo forme úzkych píkov.

1.3. VEĽKOSŤ ČASTÍC SORBENTU, PRIEPUSTNOSŤ A ÚČINNOSŤ

Pri zvažovaní rozmazania kolóny sme naznačili, že účinnosť kolóny (HETP) závisí od veľkosti častíc sorbentu. Rýchly rozvoj HPLC za posledných 10-12 rokov bol do značnej miery spôsobený predovšetkým vývojom metód získavania sorbentov s veľkosťou častíc 3 až 10 μm a s úzkym frakčným zložením, ktoré poskytujú vysokú účinnosť s dobrou priepustnosťou a po druhé vývojom metód plnenia kolón týmito sorbentmi a po tretie vývojom a sériovou výrobou kvapalinových chromatografov s vysokotlakovými čerpadlami, injektormi a detektormi s maloobjemovými kyvetami schopnými registrovať malé objemové vrcholy.

Pre dobre naplnené suspenzné kolóny môže byť teoretická ekvivalentná výška platne (PVETT) 2 bez ohľadu na to, či sa na plnenie použijú častice s veľkosťou 3, 5, 10 alebo 20 um. V tomto prípade získame kolóny (štandardne dĺžky 250 mm) s účinnosťou 41670, 25000, 12500 a 6250 tt. Zdá sa prirodzené vybrať najefektívnejšiu kolónu naplnenú 3 µm časticami. Táto účinnosť však bude na úkor veľmi vysokých tlakov a relatívne nízkych separačných rýchlostí, pretože je pravdepodobné, že existujúce čerpadlo bude schopné pumpovať rozpúšťadlo cez takúto kolónu vysokou priestorovou rýchlosťou. Tu práve stojíme pred otázkou vzťahu medzi veľkosťou častíc sorbentu, účinnosťou a priepustnosťou kolón.

Ak z toho vyjadríme súčiniteľ odporu stĺpca - bezrozmernú veličinu, dostaneme nasledujúcu rovnicu:

Faktor odporu pre kolóny naplnené mikročasticami rovnakého typu pri použití rovnakej metódy sa nevýznamne mení a dosahuje nasledujúce hodnoty:

Typ častice „.... Nepravidelný sférický

formulár formulára

Suché balenie. ... ... ... ... 1000-2000 800-1200

Závesné balenie. ... ... 700-1500 500-700

Vstupný tlak kolóny je úmerný lineárnemu prietoku, faktoru odporu kolóny, viskozite rozpúšťadla a dĺžke kolóny a je nepriamo úmerný druhej mocnine priemeru častíc.

Aplikovaním tejto závislosti pre vyššie uvedené kolóny s časticami s priemerom 3, 5, 10 a 20 μm a za predpokladu konštantného lineárneho prietoku, faktora odporu kolóny a viskozity rozpúšťadla dostaneme pre kolóny rovnakej dĺžky pomer vstupného tlaku 44:16: 4:1. Teda, ak pre sorbent s reverznou fázou s veľkosťou častíc 10 mikrónov pri použití rozpúšťadlových systémov metanol -. voda (70:30), zvyčajne na štandardnej kolóne pri prietoku rozpúšťadla 1 ml / min, tlak na vstupe do kolóny je 5 MPa, potom pre častice 5 μm - 20 MPa a pre 3 μm - 55 MPa . Pri použití silikagélu a menej viskózneho rozpúšťadlového systému hexán - izopropanol (100: 2) budú hodnoty výrazne nižšie: 1, 4 a 11 MPa. Ak je v prípade sorbentu s reverznou fázou použitie častíc s veľkosťou 3 μm veľmi problematické a 5 μm je možné, ale nie na všetkých zariadeniach, potom pre sorbent s normálnou fázou nie sú problémy s tlak. Je potrebné poznamenať, že moderná vysokorýchlostná HPLC sa vyznačuje vyššou spotrebou rozpúšťadiel ako vo vyššie uvedenom príklade, preto sa požiadavky na tlak ešte zvyšujú.

Avšak v prípadoch, kde separácia vyžaduje určitý počet teoretických poschodí a je žiaduce vykonať vysokorýchlostnú analýzu, sa obraz trochu zmení. Keďže dĺžky kolón so sorbentmi so zrnitosťou 3, 5, 10 mikrónov s rovnakou účinnosťou budú 7,5; 12,5 a 25 cm, potom sa pomer tlakov na vstupe do kolón zmení na 3:2:1. V súlade s tým bude trvanie analýzy na takýchto stĺpcoch s rovnakou účinnosťou korelované ako 0,3 : 0,5 : 1, t.j. pri prechode z 10 na 5 a 3 μm sa trvanie analýzy skráti 2 a 3,3 krát. Toto zrýchlenie analýzy prichádza za cenu úmerne vyššieho vstupného tlaku kolóny.

Uvedené údaje platia pre prípady, keď sorbenty s rôznou veľkosťou zŕn majú rovnakú krivku distribúcie veľkosti častíc, kolóny sú plnené rovnakým spôsobom a majú rovnaký faktor odporu kolóny. Treba mať na pamäti, že náročnosť získania úzkych frakcií sorbentu sa zvyšuje so zmenšujúcou sa veľkosťou častíc a to. frakcie od rôznych výrobcov majú rôzne frakčné zloženie. Preto sa faktor odporu kolóny bude meniť v závislosti od veľkosti zŕn, typu sorbentu, spôsobu plnenia kolóny atď.

KLASIFIKÁCIA METÓD HPLC PODĽA SEPARAČNÉHO MECHANIZMU

Väčšina separácií uskutočňovaných metódou HPLC je založená na zmiešanom mechanizme interakcie látok so sorbentom, ktorý zabezpečuje väčšiu alebo menšiu retenciu zložiek v kolóne. Separačné mechanizmy vo viac-menej čistej forme sú v praxi pomerne zriedkavé, napríklad adsorpčné mechanizmy pri použití absolútne bezvodého silikagélu a bezvodého hexánu na separáciu aromatických uhľovodíkov.

So zmiešaným retenčným mechanizmom pre látky rôznych štruktúr a molekulových hmotností je možné odhadnúť príspevok k retencii adsorpcie, distribúcie, exklúzie a iných mechanizmov. Pre lepšie pochopenie a pochopenie separačných mechanizmov v HPLC je však vhodné považovať separácie s prevahou jedného alebo druhého mechanizmu za patriace do určitého typu chromatografie, napríklad do iónomeničovej chromatografie.

2.1.1 ADSORPČNÁ CHROMATOGRAFIA

Separácia adsorpčnou chromatografiou sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich rozdeleniu do zón počas pohybu s mobilnou fázou pozdĺž kolóny. Oddelenie zón zložiek dosiahnuté v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Sorpcia na povrchu adsorbentu s hydroxylovými skupinami je založená na špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom adsorbentu a polárnymi (alebo polarizovateľnými) skupinami alebo oblasťami molekúl. Tieto interakcie zahŕňajú dipól-dipólovú interakciu medzi permanentnými alebo indukovanými dipólmi, tvorbu vodíkovej väzby až po tvorbu n-komplexov alebo komplexov prenosu náboja. Možným a pomerne častým v praktickej práci je prejav chemosorpcie, ktorý môže viesť k výraznému zvýšeniu retenčného času, prudkému zníženiu účinnosti, vzniku produktov rozkladu alebo nevratnej sorpcii látky.

Adsorpčné izotermy látok majú lineárny, konvexný alebo konkávny tvar. Pri lineárnej adsorpčnej izoterme je pík látky symetrický a retenčný čas nezávisí od veľkosti vzorky. Adsorpčné izotermy látok sú najčastejšie nelineárne a majú konvexný tvar, čo vedie k určitej asymetrii vrcholu s tvorbou chvosta.

Silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami pórov, povrchmi a priemermi pórov sa najčastejšie používajú v HPLC. Oxid hlinitý sa používa oveľa menej často a veľmi zriedkavo iné adsorbenty široko používané v klasickej kolónovej a tenkovrstvovej chromatografii. Hlavným dôvodom je nedostatočná mechanická pevnosť väčšiny ostatných adsorbentov, ktorá neumožňuje ich balenie a použitie pri zvýšených tlakoch typických pre vysokotlakové sušičky.

Polárne skupiny zodpovedné za adsorpciu a umiestnené na povrchu silikagélu a oxidu hlinitého majú podobné vlastnosti. Preto je poradie elúcie zmesí látok a eluotropný rozsah rozpúšťadiel pre ne zvyčajne rovnaké. Rozdiel v chemickej štruktúre silikagélu a oxidu hlinitého však niekedy vedie k rozdielom v selektivite, v tomto prípade sa uprednostňuje jeden alebo druhý adsorbent, ktorý je pre danú konkrétnu úlohu vhodnejší. Napríklad oxid hlinitý poskytuje väčšiu selektivitu pri separácii určitých viacjadrových aromatických uhľovodíkov.

Uprednostňovanie silikagélu pred oxidom hlinitým sa vysvetľuje širším výberom silikagélov z hľadiska pórovitosti, povrchu a priemeru pórov, ako aj výrazne vyššou katalytickou aktivitou oxidu hlinitého, čo často vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozklad zložiek vzorky alebo ich ireverzibilná chemisorpcia. ...

2.1.2 Nevýhody adsorpčnej chromatografie obmedzujúce jej použitie

Popularita adsorpčnej chromatografie s rozvojom metódy HPLC postupne klesala, bola čoraz viac nahrádzaná a naďalej nahrádzaná inými možnosťami, ako je HPLC na reverznej a normálnej fáze na sorbentoch s naočkovanou fázou. Aké sú nevýhody adsorpčnej chromatografie, ktoré k tomu viedli?

Predovšetkým je to dlhé trvanie procesov ekvilibrácie adsorbentov s rozpúšťadlami obsahujúcimi vodu v stopových množstvách, náročnosť prípravy takýchto rozpúšťadiel s určitým a reprodukovateľným obsahom vlhkosti. To má za následok zlú reprodukovateľnosť retenčných parametrov, rozlíšenie, selektivitu. Z rovnakého dôvodu je nemožné použiť gradientovú elúciu – návrat do východiskového stavu je taký dlhý, že výrazne prevažuje nad ziskom v čase v dôsledku použitia gradientu.

Značné nevýhody adsorbentov, najmä oxidu hlinitého, spojené s častými preskupeniami zlúčenín citlivých na katalýzu, ich rozkladom, ireverzibilnou sorpciou, sú tiež dobre známe a boli opakovane zaznamenané v literatúre. Nenávratne sorbované látky, ktoré sa hromadia na počiatočnom úseku kolóny, menia charakter sorbentu, môžu viesť k zvýšeniu odolnosti kolóny alebo až k jej úplnému upchatiu. Posledný nedostatok je možné odstrániť použitím ochranného stĺpika, ktorý na- Keď sa odpor zvyšuje a dochádza k upchávaniu, vymieňa sa za nový * alebo sa napĺňa novým sorbentom. Nevratná sorpcia, ku ktorej dochádza aj v tomto prípade, však vedie k chromatogramu, v ktorom zložky vzorky citlivé na sorpciu alebo katalytický rozklad úplne alebo čiastočne chýbajú.

2.2. DISTRIBUČNÁ CHROMATOGRAFIA

Deliaca chromatografia je variantom HPLC, pri ktorej sa separácia zmesi na zložky uskutočňuje v dôsledku rozdielu v ich distribučných koeficientoch medzi dvoma nemiešateľnými fázami: rozpúšťadlom (mobilná fáza) a fázou na sorbente (stacionárna fáza). Historicky prvé boli sorbenty tohto typu, ktoré sa získavali depozíciou kvapalných fáz (oxydipropionitril, parafínový olej a pod.) na porézne nosiče, podobne ako sa pripravovali a pripravovali sorbenty pre plynovo-kvapalinovú chromatografiu (GLC). Okamžite sa však odhalili nevýhody takýchto sorbentov, z ktorých hlavným bolo relatívne rýchle vymývanie fázy z nosiča. V dôsledku toho množstvo fázy v kolóne postupne klesalo, retenčné časy sa tiež zmenšovali a adsorpčné centrá nepokryté fázou sa objavili v počiatočnej časti kolóny, čo spôsobilo tvorbu koncov píkov. Táto nevýhoda sa riešila nasýtením rozpúšťadla deponovanou fázou ešte predtým, ako vstúpila do kolóny. Únos sa tiež znížil pri použití viskóznejších a menej rozpustných polymérnych fáz, avšak v tomto prípade sa v dôsledku difúzie z hrubých polymérnych filmov výrazne znížila účinnosť kolón.

Logické sa ukázalo navrúbľovať kvapalnú fázu na nosič chemickými väzbami tak, že sa jej strhávanie stane fyzikálne nemožné, teda premeniť nosič a fázu v jeden celok - do tzv. sorbent.

Úsilie výskumníkov v budúcnosti smerovalo k hľadaniu činidiel, ktorých štepenie by prebiehalo pomerne rýchlo a úplne a vytvorené väzby boli čo najstabilnejšie. Alkylchlórsilány a ich deriváty sa stali takými činidlami, ktoré umožnili podobnou technológiou získať vrúbľované sorbenty rôznych typov a s rôznymi polárnymi aj nepolárnymi skupinami na povrchu.

Úspešné použitie posledného typu sorbentov pre HPLC podporilo rast ich výroby u rôznych výrobcov. Každá spoločnosť vyrábala takéto sorbenty spravidla na základe vlastného typu silikagélu a podľa vlastnej technológie, ktorá zvyčajne tvorí „know-how“ výroby. Výsledkom je, že veľké množstvo sorbentov, ktoré sú chemicky pomenované úplne rovnako (napríklad silikagél s očkovaným oktadecylsilánom), má veľmi odlišné chromatografické charakteristiky. Je to spôsobené tým, že silikagél môže mať póry širšie alebo užšie, rôzny povrch, pórovitosť, jeho povrch pred očkovaním môže byť hydroxylovaný alebo nie, možno štepiť mono-, di- alebo trichlórsilány, podmienky očkovania môžu poskytnúť monomérne, polymérne resp. vrstva zmiešanej fázy, používajú sa rôzne spôsoby odstraňovania zvyškových činidiel, dodatočná deaktivácia silanolu a iných aktívnych skupín sa môže alebo nemusí použiť.

Zložitosť technológie vrúbľovacích činidiel a prípravy surovín a materiálov, jej viacstupňový charakter vedú k tomu, že aj šarže sorbentov získaných tou istou technológiou od tej istej výrobnej spoločnosti môžu mať mierne odlišné chromatografické charakteristiky. To platí najmä vtedy, keď sa takéto sorbenty používajú na analýzu viaczložkových zmesí obsahujúcich látky, ktoré sa výrazne líšia v počte a polohe funkčných skupín z hľadiska funkčnosti.

Berúc do úvahy vyššie uvedené, mali by ste sa vždy snažiť *, aby ste pri použití metódy analýzy opísanej v literatúre používali presne rovnaký sorbent a rovnaké prevádzkové podmienky. V tomto prípade je pravdepodobnosť, že dielo nebude možné reprodukovať, minimálna. Ak to nie je možné, ale odoberá sa sorbent od inej firmy s podobnou štepenou fázou, treba sa pripraviť na to, že úprava techniky bude trvať dlho. Zároveň existuje možnosť (a s tým treba počítať), že na tomto sorbente sa ani po dlhodobom vývoji nemusí dosiahnuť požadovaná separácia. Prítomnosť mnohých popísaných separačných techník na starých sorbentoch vyrábaných v literatúre z tohto dôvodu stimuluje ich ďalšiu výrobu a použitie. Avšak v tých prípadoch, keď je potrebné prejsť k vývoju originálnych metód, najmä vo vzťahu k látkam náchylným na rozklad, chemisorpciu, preskupenia, je vhodné začať pracovať na sorbentoch, ktoré boli nedávno vyvinuté a vyrobené s použitím nových, napr. vylepšené možnosti technológie. Nové sorbenty majú jednotnejšie frakčné zloženie, rovnomernejšie a úplnejšie pokrytie povrchu naočkovanou fázou a dokonalejšie finálne fázy spracovania sorbentu.

2.3. IÓNOVÁ VÝMENNÁ CHROMATOGRAFIA

Pri iónovo-výmennej chromatografii sa separácia zložiek zmesi dosahuje vďaka reverzibilnej interakcii ionizovateľných látok s iónovými skupinami sorbentu. Zachovanie elektroneutrality sorbentu je zabezpečené prítomnosťou protiiónov schopných iónovej výmeny, umiestnených v bezprostrednej blízkosti povrchu. Ión zavedenej vzorky, interagujúci s fixným nábojom sorbentu, sa vymieňa s protiiónom. Látky s rôznou afinitou k fixným nábojom sa oddeľujú na anionitoch alebo na katiónoch. Anionity majú na povrchu kladne nabité skupiny a sorbujú anióny z mobilnej fázy. Kationity obsahujú skupiny so záporným nábojom interagujúce s katiónmi.

Ako mobilná fáza sa používajú vodné roztoky solí kyselín, zásad a rozpúšťadiel ako je kvapalný amoniak, teda systémy rozpúšťadiel s vysokou dielektrickou konštantou e a veľkým sklonom k ionizácii zlúčenín. umožňujú úpravu hodnoty pH.

Pri chromatografickej separácii ióny analytu súťažia s iónmi obsiahnutými v eluente a snažia sa interagovať s opačne nabitými skupinami sorbentu. Z toho vyplýva, že iónomeničová chromatografia môže byť použitá na separáciu akýchkoľvek zlúčenín, ktoré môžu byť akýmkoľvek spôsobom ionizované. Je možné analyzovať aj neutrálne molekuly cukru vo forme ich komplexov s boritanovým iónom:

Cukor + VO 3 2 - = Cukor -VO 3 2 -.

Iónová výmenná chromatografia je nevyhnutná na separáciu vysoko polárnych látok, ktoré nie je možné analyzovať pomocou GLC bez konverzie na deriváty. Takéto zlúčeniny zahŕňajú aminokyseliny, peptidy, cukry.

Iónová výmenná chromatografia je široko používaná v medicíne, biológii, biochémii, na kontrolu životného prostredia, pri analýze obsahu liečiv a ich metabolitov v krvi a moči, pesticídov v potravinových surovinách, ako aj na separáciu anorganických zlúčenín, napr. rádioizotopy, lantanoidy, aktinidy atď. Analýza biopolymérov (proteínov, nukleových kyselín atď.), ktorá zvyčajne trvala hodiny alebo dni, pomocou iónomeničovej chromatografie prebieha za 20-40 minút s lepšou separáciou. Použitie iónomeničovej chromatografie v biológii umožnilo pozorovať vzorky priamo v biologických médiách, čím sa znížila možnosť preskupenia alebo izomerizácie, čo môže viesť k nesprávnej interpretácii konečného výsledku. Je zaujímavé použiť túto metódu na kontrolu zmien v biologických tekutinách. Použitie poréznych slabých aniónomeničov na báze silikagélu umožnilo separáciu peptidov. V

Mechanizmus iónovej výmeny možno znázorniť vo forme nasledujúcich rovníc:

na výmenu aniónov

X- + R + Y- h ->■ Y- + R + X-.

na výmenu katiónov |

X+ + R-Y + h = * Y ++ R-X+.

V prvom prípade ión vzorky X ~ súťaží s iónom mobilnej fázy Y ~ o iónové centrá R + iónomeniča a v druhom prípade katióny vzorky X + vstupujú do konkurencie s iónomeničom. ióny mobilnej fázy Y + pre iónové centrá R ~.

Prirodzene, ióny vzorky, slabo interagujúce s iónomeničom, s touto konkurenciou, budú slabo zadržané na kolóne a sú prvé, ktoré sa z nej vymyjú, a naopak, silnejšie zadržané ióny budú ako posledné. eluovať z kolóny. Zvyčajne BTqpH4Hbie interakcie neiónovej povahy vznikajú v dôsledku adsorpcie alebo vodíkových väzieb vzorky s neiónovou časťou matrice alebo v dôsledku obmedzenej rozpustnosti vzorky v mobilnej fáze. Je ťažké izolovať „klasickú“ iónovo-výmennú chromatografiu v „čistej“ forme, a preto niektorí chromatografovia vychádzajú pri iónovo-výmennej chromatografii skôr z empirických ako teoretických princípov.

Separácia konkrétnych látok závisí predovšetkým od výberu najvhodnejšieho sorbentu a mobilnej fázy. Ako stacionárne fázy v iónovo-výmennej chromatografii sa používajú iónomeničové živice a silikagély s naočkovanými ionogénnymi skupinami.

2.4. EXKLUZÍVNA CHROMATOGRAFIA

Vylučovacia chromatografia je možnosť! kvapalinová chromatografia, pri ktorej k separácii dochádza v dôsledku distribúcie molekúl medzi rozpúšťadlom vo vnútri pórov sorbentu a prúdiacim rozpúšťadlom " medzi jeho časticami.

Na rozdiel od iných možností HPLC, kde je separácia ide Vzhľadom na rôzne interakcie zložiek s povrchom sorbentu je úloha tuhého plniva pri vylučovacej chromatografii len vo vytváraní pórov určitej veľkosti a stacionárna fáza je rozpúšťadlo, ktoré tieto póry vypĺňa. Preto je použitie termínu "sorbent" na tieto plnivá do určitej miery ľubovoľné.

Základnou vlastnosťou metódy je schopnosť separovať molekuly podľa ich veľkosti v roztoku v rozsahu prakticky akejkoľvek molekulovej hmotnosti - od 10 2 do 10 8, čo ju robí nevyhnutnou pre štúdium syntetických a biopolymérov.

Tradične sa proces uskutočňovaný v organických rozpúšťadlách stále často nazýva gélová permeačná chromatografia a vo vodných systémoch - gélová filtračná chromatografia. V tejto knihe je pre obe možnosti prijatý jeden termín, ktorý pochádza z anglického „Size Exclusion“ – výnimka podľa veľkosti – a v plnej miere odráža mechanizmus procesu.

Podrobná analýza existujúcich predstáv o veľmi komplexnej teórii procesu vylučovacej chromatografie je vykonaná v monografiách.

Celkový objem rozpúšťadla v kolóne Vt (často sa to označuje ako celkový objem stĺpca, pretože Vd nezúčastňuje sa na chromatografickom procese) je súčtom objemov mobilnej a stacionárnej fázy.

Retencia molekúl vo vylučovacej kolóne je určená pravdepodobnosťou ich difúzie do pórov a závisí od pomeru veľkostí molekúl a pórov, čo je schematicky znázornené na obr. 2.15. Distribučný koeficient Ka, ako v iných variantoch chromatografie je pomer koncentrácií látky v stacionárnej a mobilnej fáze.

Keďže mobilná a stacionárna fáza majú rovnaké zloženie Kd látka, pre ktorú sú obe fázy rovnako prístupné, sa rovná jednej. Táto situácia je realizovaná pre najmenšie molekuly C (vrátane molekúl rozpúšťadla), ktoré prenikajú do všetkých pórov (pozri obr. 2.15), a preto sa kolónou pohybujú najpomalšie. Ich retenčný objem sa rovná celkovému objemu rozpúšťadla Vt-

Ryža. 2.15. Model na separáciu molekúl meraním vo veľkostnej vylučovacej chromatografii

Všetky molekuly, ktorých veľkosť je väčšia ako veľkosť pórov sorbentu, sa do nich nedostanú (úplné vylúčenie) a prejdú kanálikmi medzi časticami. Eluujú z kolóny s rovnakým retenčným objemom, ktorý sa rovná objemu mobilnej fázy V 0 - Rozdeľovací koeficient pre tieto molekuly je nula.

Molekuly strednej veľkosti, schopné preniknúť len do určitej časti pórov, sú zadržané v stĺpci podľa ich veľkosti. Distribučný koeficient týchto molekúl sa pohybuje od nuly do 1 a charakterizuje zlomok objemu pórov dostupný pre molekuly danej veľkosti.Ich retenčný objem je určený súčtom Y približne a dostupnej časti objemu pórov.

KVALITATÍVNA ANALÝZA

Chromatograf, ktorý začína s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou, by mal byť oboznámený so základmi kvalitatívnej analýzy. Kvalitatívna analýza slúži na identifikáciu známeho produktu, získaného novým spôsobom alebo v zmesi s inými produktmi.„Je potrebná na izoláciu rôznych zložiek z komplexných biologických, chemických zmesí, čo je dôležité najmä v medicíne, forenzných vedách, v medicíne, kriminalistike, v medicíne a v medicíne. ekológia, kontrolovať umiestnenie niektorých liečivých chemických produktov a ich metabolitov v biomateriáloch .. „.“ Oboznámenie sa so základmi kvalitatívnej „analýzy pomôže vyhnúť sa typickým chybám, napr./rozlíšiť nečistoty vo vzorke od nečistôt v rozpúšťadle resp. na kontrolu čistoty látky na viac ako jednom spektrofotometri s vlnovou dĺžkou a na rôznych atď.

Pred pokračovaním v analýze je potrebné zistiť, či sa celá vzorka eluuje z kolóny týmto rozpúšťadlovým systémom alebo nie. Aby sa zabezpečila úplná elúcia, je potrebné zhromaždiť všetku kvapalinu vytekajúcu z kolóny, odpariť rozpúšťadlo, odvážiť zvyšok a zistiť stupeň výťažnosti vzorky.

Identifikáciu komponentov v HPLC možno vykonať tromi spôsobmi: 1) použiť retenčné informácie; 2) skúmať zóny získané počas separácie v kolóne kvapalinového chromatografu s použitím metód spektrálnej alebo chemickej analýzy; 3) spektrálny analyzátor pripojte priamo k kolóne.

Retenčný objem sa používa na zaznamenávanie píkov v chromatografii. V R alebo retenčný čas t R. Obe veličiny sú charakteristické pre látku v danom chromatografickom systéme. Pretože retenčný čas látky, ktorá sa má separovať, pozostáva z času interakcie v kolóne a času prechodu prázdnych častí skúmavky, líši sa od zariadenia k zariadeniu. Je vhodné mať látku, ktorá nie je zadržiavaná v danej kolóne, pričom ju berieme ako štandard, ktorej retenčný čas a objem t 0 , V o. Chromatografia látky a štandardu sa musí vykonať za rovnakých podmienok (tlak a prietok). Pri identifikácii pomocou retenčných údajov sa známe jednotlivé látky, ktoré môžu byť prítomné vo vzorkách, separujú v rovnakom chromatografickom systéme a získajú sa pre ne hodnoty. t R. Porovnanie týchto hodnôt t R s retenčným časom neznámeho píku možno zistiť, že sa buď zhodujú, a potom je pravdepodobné, že píky zodpovedajú rovnakej látke, resp. t R známa látka sa nezhoduje t R neznáma zóna. Potom je ešte možný hrubý odhad hodnôt t R látky, ktoré nie sú dostupné na priame meranie stupňa ich retencie. Zvážme obe možnosti.

V prvom prípade je zjavne potrebná predbežná štúdia vzorky, aby sa predpokladala prítomnosť špecifických látok v nej. Pri práci s jednoduchými zmesami je ľahké určiť, či sa stupeň retencie zón vzorky a známych látok zhoduje alebo nie, t.j. t B sú rovnaké alebo odlišné. V prípade komplexných zmesí môže niekoľko látok naraz eluovať s podobnými hodnotami. t R, a zóny skutočne získané chromatografickou separáciou sa prekrývajú. Výsledkom je získanie presných hodnôt t R pre rôzne zóny je nemožné. Spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje so zvyšovaním rozlíšenia, starostlivejšou kontrolou podmienok separácie a viacnásobným meraním hodnôt t R a spriemerovanie zistených hodnôt. V tomto prípade by sa mala striedať chromatografická separácia známych a neznámych látok. Pri oddeľovaní zložitých zmesí je hodnota t R látky sa môžu meniť pod vplyvom matrice samotnej vzorky. Tento efekt je možný na začiatku chromatogramu a s prekrývajúcimi sa píkmi; je tiež možné sprísniť zóny, čo už bolo spomenuté.

V takýchto prípadoch pridajte štandard do vzorky v pomere 1 : 1. Ak sú látky identické, hodnotu t R východisková látka sa nemení a na chromatograme sa získa len jeden pík. Ak je k dispozícii prístroj so systémom cyklickej chromatografie, potom je pre spoľahlivosť identifikácie žiaduce nechať zmes prejsť kolónou niekoľkokrát.

Informácie o retencii možno nájsť aj v literatúre, ale hodnota týchto informácií je obmedzená. Keďže stĺpce dokonca jednej šarže poskytujú zlú reprodukovateľnosť, literárne hodnoty nie vždy zodpovedajú skutočnej hodnote. t R na tomto stĺpci. Pre adsorpčnú chromatografiu je však možné predpovedať t R na základe údajov z literatúry. Ďalšia ťažkosť spojená s používaním literárnych významov t R, - zložitosť ich vyhľadávania v odbornej literatúre, hoci bibliografické prehľady publikované v časopise Journal of chromatografia majú aktualizovaný zoznam typov látok.

V druhom prípade, keď sa retenčné časy známych zlúčenín a zón vzorky nezhodujú, je možné predpovedať retenčný čas neznámej zložky. Predpovede relatívnej retencie sú celkom spoľahlivé na základe údajov o štruktúre v chromatografii s vylúčením priestoru. Menej presné sú pri adsorpcii, distribučnej chromatografii a najmä pri práci na chemicky viazanej fáze. Na iónovú a iónovo-párovú chromatografiu látok so známym p Ka možné sú len približné hodnoty tR. Vždy je jednoduchšie predpovedať relatívne zadržanie alebo hodnotu * x ako absolútne hodnoty k". Relatívne hodnoty t R jednoduchšie vyhodnotiť pre príbuzné zlúčeniny alebo deriváty, ako sú substituované alkylkarboxylové kyseliny alebo deriváty benzénu.

Pri izokratickej separácii homológov alebo oligomérov sa niekedy pozoruje nasledujúci vzor:

\ gk" = A + Bn,

kde A a V- konštanty pre určitý počet vybraných vzoriek a pre daný chromatografický systém (na tej istej kolóne, s rovnakou mobilnou a stacionárnou fázou); NS- počet rovnakých štruktúrnych jednotiek v molekule vzorky.

Zavedenie funkčnej skupiny / do molekuly vzorky povedie k zmene k" v prvej rovnici nejakým konštantným koeficientom a / v danom chromatografickom systéme. Je možné získať skupinové konštanty a / pre rôzne skupiny substituentov /, ktorých hodnoty sa budú zvyšovať so zvyšujúcou sa polaritou funkčných skupín vo všetkých typoch chromatografie, okrem chromatografie na reverznej fáze, kde hodnoty konštánt bude klesať so zvyšujúcou sa polaritou.

Niektoré skupinové konštanty a / pre rôzne skupiny substituentov/ sú uvedené v tabuľke. 9.1.

V adsorpčnej chromatografii nie je prvá rovnica vždy použiteľná, pretože platí za predpokladu, že všetky izoméry majú rovnaký význam k", čo sa nie vždy dodržiava. Je však možné vykresliť závislosť lgfe „rovnakých zlúčenín na jednej kolóne proti lgfe“ tých istých zlúčenín, ale na inej kolóne alebo proti zodpovedajúcim charakteristikám v chromatografii na tenkej vrstve, napríklad lg [(l - Rf) IRf].

Pri porovnávaní údajov o retencii látok možno použiť hodnoty kapacitného faktora k", keďže na neho, na rozdiel od t R rýchlosť mobilnej fázy a geometrické vlastnosti kolóny nie sú ovplyvnené.

Separácia na chemicky viazanej fáze je podobná separačnej chromatografii s podobnými fázami, a preto je možné na predpovedanie retenčných časov použiť údaje o rovnovážnej extrakcii.

Pri iónomeničovej chromatografii ovplyvňujú retenciu tri faktory: stupeň ionizácie kyselín a zásad, náboj ionizovanej molekuly a schopnosť látky migrovať z vodnej mobilnej fázy používanej pri iónomeničovej chromatografii do organickej fázy. . Ten závisí od molekulovej hmotnosti zlúčeniny a jej hydrofóbnosti. Preto sú silnejšie kyseliny alebo zásady silnejšie zadržané pri aniónomeničovej alebo katexovej separácii. Pri znižovaní pK a jednotlivej kyseliny obsiahnutej vo vzorke sa retencia zvyšuje so separáciou množstva kyselín v dôsledku výmeny aniónov a so zvýšením p / C o sa zvyšuje retencia zásad počas ich separácie v dôsledku výmeny katiónov.

Zhoda retenčných časov známej látky s pozorovanou teda umožňuje predpokladať ich identitu. Spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje, ak sa porovnávajú chromatogramy známej látky a neznámej zložky za rôznych podmienok. Ak sa látky v adsorpčnej a reverznej fáze alebo iónomeničovej a rozmerovo vylučovacej chromatografii správajú rovnako, spoľahlivosť identifikácie sa zvyšuje. Ak je spoľahlivosť identifikácie s rovnakou relatívnou retenciou 90 %, potom pri štúdiu správania rovnakých látok za výrazne odlišných podmienok je spoľahlivosť identifikácie už 99 %.

Cennou charakteristikou látky použitej pri identifikácii je pomer signálov získaných pre danú látku na dvoch rôznych detektoroch. Analyt po opustení kolóny prechádza najprv cez prvý detektor, potom cez druhý a signály prichádzajúce z detektorov sa zaznamenávajú súčasne pomocou viacperového zapisovača alebo dvoch zapisovačov. Väčšinou sa používa sériové prepojenie ultrafialového detektora (citlivejšieho, ale selektívneho) s refraktometrom, alebo ultrafialového detektora s fluorescenčným detektorom, prípadne dvoch ultrafialových detektorov pracujúcich na rôznych vlnových dĺžkach. Relatívna odozva, to znamená pomer signálu refraktometra k signálu fotometra, je charakteristikou látky za predpokladu, že oba detektory pracujú vo svojom lineárnom rozsahu; overí sa to zavedením rôznych množstiev tej istej látky. Kvalitatívne informácie je možné získať prevádzkou fotometrických detektorov vybavených zariadením na zastavenie prietoku, ktoré zaznamenávajú spektrum píku vychádzajúceho „z kolóny, kým je v prietokovej kyvete, a porovnávajú ho so spektrom známej zlúčeniny“.

Moderné, stále drahé spektrofotometre s diódovým poľom majú značný záujem o identifikáciu.

Úplne neznámu látku nemožno identifikovať len pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a sú potrebné iné metódy.

KVANTITATÍVNA ANALÝZA

Kvantitatívna kvapalinová chromatografia je dobre vyvinutá analytická metóda, ktorej presnosť nie je horšia ako kvantitatívna plynová chromatografia a výrazne prevyšuje presnosť TLC alebo elektroforézy. Preto, aby sa získali kvantitatívne výsledky, musí byť prístroj kalibrovaný.

Kvantitatívna analýza pozostáva z nasledujúcich krokov: 1) chromatografická separácia; 2) meranie plôch alebo výšok píku; 3) výpočet kvantitatívneho zloženia zmesi na základe chromatografických údajov; 4) interpretácia získaných výsledkov, teda štatistické spracovanie. Zvážme všetky tieto fázy.

4.1. CHMATOGRAFICKÁ SEPARÁCIA

Odber vzoriek môže byť náchylný na chyby. Je obzvlášť dôležité vyhnúť sa chybám a získať adekvátnu reprezentatívnu vzorku nehomogénnych pevných vzoriek, prchavých alebo nestabilných látok, ako aj poľnohospodárskych produktov a biomateriálov. Nehomogénne vzorky, ako sú potravinárske výrobky, sa dôkladne premiešajú a rozštvrtia. Mnohonásobným vykonaním tejto operácie sa dosiahne homogenita vzorky.

Chyby a straty látok možno pripustiť v štádiu extrakcie, izolácie, čistenia atď.

Vzorky by sa mali úplne rozpustiť a ich roztoky by sa mali pripraviť s presnosťou ± 0,1 %. Je žiaduce rozpustiť vzorku v mobilnej fáze, čo vylučuje možnosť zrážania po jej zavedení do chromatografu. Ak rozpustenie v mobilnej fáze nie je možné, potom by sa malo použiť rozpúšťadlo, ktoré je s ňou miešateľné, a do chromatografu by sa mali zaviesť objemy vzoriek (menej ako 25 μl).

Počas vstrekovania vzorky sa môžu vyskytnúť značné nepresnosti v dôsledku jej frakcionácie, presakovania a vrcholového rozmazania. Rozmazanie vrcholov spôsobuje tvorbu chvostov, čo vedie k čiastočnému prekrývaniu vrcholov a v dôsledku toho k chybám pri detekcii. Pre kvantitatívne vstrekovanie sú uprednostňované zariadenia s slučkovým ventilom pred injekčnými striekačkami kvôli vyššej presnosti a menšej závislosti operátora.

Pri chromatografickej separácii látok môžu tiež vzniknúť komplikácie, ktoré vedú k skresleniu údajov: kvantitatívna analýza. Je možný rozklad alebo transformácia vzorky počas chromatografického procesu alebo ireverzibilná adsorpcia látky na tejto kolóne. Je dôležité zabezpečiť, aby tieto nežiaduce javy chýbali a v prípade potreby kolónu regenerovať alebo vymeniť. Prekrytie píkov a chvostovanie možno tiež znížiť zmenou chromatografických podmienok.

V kvantitatívnej analýze nemôžete použiť falošné alebo fuzzy vrcholy, ako aj vrcholy, ktorých čas uvoľnenia je blízko do, pretože môže dôjsť k nedostatočnému oddeleniu. Typicky sa používajú píky s hodnotou d ^ 0,5. Najvyššia účinnosť kolóny sa dosiahne pri zavedení 10 ~ 5 -10 ~ 6 g rozpustenej látky na gram sorbentu. Pri zavedení veľkého množstva vzorky sa závislosť výška píku na záťaži môže byť nelineárna a kvantifikácia je potrebná na základe plôch píkov.

Chyby spojené s detekciou alebo amplifikáciou vedú k výraznému skresleniu výsledkov chromatografickej separácie. Každý detektor sa vyznačuje špecifickosťou, linearitou a citlivosťou. Test selektivity je obzvlášť dôležitý pri analýze stopových nečistôt. Odozva UV detektorov sa môže zmeniť na látky s podobnými funkčnými skupinami faktorom 104. Je potrebné kalibrovať odozvu detektora pre každý analyt. Prirodzene, látky, ktoré neabsorbujú v UV oblasti, nevydajú signál do zapisovača pri použití fotometra ako detektora. Pri použití refraktometra sa môžu objaviť negatívne vrcholy. Okrem toho musí byť tento detektor termostatovaný, čo nie je potrebné pre UV detektor.

Linearita detektora určuje veľkosť vstrekovanej vzorky. Malo by sa pamätať na to, že prietok kolóny, teplota kolóny a detektora a dizajn ovplyvnia presnosť kvantifikácie. Chyby pri prenose elektrického signálu do výstupného zariadenia (rekordéra), integrátora alebo do počítača sa môžu vyskytnúť v dôsledku snímania šumu, neuzemnenia, kolísania napätia v sieti atď.

4.2. MERANÁ PLOCHA ALEBO VÝŠKA VRCHOLU

Výška vrcholu h (obr. 10.1) sa volá vzdialenosť od vrcholu píku k základnej čiare, meria sa lineárne alebo sa počíta počet dielikov na zapisovači. Niektoré elektronické integrátory a počítače poskytujú informácie o výškach vrcholov. Poloha základnej čiary posunutých vrcholov sa zistí interpoláciou hodnôt ordinátov zodpovedajúcich začiatku a koncu vrcholu (vrchol 1 a 3 pozri obr. 10.1). Ak chcete zlepšiť presnosť, musíte mať jemnú a stabilnú základnú líniu. V prípade neoddelených píkov sa základná čiara nakreslí medzi začiatkom a koncom píku a nenahradí sa nulovou čiarou. Keďže výška píku je menej závislá od vplyvu susedných prekrývajúcich sa píkov, odhad výšky píku je presnejší a takmer vždy sa používa na stopovú analýzu.

Plochu píku je možné určiť rôznymi spôsobmi. Poďme sa na niektoré z nich pozrieť.

1. Planimetrická metóda spočíva v tom, že vrchol je obklopený ručným planimetrom, čo je zariadenie, ktoré mechanicky určuje plochu vrcholu. Metóda je presná, ale pracná a zle reprodukovateľná. Táto metóda je nežiaduca.

2. Metóda papierových siluet - šilt sa vystrihne a odváži. Metóda je dobre reprodukovateľná, ale pracná a chromatogram je zničený. Jeho použiteľnosť závisí od rovnomernosti grafu. Metódu tiež nemožno široko odporúčať.

4. Triangulačná metóda spočíva v zostrojení trojuholníka nakreslením dotyčníc k stranám píku. Vrchol trojuholníka je vyššie ako vrchol vrcholu. Zväčšenie plochy vytvorenej týmto rozšíreným vrcholom bude konzistentné v celom chromatograme a neovplyvní príliš presnosť. Okrem toho sa vykompenzuje určitá oblasť stratená pri kreslení dotyčníc. Základňa trojuholníka je určená priesečníkom dotyčníc so základnou čiarou a plocha je určená súčinom 7g základne a výšky. Táto metóda je najlepšia na určenie oblastí asymetrických píkov. Avšak reprodukovateľnosť pri konštrukcii dotyčníc rôznymi operátormi je odlišná, a preto; nízka.

5. Metóda diskového integrátora je založená na elektromechanickom zariadení pripojenom k rekordéru. Pero pripojené k integrátoru sa pohybuje pozdĺž pásika v spodnej časti pásky rýchlosťou úmernou pohybu zapisovacieho pera.

Rovnako ako pri manuálnom meraní by mal pík zostať na stupnici zapisovača, avšak úpravy na kompenzáciu posunu základnej čiary a neúplného oddelenia susedných píkov znižujú spoľahlivosť a predlžujú čas analýzy.

Metóda je presnejšia ako manuálne metódy merania, najmä s asymetrickými vrcholmi, a ponúka výhodu rýchlosti. Okrem toho poskytuje nepretržitý kvantitatívny záznam analýzy.

6. Metódy využívajúce elektronické integrátory na určovanie plôch píkov a tlač informácií o tejto ploche a retenčných časoch môžu zahŕňať korekciu odchýlky základnej čiary a určenie oblasti iba čiastočne oddelených píkov. Hlavnými výhodami sú presnosť, rýchlosť, nezávislosť akcie od práce zapisovateľa. Integrátory majú pamäť a môžu byť naprogramované na špecifickú analýzu pomocou vopred naprogramovaného programu. Medzi výhody integrátora patrí jeho schopnosť použiť korekčné faktory pre odozvu detektora pri prepočte počiatočných údajov o plochách píkov, čím sa kompenzuje rozdiel v citlivosti detektora na rôzne látky. Takéto systémy šetria čas, zlepšujú analytickú presnosť a sú užitočné pre rutinné analytické analýzy.

7. V kvapalinovej chromatografii sa počítače široko používajú na meranie plôch píkov. Vytlačia kompletnú správu vrátane názvov látok, oblastí píkov, retenčných časov, korekčných faktorov pre odozvu detektora a obsahu (v % hmotn.) pre rôzne zložky vzorky.