Принципът на метода за течна хроматография. Високоефективна течна хроматография на естествени и отпадъчни води

Въведение

Глава 1. Основни понятия и класификация на методите за течна хроматография

1.1 Апарат за течна хроматография

Глава 2. Същността на HPLC

2.1 Приложение

Глава 3. Примери за използване на HPLC при анализа на обекти на околната среда

Глава 4. Оборудване за HPLC

литература

Приложение

Въведение

Хроматографски методичесто са необходими за идентифициране и количествено определяне на органични вещества с подобна структура. В същото време най-широко използваните за рутинен анализ на замърсители на околната среда са газовата и високоефективната течна хроматография. Газовият хроматографски анализ на органичните замърсители в питейните и отпадъчните води първо се основава на използването на пълни колони, по-късно кварцовите капилярни колони също станаха широко разпространени. Вътрешният диаметър на капилярните колони обикновено е 0,20-0,75 мм, дължината е 30-105 м. Оптимални резултати при анализа на замърсители във водата се постигат най-често при използване на капилярни колони с различна дебелина на филма, изработени от метилфенилсиликони, съдържащи фенилови групи от 5 и 50%... Системата за въвеждане на проба често се превръща в уязвимост в хроматографските техники, използващи капилярни колони. Системите за въвеждане на проби могат да бъдат разделени на две групи: универсални и селективни. Разнообразните приложения включват инжекционни системи с разделяне и без разделяне, инжектиране на „студена” колона и програмирано изпаряване с температура. При селективно впръскване се използва продухване с междинно улавяне, анализ на пространството и др. При използване на универсални инжекционни системи цялата проба се подава в колоната; при селективно инжектиране се инжектира само определена фракция. Резултатите, получени при селективно инжектиране, са много по-точни, тъй като постъпващата в колоната фракция съдържа само летливи вещества и техниката може да бъде напълно автоматизирана.

Газохроматографските детектори, използвани при мониторинга на замърсители, често се разделят на универсални детектори, които реагират на всеки компонент в подвижната фаза, и селективни детектори, които реагират на наличието на определена група вещества със сходни химични характеристики в подвижната фаза. Универсалните включват пламъчна йонизация, атомна емисия, масспектрометрични детектори и инфрачервена спектрометрия. Селективните детектори, използвани при анализа на водата, са улавяне на електрони (селективни към вещества, съдържащи халогенни атоми), термойонни (селективни към азот и фосфор-съдържащи съединения), фотойонизиращи (селективни към ароматни въглеводороди), детектор за електролитна проводимост (селективен към съединения, съдържащи халогенни атоми сяра и азот). Минималните откриваеми количества вещества са от нанограми до пикограми в секунда.

Високоефективна Течна хроматография(HPLC) е идеален метод за определяне на голям брой термично лабилни съединения, които не могат да бъдат анализирани чрез газова хроматография. Съвременните агрохимикали, включително метилкарбонати и органофосфатни инсектициди и други нелетливи вещества, често стават обект на анализ чрез течна хроматография. Високоефективната течна хроматография набира популярност сред другите методи, използвани в мониторинга на околната среда, също защото има ярки перспективи по отношение на автоматизацията на подготовката на пробите.

ГЛАВА 1. ОСНОВНИ ПОНЯТИЯ И КЛАСИФИКАЦИЯ НА ТЕЧНИТЕ ХРОМАТОГРАФИИ

Течната хроматография се класифицира в няколко класа в зависимост от вида на стационарната фазова опора. Прост хардуерен дизайн на хартия и тънкослойна хроматография доведе до широкото използване на тези методи в аналитичната практика. Въпреки това, големите възможности на течната колонна хроматография стимулират усъвършенстването на оборудването за този класически метод и доведоха до бързото въвеждане на HPLC. Преминаването на елуента през колоната под високо налягане направи възможно драстично увеличаване на скоростта на анализ и значително повишаване на ефективността на разделяне поради използването на фино диспергиран сорбент. HPLC методът понастоящем дава възможност за изолиране, количествено и качествено анализиране на сложни смеси от органични съединения.

Според механизма на взаимодействие на веществото, което се отделя (елуира) със стационарната фаза, се разграничават адсорбция, разпределение, йонообменна, размерно-изключваща, йонно-двойка, лиганд-обменна и афинитетна хроматография.

Адсорбционна хроматография... Разделянето чрез адсорбционна хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на веществото, което се отделя, с адсорбент, като алуминиев триоксид или силикагел, които имат активни полярни центрове на повърхността. Разтворителят (елуентът) е неполярна течност. Механизмът на сорбция се състои в специфично взаимодействие между полярната повърхност на сорбента и полярните (или способни на поляризация) области на молекулите на анализирания компонент (фиг. 1).

Ориз. 1. Адсорбционна течна хроматография.

Разпределителна хроматография... При разпределителния вариант на течната хроматография разделянето на смес от вещества се извършва поради разликата в техните коефициенти на разпределение между две несмесващи се фази - елуентът (подвижна фаза) и фазата върху сорбента (неподвижна фаза).

В нормална фазаПри вариант на разпределителна течна хроматография се използва неполярен елуент и полярни групи, присадени към повърхността на сорбента (най-често силикагел). Като модификатори на повърхността на силикагела (присадени фази) се използват заместени алкилхлоросилани, съдържащи полярни групи, като нитрил, аминогрупи и др. (фиг. 2). Използването на присадени фази дава възможност да се контролират фино сорбционните свойства на повърхността на стационарната фаза и да се постигне висока ефективност на разделяне.

Ориз. 2. Разпределителна хроматография с присадена фаза (вариант с нормална фаза).

Ориз. 3. Присадена фазова разпределителна хроматография (версия с обърната фаза).

По-малко разпространената версия на течна хроматография с поддържани фази е, когато течна неподвижна фаза се отлага върху неподвижна подложка.

Изключителен (гел-проникващ)хроматографията е вариант на течна хроматография, при която разделянето на веществата се извършва поради разпределението на молекулите между разтворителя в порите на сорбента и разтворителя, протичащ между неговите частици.

афиннохроматографията се основава на специфични взаимодействия на отделените протеини (антитела) с вещества (антигени), присадени върху повърхността на сорбента (синтетична смола), селективно образуващи комплекси (конюгати) с протеини.

Йонообменна, йонна двойка, лиганд обменна хроматография се използват главно в неорганичния анализ.

Основни параметри на хроматографското разделяне.

Основните параметри на хроматографското разделяне са обемът на задържане и времето на задържане на компонента на сместа (фиг. 4).

Времето на задържане tR е времето, изминало от момента на инжектиране на пробата в колоната до появата на максимума на съответния пик. Като умножим времето на задържане по обемната скорост на елуента F, получаваме обема на задържане VR:

Коригирано време на задържане - времето, изминало от момента на появата на максималния пик на несорбирания компонент до пика на съответното съединение:

tR "= tR - t0;

Намаленият или коригиран задържащ обем е задържащият обем, коригиран за мъртвия обем на колоната V0, т.е. обемът на задържане на несорбирания компонент:

VR "= VR - V0;

Характеристиката на задържане е и коефициентът на капацитет k“, определен като отношението на масата на веществото в неподвижна фаза към масата на веществото в подвижната фаза: k“ = mn / mp;

Стойността k " е лесно да се определи от хроматограмата:

Най-важните параметри на хроматографското разделяне са неговата ефективност и селективност.

Ефективността на колоната, измерена чрез височината на теоретичните плочи (HETT) и обратно пропорционална на техния брой (N), толкова по-висока е, толкова по-тесен е пикът на веществото, излизащо при същото време на задържане. Стойността на ефективността може да се изчисли от хроматограмата по следната формула:

N = 5,54 . (tR / 1/2) 2 ,

където tR- време на задържане,

w 1/2 - ширина на върха на половината височина

Познавайки броя на теоретичните плочи на колона, дължината на колоната L и средния диаметър на зърното на сорбента dc, е лесно да се получат стойностите на височината, еквивалентна на теоретичната плоча (HETT) и намалената височина (PVETT):

VETT = L / N PVETT = VETT / d ° С

Тези характеристики позволяват да се сравни ефективността на различните видове колони, да се оцени качеството на сорбента и качеството на запълване на колоните.

Селективността на разделянето на две вещества се определя от уравнението:

Когато се разглежда разделянето на смес от два компонента, важен параметър е и степента на разделяне RS:

;

Пиковете се считат за разрешени, ако стойността на RS е по-голяма или равна на 1,5.

Основните хроматографски параметри са свързани със следното уравнение за разделителна способност:

;

Факторите, определящи селективността на разделяне, са:

1) химическата природа на сорбента;

2) състава на разтворителя и неговите модификатори;

3) химичната структура и свойствата на компонентите на сместа, която се отделя;

4) температура на колоната

1.1 Апарат за течна хроматография

В съвременната течна хроматография се използват устройства с различна степен на сложност - от най-простите системи до хроматографи от висок клас, оборудвани с различни допълнителни устройства.

На фиг. 4. Представена е блокова схема на течен хроматограф, съдържаща минимално необходимия набор от компоненти, под една или друга форма, присъстващи във всяка хроматографска система.

Ориз. 4. Блокова схема на течен хроматограф.

Помпата (2) е проектирана да създава постоянен поток от разтворител. Конструкцията му се определя преди всичко от работното налягане в системата. За работа в диапазона 10-500 MPa се използват бутални (спринцовки) или бутални помпи. Недостатъкът на първия е необходимостта от периодични спирания за пълнене с елюента, а на втория - голямата сложност на конструкцията и като следствие високата цена. За прости системи с ниско работно налягане от 1-5 MPa успешно се използват евтини перисталтични помпи, но тъй като е трудно да се постигне постоянно налягане и дебит, тяхното използване е ограничено до подготвителни задачи.

Инжекторът (3) гарантира, че проба от смес от компоненти, които трябва да се отделят, се инжектира в колоната с достатъчно висока възпроизводимост. Простите системи за вземане на проби със спирачен поток изискват спиране на помпата и следователно са по-малко удобни от дозаторите Reodyne.

HPLC колоните (4) са дебели стени от неръждаема стомана, които могат да издържат на високо налягане. Важна роля играе плътността и еднородността на уплътняването на колоната със сорбента. За течна хроматография с ниско налягане успешно се използват дебелостенни стъклени колони. Постоянството на температурата се осигурява от термостат (5).

Детекторите (6) за течна хроматография имат проточна клетка, в която непрекъснато се измерва някои свойства на течащия елуент. Най-популярните видове детектори с общо предназначение са рефрактометри, които измерват индекса на пречупване, и спектрофотометрични детектори, които измерват абсорбцията на разтворител при фиксирана дължина на вълната (обикновено в ултравиолетовата област). Предимствата на рефрактометрите (и недостатъците на спектрофотометрите) включват ниска чувствителност към вида на определяното съединение, което може да не съдържа хромофорни групи. От друга страна, използването на рефрактометри е ограничено до изократични системи (с постоянен състав на елуента), така че използването на градиент на разтворителя в този случай не е възможно.

HPLC колоните, които най-често се използват при анализа на замърсители на околната среда, са с дължина 25 cm и вътрешен диаметър 4,6 mm, пълни със сферични частици силикагел с размер 5-10 микрона, присадени с октадецилови групи. През последните години се появиха колони с по-малки вътрешни диаметри, пълни с по-малки частици. Използването на такива колони води до намаляване на консумацията на разтворители и продължителността на анализа, повишаване на чувствителността и ефективността на разделяне, а също така улеснява проблема със свързването на колоните към спектрални детектори. Колоните с вътрешен диаметър 3,1 mm са оборудвани с предпазен патрон (предколона) за увеличаване на експлоатационния живот и подобряване на възпроизводимостта на анализите.

Като детектори в съвременните HPLC инструменти обикновено се използват UV детектор на диодна матрица, флуоресценция и електрохимичен.

Трябва да се има предвид, че в практическата работа раздялата често протича не един по един, а чрез няколко механизма едновременно. Така че разделянето на изключване се усложнява от адсорбционните ефекти, адсорбционното - разпределението и обратно. Освен това, колкото по-голяма е разликата между веществата в пробата по отношение на степента на йонизация, основност или киселинност, молекулно тегло, поляризуемост и други параметри, толкова по-голяма е вероятността от различен механизъм на разделяне за такива вещества.

На практика най-разпространена е хроматографията с обратна фаза (разпределителна), при която неподвижната фаза не е полярна, а подвижната фаза е полярна (т.е. обратната на хроматографията с директна фаза).

В повечето лаборатории в света група от 16 приоритетни PAH се анализират чрез HPLC или CMS.

ГЛАВА 2. СЪЩНОСТ НА HPLC

При високоефективната течна хроматография (HPLC) естеството на процесите, протичащи в хроматографска колона, обикновено е идентично с процесите в газовата хроматография. Единствената разлика е използването на течност като неподвижна фаза. Поради високата плътност на течните подвижни фази и високото съпротивление на колоната, газовата и течната хроматография се различават значително в хардуерния си дизайн.

При HPLC като подвижни фази обикновено се използват чисти разтворители или техни смеси.

За създаване на поток от чист разтворител (или смеси от разтворители), наречен елуент в течната хроматография, в хидравличната система на хроматографа се използват помпи.

Адсорбционната хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността да взаимодействат с адсорбционните центрове на различните молекули на пробата води до разделянето им на зони по време на движението с подвижната фаза по колоната. Разделянето на зоните на компонентите, постигнато в този случай, зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Силикагелните адсорбенти с различни обеми, повърхности и диаметри на порите са най-широко използвани в HPLC. Алуминиев триоксид и други адсорбенти се използват много по-рядко. Основната причина за това:

недостатъчна механична якост, която не позволява опаковане и използване при повишени налягания, характерни за HPLC;

силикагелът, в сравнение с алуминиевия оксид, има по-широк диапазон на порьозност, повърхност и диаметър на порите; значително по-високата каталитична активност на алуминиевия оксид води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

HPLC детектори

Високоефективната течна хроматография (HPLC) се използва за откриване на полярни нелетливи вещества, които по някаква причина не могат да бъдат превърнати във форма, удобна за газова хроматография, дори под формата на производни. Тези вещества включват по-специално сулфонови киселини, водоразтворими багрила и някои пестициди, като производни на фенил-урея.

Детектори:

UV - диоден масив детектор. „Матрицата“ на фотодиодите (има повече от двеста) постоянно регистрира сигнали в UV и видимите спектрални области, като по този начин осигурява запис на UV-B спектри в режим на сканиране. Това прави възможно непрекъснато записване при висока чувствителност на неизкривени спектри на компоненти, бързо преминаващи през специална клетка.

В сравнение с откриването с една дължина на вълната, което не предоставя информация за „чистотата“ на пика, възможността за сравняване на пълните спектри на диодна решетка осигурява резултат за идентификация с много по-голяма степен на увереност.

Флуоресцентен детектор. Голямата популярност на флуоресцентните детектори се дължи на много високата селективност и чувствителност, както и на факта, че много замърсители на околната среда флуоресцират (например полиароматни въглеводороди).

Електрохимичен детектор се използва за откриване на вещества, които лесно се окисляват или редуцират: феноли, меркаптаны, амини, ароматни нитро и халогенни производни, кетон алдехиди, бензидини.

Хроматографското разделяне на сместа върху колоната поради бавния напредък на РР отнема много време. За да се ускори процеса, хроматографията се извършва под налягане. Този метод се нарича високоефективна течна хроматография (HPLC).

Модернизацията на оборудването, използвано в класическата течна колонна хроматография, я превърна в един от най-обещаващите и съвременни методи за анализ. Високоефективната течна хроматография е удобен метод за разделяне, препаративно изолиране и качествен и количествен анализ на нелетливи термолабилни съединения с ниско и високо молекулно тегло.

В зависимост от вида на използвания сорбент, този метод използва 2 опции за хроматография: върху полярен сорбент, използващ неполярен елуент (опция за директна фаза) и върху неполярен сорбент, използващ полярен елуент - така наречената високофазова обратна фаза -ефективна течна хроматография (HPLC).

Когато елуентът премине към елуента, равновесието при условията на HPLC се установява многократно по-бързо, отколкото при условията на полярни сорбенти и неводни РР. В резултат на това, както и удобството при работа с водни и водно-алкохолни елуенти, Off-HPLC придоби голяма популярност в момента. Повечето HPLC анализи се извършват по този метод.

Детектори. Регистрацията на изхода от колоната на отделен компонент се извършва с помощта на детектор. За регистрация можете да използвате промяна във всеки аналитичен сигнал, идващ от мобилната фаза и свързан с естеството и количеството на компонента на сместа. В течната хроматография се използват аналитични сигнали като поглъщане на светлина или излъчване на светлина от изходния разтвор (фотометрични и флуорометрични детектори), показател на пречупване (рефрактометрични детектори), потенциал и електрическа проводимост (електрохимични детектори) и др.

Постоянно откритият сигнал се записва от рекордер. Хроматограмата е поредица от детекторни сигнали, записани на записващата лента, генерирани, когато отделните компоненти на сместа напуснат колоната. В случай на разделяне на сместа, на външната хроматограма се виждат отделни пикове. Позицията на пика на хроматограмата се използва за идентификация, височината или площта на пика се използва за количествено определяне.

2.1 Приложение

HPLC се използва най-широко в следните области на химическия анализ (обектите на анализ са подчертани, където HPLC практически няма конкуренция):

Контрол на качеството на храните - тонизиращи и ароматизиращи добавки, алдехиди, кетони, витамини, захари, оцветители, консерванти, хормони, антибиотици, триазин, карбамат и други пестициди, микотоксини, нитрозамини, полициклични ароматни въглеводороди и др.

Опазване на околната среда - феноли, органични нитросъединения, моно- и полициклични ароматни въглеводороди, редица пестициди, основни аниони и катиони.

Криминалистика - наркотици, органични експлозиви и багрила, силни фармацевтични продукти.

Фармацевтична индустрия - стероидни хормони, почти всички продукти на органичен синтез, антибиотици, полимерни препарати, витамини, протеинови препарати.

Медицина - изброените биохимични и лекарствени вещества и техните метаболити в биологични течности (аминокиселини, пурини и пиримидини, стероидни хормони, липиди) при диагностициране на заболявания, определяне на скоростта на елиминиране на лекарства от организма с цел индивидуалното им дозировка.

Селско стопанство - определяне на нитрати и фосфати в почвите за определяне на необходимото количество внесени торове, определяне на хранителната стойност на фуражите (аминокиселини и витамини), анализ на пестициди в почвата, водата и земеделските продукти.

Биохимия, биоорганична химия, генно инженерство, биотехнология - захари, липиди, стероиди, протеини, аминокиселини, нуклеозиди и техните производни, витамини, пептиди, олигонуклеотиди, порфирини и др.

Органична химия - всички стабилни продукти на органичния синтез, багрила, термолабилни съединения, нелетливи съединения; неорганична химия (почти всички разтворими съединения под формата на йони и комплексни съединения).

контрол на качеството и безопасността на хранителни продукти, алкохолни и безалкохолни напитки, питейна вода, битова химия, парфюми на всички етапи от тяхното производство;

определяне на естеството на замърсяване на мястото на причинено от човека бедствие или извънредна ситуация;

откриване и анализ на наркотични, силнодействащи, отровни и експлозивни вещества;

определяне на наличието на вредни вещества (полициклични и други ароматни въглеводороди, феноли, пестициди, органични багрила, йони на тежки, алкални и алкалоземни метали) в течни отпадъчни води, емисии във въздуха и твърди отпадъци от предприятия и в живи организми;

мониторинг на процеси на органичен синтез, преработка на нефт и въглища, биохимична и микробиологична промишленост;

анализ на качеството на почвата за торене, наличието на пестициди и хербициди в почвата, водата и продуктите, както и хранителната стойност на фуражите; комплексни изследователски аналитични задачи; получаване на следи от свръхчисто вещество.

ГЛАВА 3. ПРИМЕРИ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ НА HPLC ПРИ АНАЛИЗ НА ОБЕКТИ НА ОКОЛНА СРЕДА

HPLC - метод за наблюдение на PAHs в обекти на околната среда

За полициклични ароматни въглеводороди (ПАВ), екотоксиканти от 1-ви клас на опасност, са установени изключително ниски нива на максимално допустими концентрации (ПДК) в природни обекти. Определянето на PAH на ниво MPC и по-ниско е една от много сложните аналитични задачи и за решаването им се използват високотехнологични методи за анализ (GC-MS, GC, HPLC). При избора на метод за наблюдение към основните разглеждани характеристики - чувствителност и селективност, бързина и икономичност се добавят, т.к. наблюдението включва сериен анализ. Опцията HPLC за колони с къси, малки отвори отговаря на тези изисквания до голяма степен. Използвайки този метод, авторите са разработили и сертифицирали методи за наблюдение на бензо [a] пирен в три естествени среди: аерозол, снежна покривка и повърхностни води. Техниките се характеризират с: проста унифицирана пробоподготовка, включваща екстракция на PAHs с органични разтворители и концентриране на екстракта, директно въвеждане на концентрирания екстракт в хроматографската колона, използване на многовълнова фотометрична детекция в UV областта на спектър, идентифициране на PAH пикове в хроматограми с помощта на два параметъра, време на задържане и спектрално съотношение ... Общата грешка не надвишава 10% при определяне на бензо [a] пирен в аерозол в концентрационен диапазон от 0,3 до 450 ng / m 3, в повърхностни води в диапазона на концентрация от 10 до 1000 ng / L, в снежната покривка в диапазон на повърхностна плътност от 0,5 до 50 μg / m 2. В случай на едновременно определяне на приоритетни PAHs (до 12 съединения) и регистриране на нехомогенни пикове на аналитите, се предлага повторно отделяне на екстракта с промяна в селективността на подвижната фаза, дължината на вълната на откриване и температурата на колоната, като се вземат предвид индивидуалните свойства на определения ПАХ.

1 ... Качество на околния въздух. Масова концентрация на бензо [а] пирен. HPLC техника за измерване. Удостоверение за атестация МВИ No 01-2000г.

2 ... Качеството на повърхностните и пречистените отпадъчни води. Масова концентрация на бензо [а] пирен. HPLC техника за измерване. Удостоверение за атестация МВИ No 01-2001г.

3 ... Качество на снега. Масова концентрация на бензо [а] пирен. HPLC техника за измерване. Удостоверение за атестация МВИ No 02-2001г.

Отстраняване на анилин от водни разтвори с помощта на отпадъчна алумотермична редукция на валцувана медна люспа

Проблемът с отстраняването на въглеводороди от отпадъчните води е неотложна задача. В много химическа, нефтохимическа и други индустрии се образува анилин и неговите производни, които са токсични вещества. Анилинът е силно токсично вещество, максималната граница на концентрация е 0,1 mg / m 3. Анилинът и неговите производни са разтворими във вода и следователно не могат да бъдат отстранени чрез гравитационно утаяване.

Един от най-добрите методи за пречистване на отпадъчни води от органични замърсители е използването на неорганични и органични адсорбенти, способни на регенерация (алумосиликати, модифицирани глини, дърво, влакна и др.) и неспособни на регенерация (активен въглен, макропорьозни полимерни материали и др.) .).

Регенерираните адсорбенти могат да отстраняват от водата органични вещества с различна полярност. Търсенето на ефективни адсорбенти е спешна задача.

Настоящият доклад представя резултатите от проучване в областта на приложението на валцувана медна люспа на Ереванския кабелен завод (OPMOERKZ) като анилинови сорбенти.

Хроматографските изследвания са проведени на HPLC хроматограф / високоефективна течна хроматография / системи (Waters 486 - детектор, Waters 600S - контролер, Waters 626 - помпа), на колона 250 x 4 mm, пълна с изследваните сорбенти, мобилната фазова скорост 1 ml/m/подвижна фаза са изследваните от нас разтворители/, детекторът е UV-254. UV спектроскопският анализ е извършен на спектрофотометър Specord-50, като спектрите са получени с помощта на компютърната програма ASPECT PLUS.

Към определени обеми анилин във вода се добавят точно претеглени порции сорбенти, чиито начални концентрации варират. Сместа се разклаща старателно в продължение на 6 ч. След това пробата се оставя да се утаи. Адсорбцията завършва практически за 48 ч. Количеството на утаения анилин се определя чрез UV спектрофотометричен и рефрактометричен анализ.

Първо, адсорбционните свойства на OPMOErKZ бяха изследвани, когато анилинът беше отстранен от разтвор във въглероден тетрахлорид. Оказа се, че анилинът абсорбира най-добре сорбент 3 (таблица).

Измервания бяха извършени и за водни разтвори на анилин в концентрации от 0,01-0,0001 mol/l. Таблицата показва данни за 0,01 М разтвор.

Абсорбция на анилин от различни сорбенти от 0,01 М воден разтвор на анилин при 20 ° C

По-рано беше установено, че адсорбцията се увеличава в рамките на посочения диапазон на концентрация и линейно зависи от индекса на пречупване. Количеството анилин се определя от графичната връзка "индекс на пречупване - моларна концентрация" и се коригира с данните както от течна хроматография, така и от UV спектрален анализ.

Най-активен за водните разтвори е сорбент 3. Количеството на адсорбирания замърсител се изчислява като разликата между общото количество замърсител, добавен към първоначалния разтвор и остатъка му в крайния разтвор.

Методи за определяне на PAHs в обекти на околната среда

Обикновено методите на газова хроматография (GC) и високоефективна течна хроматография (HPLC) се използват за определяне на PAHs. разделянето на основните 16 PAH, достатъчни за количествен анализ, се постига чрез използване на капилярни колони при газова хроматография или високоефективни колони, използвани в HPLC. Трябва да се помни, че колона, която разделя добре калибровъчните смеси от шестнадесет PAH, не гарантира, че те също ще се разделят добре на фона на придружаващите органични съединения в тестовите проби.

С цел опростяване на анализа, както и за постигане на високо качество на получените резултати, повечето от аналитичните процедури съдържат етап на предварително изолиране (отделяне) на ПАУ от други групи сродни съединения в пробите. Най-често за тази цел се използват техники за течна-твърда или течна-течна течна хроматография с ниско налягане, като се използват адсорбционни механизми като силикагел или алуминиев триоксид, понякога се използват смесени механизми, като адсорбция и елиминиране с помощта на Sephadex.

Използването на предварително пречистване на пробите позволява да се избегне влиянието на:

Напълно неполярни съединения като алифатни въглеводороди;

Умерено до силно полярни съединения като фталани, феноли, многовалентни алкохоли, киселини;

Съединения с високо молекулно тегло като смоли.

Високоефективната течна хроматография (HPLC) използва главно два типа детектори: флуорометричен детектор или спектрофотометричен детектор с фотодиодна решетка. Границата на откриване на PAHs при флуорометрично откриване е много ниска, което прави този метод особено подходящ за определяне на следи от полиароматни съединения. Въпреки това, класическите флуорометрични детектори практически не предоставят информация за структурата на изследваното съединение. Съвременните проекти позволяват записването на флуоресцентни спектри, които са характерни за отделните съединения, но те все още не са получили широко разпространение в практиката на рутинните измервания. Спектрофотометричен детектор с фотодиодна линийка (PDL) дава възможност за регистриране на спектри на абсорбция в UV и видимия спектрален диапазон, тези спектри могат да се използват за идентификация. Подобна информация може да се получи с помощта на детектори за бързо сканиране.

При избора на аналитична техника за отделяне, идентификация и количествен анализ на споменатите ПАХ трябва да се вземат предвид следните условия:

Нивото на определеното съдържание в пробите за изпитване;

Броят на свързаните вещества;

Използвана аналитична процедура (техника на измерване);

Възможности на серийното оборудване.

Разработване на метод за определяне на алкалоземни елементи и магнезий чрез йонна високоефективна течна хроматография

Развитието и усъвършенстването на методи, които позволяват решаването на проблемите на анализа на водата, е важен проблем в аналитичната химия. Развитието на високоефективна течна хроматография с високо налягане стимулира развитието на ново направление в йонообменната хроматография, така наречената йонна хроматография. Синтезът на сорбенти за йонна хроматография е труден, тъй като има много изисквания към тях. Поради липсата на налични в търговската мрежа високоефективни катионобменници беше използвана динамично модифицирана обратна фаза, за която беше синтезиран модификатор: N-хексадецил-N-деканоил-параминобеноилсулфонова киселина етил-диизопропиламониев (DHDASK), където хидрофобен амин, съдържащ SO 3 - група, способна на катионен обмен. След преминаване на разтвора на модификатора, абсорбцията при l = 260 nm достига 6,4 единици оптична плътност (° E) с плато. Изчисленият йонообменен капацитет е 15,65 μmol. Тъй като катионите на алкалоземните елементи и магнезия не поглъщат в UV областта на спектъра, се използва индиректно UV детекция с помощта на синтезирания UV абсорбиращ елуент 1,4-дипиридиниев бутан бромид (DPB bromide). Тъй като халогенните йони разрушават стоманените части на колоната, бромидният йон на 1,4-дипиридиниев бутан е заменен с ацетатен йон. Когато колоната се промие с елуента, противойонът на модификатора, етилдиизопропиламониевият, се заменя с UV-абсорбиращия 1,4-дипиридиниев бутан йон. Разделянето на катиони е извършено при оптимална дължина на вълната l = 260 nm в мащаб 0,4 A в режим „сгъване на скала”; полярността на записващото устройство беше обърната. Разделянето на всички изследвани катиони е постигнато чрез въвеждане на комплексообразуваща добавка оксалова киселина. Границите на откриване за Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ са 8 μg / L; 16 μg / L; 34 μg / L; 72 μg / L, съответно. При избраните условия е анализирана чешмяна вода, съдържанието на Са 2+ в която е 10,6 +1,9 mg-йон/l, Mg 2+ -2,5 + mg-йон/l. Грешката на възпроизводимостта не надвишава -2,2% за Ca 2+ и 1,4% за Mg 2+.

Анализ на кадмиеви комплекси в околната среда

За изследване на механизмите на миграция на тежки метали в биосферата са необходими данни за химичните форми на съществуването на металите в природата. Трудностите при анализа на съединенията на един от най-токсичните метали - кадмий - са свързани с факта, че той образува крехки комплекси и когато се опитват да ги изолират, естествените равновесия се нарушават. В тази работа кадмиевите съединения в почвата и растенията са изследвани с помощта на техника, базирана на хроматографско разделяне на екстракти с последваща идентификация на компонентите чрез химичен анализ. Този подход даде възможност не само да се идентифицират химичните форми на кадмий, но и да се проследят техните трансформации в обекти на околната среда.

OH-групи въглехидрати и полифеноли (включително флавоноиди), C = O, фосфати, NH 2, NO 2, SH-групи са координирани с кадмий в обекти от биосферата. За целите на това изследване беше съставен набор от моделни лиганди, представляващи тези класове съединения. Взаимодействието на моделни лиганди с водоразтворими кадмиеви соли е изследвано чрез UV спектроскопия и HPLC.

За изолиране на кадмиеви съединения използвахме екстракция със специално подбрани (не образуващи комплекси с Cd) разтворители. Така че е възможно да се отдели кадмий от всички тежки метали, с изключение на близкия му химически аналог - цинк. Пикове, съдържащи кадмий и цинк в хроматограмите на получените екстракти, бяха открити чрез свързване на метали под формата на техните дитизонати. За отделяне от цинк е използвана разликата в стабилността на комплексите Cd и Zn при рН 6-8. Изолираните Cd съединения се идентифицират чрез HPLC с промяна в рН по време на елуиране. Извършен е анализ на съединенията на кадмий с компоненти на почвите и растителните тъкани и са идентифицирани веществата, произведени от растенията в отговор на увеличаване на приема на кадмий от почвата. Показано е, че флавоноидите, по-специално трицинът, са защитни агенти в зърнените култури, алкокси производните на цистеина в бобовите растения и както полифенолите, така и тиолите в кръстоцветните растения.

ГЛАВА 4. HPLC ОБОРУДВАНЕ

СЕРИЯ ACCELA

Новият ултра-високопроизводителен течен хроматограф ACCELA е в състояние да работи в най-широкия диапазон от скорости на потока и налягания, осигурявайки както типично HPLC разделяне на конвенционални колони, така и ултра бързо и ефективно разделяне на колони с размер на частиците на сорбента по-малък от 2 μm при свръхвисоки налягания (над 1000 атм.).

Системата включва входяща помпа с тримесечен градиент, способна на налягания над 1000 bar и с обем на задържане от само 65 µl за високоскоростно хроматографско разделяне. Автосемплър ACCELAе в състояние да работи в 30-секунден цикъл на инжектиране на проба и осигурява най-висока възпроизводимост на инжектиране. Детектор с диодна матрица Accela PDAс минимизиран обем на проточната клетка (2 μL) е оптимизиран за режим на високоскоростна хроматография, използва патентованата технология LightPipe и поддържа симетричната форма на пика, която се осигурява от използването на безупречна хроматографска система и колони.

Системата се интегрира перфектно с мас спектрометри, за да създаде най-мощните и най-добрите HPLC / MS системи, налични в света.

UHP колони с размер на зърното 1,9 μm, налични от Thermo Electron за всяко приложение

СЕРИЯ TSP

Модулният принцип на проектиране на HPLC устройствата позволява на клиента гъвкаво да комплектова оборудване за решаване на всякакви аналитични задачи и ако те се променят, то може да бъде бързо и икономично модифицирано. Широката гама от модули включва помпи, вариращи от изократичен до четирикомпонентен градиент, от микроколона до полупрепаративни, всички налични детектори, системи за инжектиране на проба от ръчни инжектори до автопробообразуватели с всякаква възможност за манипулиране на пробата, мощен софтуер за обработка на резултатите от измерването и контрол на всички системни модули. Всички модули са сертифицирани по CSA, TUF/GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000, компактни са, имат модерен дизайн, лесни за работа, оборудвани с вграден дисплей и самостоятелен -диагностична система, ви позволява да създавате и запазвате параметри на методите на задачите. Те отговарят на критериите за "Добра лабораторна практика" (GLP) и са вписани в Регистъра на средствата за измерване на Руската федерация. Докладите от измерванията се издават в съответствие с Фармакопеите на Англия, САЩ, Германия и Франция.

TSP модулните системи се характеризират с най-висока надеждност и стабилност на работа.

Комбинацията от модули предоставя на анализатора всички предимства на интегралната система от една страна и гъвкавостта на модулната система, от друга. Във всяка област на приложение на високоефективната течна хроматография (HPLC) - фармакология, биотехнология, анализ на околната среда, клиничен анализ,

Вътрешен въздух: методи за контрол и почистване. Контрол на източника на вредни вещества и околната среда. Газоанализатори: приложение и съвременните им видове за наблюдение на състава на газовата смес - универсална фотометрична течност и лента.

Мониторингът като система за наблюдение и контрол на околната среда. Методи за мониторинг на замърсители в обекти на околната среда.

Разделяне на аниони чрез едноколонна йонна хроматография. Изображение на структурата на частица от йонообменна смола. Примери за използване на йонообменна хроматография при анализа на обекти на околната среда. Характеристики на анализа на бирата чрез йонна хроматография.

Обща характеристика на хлорорганичните съединения, техните основни физични и химични свойства и приложения, отрицателно въздействие върху околната среда, тялото на животните, рибите и хората. Хлорорганични пестициди в храните и методи за тяхното определяне.

Основи на планарната (тънкослойна) хроматография: състоянието и перспективите за използване на съвременни инструментални методи за анализ на пестициди, хлорорганични пестициди във вода, храни, фуражи и тютюневи изделия чрез хроматография в тънък слой.

Налични методи за вземане на проби от въздух в помещенията за анализ. Принципът на действие на колориметричните тръби. Обезцветяване на конкретен реагент при контакт с конкретен замърсител. Откриване на летливи органични съединения.

Теоретични основи на флуорометрията (луминесценцията), области на приложението й при анализа на обекти на околната среда и съвременна изследователска техника. Изключителна чувствителност и скорост на луминесцентен анализ. Проблеми с енергийното захранване на възбуждане.

Развитието на химическо аналитично оборудване не само не елиминира проблема с качеството на извършените измервания, но, напротив, предявява все по-високи изисквания във всички аспекти на измерванията.

Обща информация за промишленото съоръжение. Климатични условия на района. Технологична верига. Източници на замърсяване и нарушаване на природната среда. Замърсяване на естествените води. Точки за наблюдение на качеството на повърхностните води. Методи за вземане на проби и анализ на вода.

Широка гама от органични съединения, въведени в околната среда в хода на стопанската дейност на човека, води до факта, че тези вещества са се превърнали в основните замърсители, които определят естеството на техногенното замърсяване на хидросферата.

Характеристики на спектроскопските методи за анализ. Същността на екстракционно-фотометричните методи. Примери за използване на метода за определяне на тежки метали в естествени води. Метод за откриване на бромидни йони, нитратни йони. Модерно оборудване.

Концепцията и предназначението на газовата хроматография, параметрите на нейното задържане. Време на задържане и обем на задържане. Уравнения в газовата хроматография. Допълнителни устройства за газова хроматография. Контрол на замърсяването на въздуха при извънредни ситуации.

Концепцията и характеристиките на метода на масспектрометрия. Масспектрометри с двойно фокусиране в масспектрометрия с индуктивно свързана плазма. Използването на хроматография-мас-спектрометрия при идентифициране на замърсители на околната среда, оборудване.

Методи за оценка на замърсяването на газовите потоци. Основни изисквания за вземане на проби от газ и методи за анализ и измерване. Методи за оценка на параметричното замърсяване. Методи за оценка на замърсяването на водната среда, почвата, почвата и растителността. Идентифициране на промените.

Определяне на хилядни от процента от съдържанието на веществото в чисти метали чрез оптични методи за анализ, като се използват адсорбционни методи чрез спектрофотометрия, фотоколориметрия и колориметрия. Продажба на химическо аналитично оборудване чрез уебсайтове.

Цел и основни принципи за прилагане на кондуктометричните методи за анализ. Разновидности на използваните методи и особености на тяхното приложение. Примери за използване на кондуктометрия при анализа на обекти на околната среда и оборудването, необходимо за това.

По отношение на природните води се разглеждат проблемите за количественото определяне и разделяне на антропогенни и природни компоненти на въглеводородите (CH).

Сега все по-широко се използват сорбционните методи за пречистване на водата, а един от най-често използваните сорбенти е активният въглен.

Основните видове хроматография. Приложение на хроматографски методи в мониторинга на околната среда. Приложение на хроматографията при анализа на обекти от околната среда. Модерен хардуерен дизайн. Методи за разработване на хроматограми и работа на хроматограф.

Мониторинг на природните води чрез физикохимични методи: планарна (тънкослойна хроматография) и приложението му за лизиране на водата. Разделяне на смес от вещества в плосък слой от сорбент и разтворител. Интензитет на луминисценция на петролни продукти на флуорометър.

(OFS 42-0096-09)

Високоефективната течна хроматография (HPLC) е техника на колонна хроматография, при която подвижната фаза (PF) е течност

кост, движеща се през хроматографска колона, пълна с не-

мобилната фаза (сорбент). HPLC колоните имат високо хидравлично налягане на входа на колоната, така че HPLC понякога се нарича

vyvayut "течна хроматография с високо налягане".

В зависимост от механизма на разделяне на веществата се разграничават следните:

HPLC опции: адсорбция, разпределение, йонообмен,

изключителни, хирални и др.

При адсорбционната хроматография разделянето на веществата става поради различната им способност да адсорбират и десорбират с

повърхността на адсорбент с развита повърхност, например силикагел.

При разпределителната HPLC разделянето възниква поради разликата в коефициентите на разпределение на веществата, които трябва да бъдат разделени между неподвижните

(обикновено химически присадени към повърхността на неподвижна опора) и

подвижни фази.

Според полярността на PP и NF, HPLC се разделя на нормална фаза и обемна

разширена фаза.

Нормалнофазовата хроматография се нарича вариант на хроматография, при който

използвайте полярен сорбент (например силикагел или силикагел с

усукани NH2 - или CN-групи) и неполярни PF (например хексан с развита

лични допълнения). При хроматографията с обърната фаза,

използвайте неполярни химически модифицирани сорбенти (напр.

неполярен алкилов радикал C18) и полярни подвижни фази (напр.

метанол, ацетонитрил).

При йонообменна хроматография, молекули на вещества в смес, дисоциация

образувани в разтвора на катиони и аниони, се разделят при преминаване

сорбент (катион или анион) поради различните им обменни курсове с йонни

ми сорбентни групи.

В изключение (сито, гел-проникване, гел-филтриране)

хроматография, молекулите на веществата се разделят по размер поради различната им способност да проникват в порите на неподвижната фаза. В този случай първият от съ-

появяват се най-големите молекули (с най-високо молекулно тегло), способни да проникнат в минималния брой пори на неподвижната фаза,

а последните са вещества с малки размери на молекулите.

Разделянето често протича не един по един, а няколко механизма едновременно.

HPLC методът може да се използва за контрол на качеството на всеки негатив

на зигоматични аналити. За анализа използвайте подходящите инструменти - течни хроматографи.

Съставът на течния хроматограф обикновено включва следните основи:

ny възли:

– Устройство за подготовка на PF, включително контейнер с подвижна фаза (или капацитив

с отделни разтворители, които са част от подвижната фаза

zy) и системата за дегазиране на PF;

– помпена система;

– мобилен фазов смесител (ако е необходимо);

– система за впръскване на проба (инжектор);

– хроматографска колона (може да се монтира в термостат);

- детектор;

– система за събиране и обработка на данни.

Помпена система

Помпите осигуряват подаване на PF към колоната при дадена постоянна скорост. Съставът на подвижната фаза може да бъде постоянен или променлив.

по време на анализа. В първия случай процесът се нарича изократичен,

а във втория - градиент. Пред помпената система понякога се монтира

филтри с диаметър на порите 0,45 µm за филтриране на подвижната фаза. Модерен

Помпената система за течен хроматограф се състои от една или повече помпи, управлявани от компютър. Това ви позволява да промените съ-

става PF според определена програма по време на градиентно елуиране. Sme-

PF компонентите в смесителя могат да се появят както при ниско налягане

лениране (преди помпите) и при високо налягане (след помпите). Смесителят може да се използва за приготвяне на PP и за изократно елуиране,

по-точно съотношение на компонентите обаче се постига чрез предварително

смесване на PP компоненти за изократичен процес. Помпите за аналитична HPLC позволяват поддържане на постоянен дебит на PP в колоната в диапазона от 0,1 до 10 ml/min при налягане на входа на колоната до 50 MPa. Препоръчително е обаче тази стойност да не надвишава

shalo 20 MPa. Пулсациите на налягането се свеждат до минимум чрез специално затихване

черни системи, включени в проектирането на помпите. Работни части на

помпите са изработени от устойчиви на корозия материали, което позволява използването на агресивни компоненти в състава на PF.

Миксери

По своя дизайн смесителите могат да бъдат статични или динамични

психически.

В смесителя се образува единична подвижна фаза от

отделни разтворители, доставяни от помпи, ако необходимата смес не е приготвена предварително. Смесването на разтворители обикновено става спонтанно, но понякога се използват системи за принудително смесване.

шиене.

Инжектори

Инжекторите могат да бъдат универсални за инжектиране на проба от

1 μl до 2 ml или дискретно за инжектиране на проба само с определен обем

ema. И двата типа инжектори могат да бъдат автоматични („автоматични инжектори“ или „автосамплери“). Инжекторът за инжектиране на пробата (разтвор) не е разположен

директно пред хроматографската колона. Конструкцията на инжектора позволява промяна на посоката на PF потока и извършване на предварително инжектиране на пробата в контур с определен обем (обикновено от 10 до 100 μL).

Този обем е посочен на етикета на пантата. Конструкцията на инжектора позволява смяна на контура. За въвеждане на анализирания разтвор в неизвестното

инжектора за домати е ръчна микро-спринцовка с обем, който е

значително надвишаващи обема на цикъла. Излишъкът от инжектирания разтвор, не

в цикъла се изхвърля и в колоната се инжектира точен и винаги равен обем проба. Ръчното непълно запълване на цикъла намалява точността

точност на дозиране и възпроизводимост и следователно влошава точността

качество и възпроизводимост на хроматографския анализ.

Хроматографска колона

Хроматографските колони обикновено са тръби от неръждаема стомана, стъкло или пластмаса, пълни със сорбент и затворени

от двете страни с филтри с диаметър на порите 2–5 µm. Аналитична дължина

колоната, в зависимост от механизма на хроматографско разделяне, може да бъде в диапазона от 5 до 60 cm или повече (обикновено е

10-25 см), вътрешен диаметър - от 2 до 10 мм (обикновено 4,6 мм). В микроколона хром се използват колони с вътрешен диаметър по-малък от 2 mm

топография. Използват се и капилярни колони с вътрешни диаметри.

ром около 0,3-0,7 мм. Колоните за препаративна хроматография имат вътрешен диаметър до 50 mm или повече.

Пред аналитичната колона могат да се монтират къси кабели.

колони (охранителни колони), изпълняващи различни спомагателни функции

(по-често - защита на аналитичната колона). Обикновено анализът се извършва с комп.

температура обаче, за да се повиши ефективността на разделяне и

намаляване на продължителността на анализа, може да се използва термостат

tirovanie колони при температури не по-високи от 60 C. При по-високи температури е възможно разрушаването на сорбента и промяна в състава на PF.

Неподвижна фаза (сорбент)

Обикновено се използва като сорбенти:

1. Нормално се използват силикагел, алуминиев оксид, порест графит

малка фазова хроматография. Механизмът за задържане в този случай

чай - обикновено адсорбция;

2. Смоли или полимери с киселинни или основни групи. Област на приложение - йонообменна хроматография;

3. Порест силикагел или полимери (хроматография с изключване на размера);

4. Химически модифицирани сорбенти (сорбенти с присадени

zami), приготвен най-често на базата на силикагел. Механизмът на задържане в повечето случаи е разпределението между

ной и стационарни фази;

5. Химически модифицирани хирални сорбенти, напр.

водни целулози и амилози, протеини и пептиди, циклодекстрини,

използвани за разделяне на енантиомери (хирална хроматография

Сорбентите с присадени фази могат да имат различна степен на химичност

техническа модификация. Сорбентните частици могат да бъдат сферични или не-

правилна форма и разнообразна порьозност.

Най-често използваните присадени фази са:

– октилни групи(сорбент октилсилан или С8);

– октадецилови групи(сорбент октадецилсилан

(ODS) или C18);

– фенилови групи(фенилсиланов сорбент);

– цианопропилови групи(CN сорбент);

– аминопропилови групи(NH2 сорбент);

- диолни групи (сорбент диол).

Най-често анализът се извършва върху неполярни присадени фази в

режим с обърната фаза с използване на сорбент C18.

В някои случаи е по-препоръчително да се прилага нормално

фазова хроматография. В този случай се използват силикагел или полярни присадени фази ("CN", "NH2", "diol") в комбинация с неполярни разтворители.

Сорбентите с присадени фази са химически стабилни при стойности на pH от 2,0 до 8,0, освен ако не е посочено друго от производителя.

Сорбентните частици могат да имат сферична или неправилна форма и различни порьозности. Размерът на частиците на сорбента при аналитична HPLC обикновено е 3-10 µm, при препаративната HPLC - до 50 µm или повече.

Използват се и монолитни сорбенти.

Високата ефективност на разделяне се осигурява от голямата повърхност на частиците на сорбента (което е следствие от тяхната микроскопична

размер и наличие на пори), както и еднородността на състава на сорбента и неговата плътна и равномерна опаковка.

Детектори

Използват се различни методи за откриване. В общия случай РР с разтворените в него компоненти след хроматографската колона

Ki влиза в детекторната клетка, където едни или други негови свойства (абсорбция в UV или видимата област на спектъра, флуоресценция,

показател на пречупване, електрическа проводимост и др.). Получената хроматограма е графика на зависимостта на някои физически

или физикохимичен параметър на PF спрямо времето.

Най-често срещаните са спектрофотометричните де-

тектори (включително диодно-матрични), регистриращи промяна в опт

плътност в ултравиолетови, видими и често близо до инфрачервени

спектрални области от 190 до 800 или 900 nm. Хроматограмата в този случай

tea представлява зависимостта на оптичната плътност на PF от времето.

Традиционно използвания спектрофотометричен детектор позволява

Може да извършва откриване при всяка дължина на вълната в работния си диапазон.

зона. Използват се и многовълнови детектори, позволяващи

за осигуряване на откриване на няколко дължини на вълната едновременно.

С помощта на детектор с диодна матрица е възможно не само да се извърши откриване на няколко дължини на вълната наведнъж, но и практически мигновено

за получаване на оптичния спектър на FS по всяко време (без сканиране), което значително опростява качествения анализ на отделените компоненти.

противници.

Чувствителността на флуоресцентните детектори е около 1000 пъти по-висока от чувствителността на спектрофотометричните. В този случай се използва или присъща флуоресценция, или флуоресценция на съответните производни, ако самото вещество, което се определя, не флуоресцира. Модерен

флуоресцентни детектори позволяват не само получаване на хроматографски

грама, но също и за записване на спектрите на възбуждане и флуоресценция на анализа-

връзки.

Рефрактометричните детектори се използват за анализ на проби, които не абсорбират в UV и видимите спектрални области (например въглехидрати).

(рефрактометри). Недостатъците на тези детектори са ниската (в сравнение със спектрофотометричните детектори) чувствителност и значителна температурна зависимост на интензитета на сигнала (детекторът трябва да бъде термостатиран).

Използват се и електрохимични детектори (кондуктометрични

небе, амперометричен и др.), мас спектрометричен и Фурие-IR

детектори, детектори за разсейване на светлината, радиоактивност и някои други

Мобилна фаза

V Като PP могат да се използват различни разтворители - както индивидуални, така и техните смеси.

V нормална фазахроматографията обикновено използва течен въглерод

леводороди (хексан, циклохексан, хептан) и други относително неполярни

разтворители с малки добавки на полярни органични съединения,

които регулират елуиращата сила на PF.

При обратнофазовата хроматография PF съдържа полярни

ганични разтворители (обикновено ацетонитрил и метанол) и вода. За избор-

сепарации често използват водни разтвори с определен

рН, по-специално буферни разтвори. Добавките се използват неорганични

химични и органични киселини, основи и соли и други съединения (за

например, хирални модификатори за разделяне на енантиомери в ахирални-

сорбент).

Контролът на стойността на pH трябва да се извършва отделно за водния компонент, а не за сместа му с органичен разтворител.

PF може да се състои от един разтворител, често от два, ако е необходимо

обхват - от три или повече. Съставът на PP е посочен като обемно съотношение на разтворителите, включени в него. В някои случаи мас

съотношението, което трябва да бъде специално предвидено.

Когато се използва UV спектрофотометричен детектор, PF не трябва да има изразена абсорбция при дължината на вълната, избрана за откриване. Граница на прозрачност или оптична плътност при определяне

често се посочва специфичната дължина на вълната на разтворителя на конкретен производител

намерени на опаковката.

Хроматографският анализ е силно повлиян от степента на чистота на PF, поради което е за предпочитане да се използват произведени разтворители

специално за течна хроматография (включително вода).

РР и анализираните разтвори не трябва да съдържат неразтворими

частици и газови мехурчета. Вода, получена в лабораторни условия

водни разтвори, предварително смесени с вода, органични разтвори

Инструментите, както и анализираните разтвори трябва да бъдат подложени на фина филтрация и дегазиране. Обикновено за тези цели се използва филтриране.

под вакуум през мембранен филтър с размер на порите 0,45 μm инертен спрямо дадения разтворител или разтвор.

Система за събиране и обработка на данни

Съвременната система за обработка на данни е интерфейс

персонален компютър, свързан с хроматографа с инсталиран

софтуер, който ви позволява да регистрирате и обработвате chro-

матограма, както и контролират работата на хроматографа и наблюдават главния

параметри на хроматографската система.

Списък на хроматографските условия, които трябва да бъдат посочени

В частна монография размерите на съ-

колони, вид сорбент с указание за размера на частиците, температура на колоната (ако е необходимо, термостатиране), обем на инжектирана проба (обем на контура),

превръщане на PF и методът на неговото получаване, скорост на подаване на PF, детектор и условия за откриване, описание на градиентния режим (ако се използва), време на хроматография.

ЙОНЕН ОБМЕН И ЙОННА HPLC

Йонообменна хроматография се използва за анализ на двете органични

(хетероциклични основи, аминокиселини, протеини и др.) и не-

ганични (различни катиони и аниони) съединения. Разделяне на компонентите

Съдържанието на анализираната смес в йонообменната хроматография се основава на обратимото взаимодействие на йоните на анализираните вещества с йонните групи

пами сорбент. Анионити или катиони-

Вие. Тези сорбенти са предимно полимерни йонни

обменни смоли (обикновено кополимери на стирен и дивинилбензол с присадени

йонни групи) или силикагелове с присадени йонообменни групи. За разделяне на аниони се използват сорбенти с групи - (СН2) 3 N + X–, а за разделяне на катиони – сорбенти с групи - (СН2) SO3 - Н +.

Обикновено полимерните смоли се използват за отделяне на аниони и

излугване на катиони - модифицирани силикагелове.

Като PF в йонообменната хроматография се използват водни разтвори на киселини, основи и соли. Обикновено се използват буферни състезания.

кремове, които ви позволяват да поддържате определени pH стойности. Възможно е също да се използват малки добавки, смесващи се с вода органични

химически разтворители - ацетонитрил, метанол, етанол, тетрахидрофуран.

Йонна хроматография- вариант на йонообменна хроматография, в

който за определяне на концентрацията на йони на аналита е

използва кондуктометричен детектор. За силно чувствителни операции

При определяне на промените в проводимостта, преминаващи през PF детектора, фоновата проводимост на PF трябва да е ниска.

Има два основни варианта за йонна хроматография.

Първият от тях се основава на потискането на електрическата проводимост на електролизата

PF, използвайки втора йонообменна колона, разположена между ана-

литична колона и детектор. В тази колона се извършва неутрализация

PF и анализираните съединения влизат в детекторната клетка в дейонната

вода. Откритите йони са единствените йони

осигуряване на PF проводимост. Недостатъкът на супресорната колона е необходимостта да се регенерира на доста кратки интервали.

аз Супресорната колона може да бъде заменена с непрекъснато действаща

мембранен супресор, при който съставът на мембраната е непрекъснат

се обновява от потока на регенериращия разтвор, движещ се в посока,

обратно на посоката на PF потока.

Вторият вариант на йонната хроматография е йонната хроматография с една колона.

матография. В тази версия се използва PF с много ниска електрическа проводимост.

съдържание на вода. Слабите органични съединения се използват широко като електролити.

скикови киселини - бензоена, салицилова или изофталова.

ЕКСКЛУЗИВНА HPLC

Хроматографията с изключване по размер (хроматография с изключване по размер) е специален вид HPLC, базиран на разделянето на молекулите по техния размер. Разпределение

молекулите между неподвижната и подвижната фаза се основава на размера на молекулата

лекули и отчасти от тяхната форма и полярност. За разделяне използвайте a

порести сорбенти - полимери, силикагел, порести стъкла и полизахариди.

Размерът на частиците на сорбентите е 5-10 µm.

Предимствата на порьозните стъкла и силикагела са бърза дифузия на PP и молекули на аналита в пори, стабилност при различни условия (дори при високи температури). Полимерен сорбен-

вие сте кополимери на стирен и дивинилбензен (това са хидро-

фобни сорбенти, използвани с неполярни подвижни фази) и

хидрофилни гелове, направени от сулфонирани дивинилбензолни или полиакриламидни смоли.

Възможни са два ограничаващи типа взаимодействие на молекули с пореста неподвижна фаза. Молекулите, чийто размер е по-голям от средния диаметър на порите а, изобщо не проникват в сорбента и се елуират заедно с подвижната фаза.

върви първи. Молекули с диаметър много по-малък от размера на порите на сорбира

benta проникват свободно в него, остават в неподвижна фаза за най-дълго време и се елуират последни. Молекулите със среден размер проникват в порите на сорбента в зависимост от размера и отчасти в зависимост от формата им. Те елуират с различно време на задържане между ca-

нашите най-големи и най-малки молекули. Разделянето на компонентите на хроматографираната проба става в резултат на многократно действие

дифузия на компонентите на пробата в порите на сорбента и обратно.

В хроматография с изключване по размер за характеризиране на задържането на

използва обем на задържане, равен на произведението на скоростта на PF потока и времето на задържане.

Мобилна фаза. Изборът на PP зависи от вида на сорбента. Изключителен-

хроматографията обикновено се разделя на гел филтрация и гел

проникваща хроматография.

За разделяне се използва методът на гел филтрационна хроматография

на водоразтворими съединения върху хидрофилни сорбенти. Подвижните фази са водни буферни разтвори с дадена стойност на рН.

При гел-проникваща хроматография, хидрофобно сор-

бенти и неполярни органични разтворители (толуен, дихлорометан, тет-

рахидрофуран). Този метод се използва за анализ на съединения с ниска разтворимост.

ръб във водата.

Детектори. Диференциалните рефрактометрични детектори, както и спектрофотометричните детектори (включително тези в инфрачервената област на спектъра) се използват като детектори в хроматография с изключване по размер.

Използват се също вискометрични и проточни лазерни детектори.

Тези детектори, в комбинация с рефрактометър или друга концентрация

детектор ви позволява непрекъснато да определяте молекулното тегло на

варовик в PF.

УЛТРА ЕФЕКТИВНА ТЕЧНА ХРОМАТОГРАФИЯ

Свръхефективната течна хроматография е вариант на течна хроматография, който е по-ефективен

в сравнение с класическата HPLC.

Характеристика на ултраефективната течна хроматография е

Използва се използването на сорбенти с размер на частиците от 1,5 до 2 микрона. Размери хр.

матографските колони обикновено са с дължина от 50 до 150 mm и от 1

до 4 мм в диаметър. Обемът на инжектираната проба може да бъде от 1 до 50 μl.

Хроматографско оборудване, използвано в класическата

riante HPLC, обикновено специално адаптиран за този тип хроматография

Оборудването, предназначено за свръхефективна течна хроматография, може да се използва и в класическата версия на HPLC.

Течна хроматография

Течна хроматографияе вид хроматография, при която мобилна фаза, наречен елуент, е течност. Стационарна фазаможе би твърд сорбент, твърд носител с нанесена течност върху повърхността муили гел.

Разграничаване колонени тънък слойтечна хроматография. При колонната версия част от сместа от вещества, които трябва да се отделят, преминава през колона, пълна с неподвижна фаза, в поток от елуент, който се движи под налягане или под действието на гравитацията. При тънкослойна хроматография елюентът се движи под действието на капилярни сили по плосък слой сорбент, нанесен върху стъклена плоча или метално фолио, по порест полимерен филм или по лента от специална хроматографска хартия. Разработен е и метод за тънкослойна течна хроматография под налягане, когато елуентът се изпомпва през сорбентен слой, поставен между плочите.

Има такива видове течна хроматография като аналитичен(за анализ на смеси от вещества) и подготвителен(за изолиране на чисти компоненти).

Разграничаване течна хроматография (LC)в класическия си вариант, извършен при атмосферно налягане, и висока скорост) извършено в високо кръвно налягане... Високоефективната течна хроматография (HPLC) използва колони с диаметър до 5 mm, плътно опаковани със сорбент с малки частици (3-10 микрона). За изпомпване на елуента през колоната се прилага налягане до 3,107 Pa. Този тип хроматография се нарича хроматография под високо налягане... Преминаването на елуента през колоната под високо налягане позволява драстично да се увеличи скоростта на анализа и значително да се увеличи ефективността на разделяне поради използването на фино диспергиран сорбент.

HPLC опцииса микроколонна хроматографиявърху колони с малък диаметър, пълни със сорбент и капилярна хроматографиявърху кухи и пълни със сорбент капилярни колони. HPLC методът понастоящем дава възможност за изолиране, количествено и качествено анализиране на сложни смеси от органични съединения.

Течната хроматография е най-важният физико-химичен метод за изследване в химията, биологията, биохимията, медицината и биотехнологиите. Използва се за:

· Изучаване на метаболитните процеси в живите организми на лекарства;

· Диагностика в медицината;

· Анализ на продукти от химически и нефтохимичен синтез, междинни продукти, багрила, горива, смазочни материали, масла, отпадни води;

· Изучаване на изотермите на сорбция от разтвор, кинетика и селективност на химичните процеси;

Изписване

· Анализ и разделяне на смеси, тяхното пречистване и изолиране на много биологични вещества от тях, като аминокиселини, протеини, ензими, вируси, нуклеинови киселини, въглехидрати, липиди, хормони.

В химията на макромолекулните съединения и при производството на полимери се анализира качеството на мономерите с помощта на течна хроматография, изследва се разпределението на молекулното тегло и разпределението по видове функционалност на олигомери и полимери, което е необходимо за контрол на продукта.

Течната хроматография се използва и в парфюмерията, хранителната промишленост, за анализ на замърсяването на околната среда, в криминалистиката.

Методът на високоефективната течна хроматография (HPLC) е разработен и въведен в средата на 70-те години на XX век. Тогава се появяват първите течни хроматографи.

Течната хроматография е оптималният метод за анализ на химически и термично нестабилни молекули, високомолекулни вещества с намалена летливост. Това може да се обясни със специалната роля на подвижната фаза в LC, за разлика от газовата хроматография: елуентът изпълнява не само транспортна функция.

2. Основни понятия и класификация на методите за течна хроматография.

от механизма на задържане на отделените вещества от неподвижната фаза LCразличавам:

седиментна хроматография

· адсорбционна хроматография , при който разделянето се извършва в резултат на взаимодействието на веществото, с което се отделя адсорбенткато алуминиев оксид или силикагел, имащи на повърхността активни полярни центрове. Разтворител(елуент) - неполярна течност.

Ориз. Схема за разделяне на смес от вещества чрез адсорбционна хроматография

http: // www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

Механизмът на сорбция се състои в специфично взаимодействие между полярната повърхност на сорбента и полярните (или способни на поляризация) области на молекулите на анализирания компонент (фиг.). Взаимодействието възниква поради взаимодействие донор-акцептор или образуване на водородни връзки.

Ориз. Схема за адсорбционна течна хроматография

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "width =" 219 "height =" 200 ">

Ориз. ... Присадена фазова разпределителна хроматография (нормална фаза).

http: // www. chemnet. ru / rus / обучение / масло / spezprakt-chr. html

В нормална фазаПри варианта на разделителна течна хроматография като модификатори на повърхността на силикагела (присадени фази) се използват заместени алкилхлоросилани, съдържащи полярни групи, като нитрил, аминогрупи и др. Използването на присадени фази дава възможност да се контролират фино сорбционните свойства на повърхността на стационарната фаза и да се постигне висока ефективност на разделяне.

Обърната фазатечната хроматография се основава на разпределението на компонентите на сместа между полярния елуент и неполярните групи (дълги алкилови вериги), присадени към повърхността на сорбента (фиг.). По-рядко се използва вариант на течна хроматография с поддържани фази, когато течна неподвижна фаза се прилага върху неподвижна подложка.

Ориз. ... Присадена фазова разпределителна хроматография (версия с обърната фаза). http: // www. chemnet. ru / rus / обучение / масло / spezprakt-chr. html

Разпределителната течна хроматография включва екстракционна течност хроматография, в който неподвижната фаза е органичен екстрагент, отложен върху твърд носител, а подвижната фаза е воден разтвор на съединенията, които трябва да се отделят. Като екстрагенти се използват, например, феноли, триалкилфосфати, амини, кватернерни амониеви основи, както и сяра-съдържащи фосфорорганични съединения. Екстракционната течна хроматография се използва за отделяне и концентриране на неорганични съединения, например йони на алкални метали, актиниди и други елементи с подобни свойства, при обработката на отработено ядрено гориво.

йонообменна хроматография,

йонообменници.

катионообменници

анионити.

амфотерни йонообменници

амфолити

йонит

Катионен обменник

анионити

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (катионен обмен)

R-OH + Na + + Сl - → R-Сl + Na + + OH - (анионен обмен)

Йонообменниците трябва да отговарят на следните изисквания: да са химически стабилни в различни среди, механично здрави в сухо и особено в набъбнало състояние, да имат висока абсорбционна способност и способност да се регенерират добре.

При йонообменна (йонообменна) хроматография отделените аниони (катиони) се откриват като киселини (съответни основи) с високочувствителен кондуктометричен детектор, където високопроизводителните колони се пълнят с повърхностно активен йонообменник с малък капацитет.

йонно-двойна хроматография

лиганд обменна хроматография

различна способност на отделените съединения да образуват комплекси с катиони на преходни метали

хроматография с изключване на размера

разлики в размера на молекулата

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" вдясно "width =" 429 "height =" 319 ">

Ориз. Схема за гел-проникваща хроматография

афинитетна хроматография

Ориз. Схема за афинитетна хроматография

http: // www. chemnet. ru / rus / обучение / масло / spezprakt-chr. html

След това се отстранява от полимера чрез преминаване на разтвор на съединение с още по-голям афинитет към макромолекулата. Такава хроматография е особено ефективна в биотехнологиите и биомедицината за изолиране на ензими, протеини, хормони.

В зависимост от по пътя на транспортирането на веществотосе разграничават следните опции за течна хроматография: изразителен, фронталени изместване.
Най-често се използва изразителенвариант, при който част от сместа за отделяне се въвежда в колоната в потока на елуента. Добивът на компонентите на сместа от колоната се записва на хроматограмата като пикове. (ориз.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "width =" 291 "height =" 165 ">

Ориз. Схема на развиващия се вариант на хроматография

Височинаили пикова площхарактеризира концентрация на компонентите, а Държани томове – качествен състав на сместа... Компонентите обикновено се идентифицират по съвпадение на времената на задържане със стандартните вещества; също се използват химични или физикохимични методи.

В челнаВъв варианта (фиг.) през колоната непрекъснато се пропуска смес от веществата, които трябва да се отделят, която играе ролята на подвижна фаза. В резултат на това само веществото, което е най-малко сорбирано в колоната, може да се получи в чиста форма.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "width =" 279 "height =" 145 ">

Ориз. Схема за фронтална хроматография

Хроматограмата в този случай представлява стъпала, чиито височини са пропорционални на концентрациите на компонентите; задържащите обеми се определят от времето на задържане на компонентите. При диференциране на такава хроматограма се получава картина, подобна на тази, получена в развиващата се версия.

V изместванеВъв вариант, компонентите на сместа, въведени в колоната, се изместват от елуента, който се адсорбира по-силно от всеки компонент. В резултат на това се получават съседни фракции от веществата, които се отделят.Редът на освобождаване на компонентите се определя от силата на взаимодействието им с повърхността на сорбента (фиг.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "width =" 320 "height =" 175 ">

Ориз. Схема за хроматография с изместване

3. Основни хроматографски количества и тяхното определяне.

При разделяне на вещества с помощта на течна хроматография могат да се използват вариантите на проявяване, челно и изместване, както е посочено по-горе. Най-често се използва развиващ вариант, при който част от сместа, която трябва да се отдели, се въвежда в колоната в потока на елуента. Добивът на компонентите на сместа от колоната се записва на хроматограмата като пикове. От хроматограмата (фиг.) Определете:

времена на задържане на неабсорбируеми (t0), отделени компоненти (tR1, tR2, tR3 и др.); ширината на основата на върховете (tw1, tw2 и т.н.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "width =" 61 "height =" 24 src = ">;

б) коригиран обем на задържане на компонента ,

където t "R -коригирано време на задържане на компонентите;

° С) съотношение на капацитета на колоната към даден компонент ;

д) ефективност на колонатахарактеризиращ се с брой еквивалентни теоретични плочи

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "width =" 129 "height =" 51 src = ">;

е) разрешение https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "ширина =" 203 височина = 51 "височина =" 51 ">

Коефициент на капацитет к" оказва значително влияние върху стойността Р S: при промяна к"от 0 до 10 (оптимални граници) Р S нараства силно. смисъл к"се определя от удвоената повърхност на сорбента и неговото количество в колоната, както и от константата на адсорбционното равновесие (константа на Хенри).

Коефициент на селективност αсе определя от разликата в константите на адсорбционното равновесие на двата разделени компонента. С увеличаване на α (от 1 до ~ 5) Р S рязко нараства, с по-нататъшно увеличение на α - се променя малко. Селективността на колоната зависи от фактори като химическата структура на повърхността на сорбента, състава на елуента, температурата на колоната и структурата на съединенията, които трябва да се отделят. Тъй като сорбцията на хроматографирани вещества в течната хроматография се определя от взаимодействието по двойки на трите основни компонента на системата - сорбента, веществата, които трябва да се отделят, и елуента, промяната на състава на елуента е удобен начин за оптимизиране на процес на разделяне.

Ефективност на колонатазависи от размера на частиците и структурата на порите на адсорбента, от еднородността на опаковката на колоната, вискозитета на елуента и скоростта на масопренос. Удължаването на колоната не винаги води до подобрено разделяне, тъй като съпротивлението на колоната се увеличава, налягането на елуента на входа и времето на експеримента се увеличават, а чувствителността и точността на анализа намаляват поради разширяването на пика на анализирания компонент . Ако, тогава пиковете на двете вещества на хроматограмата са почти напълно разделени. С растеж Р S времето за разделяне се увеличава. В РС < 1 - разделянето е незадоволително. При препаративната хроматография, във връзка с въвеждането на относително големи количества отделени вещества, колоната работи с претоварване. Това намалява съотношението на капацитета, увеличава височината, еквивалентна на теоретичната плоча, което води до намаляване на разделителната способност.

4. Адсорбенти

Хроматографското разделяне на сместа ще бъде ефективно, ако адсорбентът и разтворителят (елуентът) са правилно избрани.

Адсорбентът не трябва да взаимодейства химически с отделените компоненти, да проявява каталитичен ефект върху разтворителя. Също така е необходимо адсорбентът да е селективен по отношение на компонентите на сместа. Правилно избраният десикант трябва да има максимална абсорбираща способност.

Разграничаване полярен (хидрофилен)и неполярни (хидрофобни) адсорбенти... Трябва да се помни, че адсорбционният афинитет на полярните вещества към полярните сорбенти е много по-висок от този на неполярните.

Като адсорбенти се използват алуминиев оксид, активен въглен, силикагел, зеолити, целулоза и някои минерали.

Алуминиев оксидAl2O3 – амфотерен адсорбент(фиг.) На него смесите могат да бъдат разделени вещества в полярнии в неполярни разтворители... Неутралния алуминиев триоксид обикновено се използва за хроматография от неводни разтвори на наситени въглеводороди, алдехиди, алкохоли, феноли, кетони и етери.

Ориз. Алуминиев оксид за хроматография

http: // изображения. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активността на Al2O3 зависи от съдържанието на влага. Безводният алуминиев оксид има най-висока активност. Условно се приема като единица. Ако е необходимо, можете да приготвите алуминиев оксид с различно съдържание на влага чрез смесване на прясно приготвен алуминиев оксид с вода (скала на Брокман).

Зависимост на активността на алуминиевия оксид от съдържанието на влага

Например, Al2O3 с активност 1,5-2 се използва за отделяне на въглеводороди; за разделяне на алкохоли и кетони - 2-3,5.

Специфична повърхност на алуминиев оксид 230-380 m2 / g.

Силициев гел(хидроксилиран или химически модифициран) е изсушен желатинов силициев диоксид, който се получава от пренаситени разтвори на силициева киселина ( н SiO2 м H2O) при pH> 5-6. (Фиг.) Твърд хидрофилен сорбент.

Ориз. Силициев гел

http: // www. силициев гел. /

http: // силикагел. ru / изображения / askg. gif

Размерът на частиците на силикагела в аналитичните колони е 3-10 микрона, в препаративните колони - 20-70 микрона. Малкият размер на частиците увеличава скоростта на пренос на маса и подобрява ефективността на колоната. Съвременните аналитични колони са дълги 10-25 см. Те са пълни със силикагел с размер на частиците 5 микрона и позволяват разделянето на сложни смеси от 20-30 компонента. Тъй като размерът на частиците намалява до 3-5 микрона, ефективността на колоната се увеличава, но нейната устойчивост също се увеличава. Така че, за да се постигне скорост на потока на елуента от 0,5-2,0 ml/min, е необходимо налягане от (1-3) · 107Pa. Силикагелът може да издържи на такъв спад на налягането, докато гранулите от полимерен сорбент са по-еластични и деформируеми. Напоследък са разработени механично здрави полимерни сорбенти с макропореста структура с плътна мрежа, които са близки до силикагелите по своята ефективност. Формата на частиците на сорбента с размер 10 μm и повече не оказва голямо влияние върху ефективността на колоната, но се предпочитат сферични сорбенти, които осигуряват по-пропусклива опаковка.(Фиг.)

Ориз. Сферичен силикагел

http: // изображения. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Вътрешната структура на частицата от силикагел е система от комуникационни канали. За течна хроматография се използват сорбенти с диаметър на порите 6-25 nm. Разделянето на течна хроматография се извършва главно върху силикагел, модифициран чрез реакцията на алкил и арилхлорсилани или алкилетоксисилани със силанолни повърхностни групи. С помощта на такива реакции се присаждат групи C8H17-, C18H37- или C6H5- (за получаване на сорбенти с хидрофобизирана повърхност), нитрил, хидроксилни групи и др. (фиг.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "width =" 166 "height =" 116 src = ">

Ориз. Модифицирана структура на силикагел

Силикагеловеизползвани в хроматографията за разделяне на смеси от петролни продукти, по-висока мастни киселини, техните естери, ароматни амини, нитро производни органични съединения. Силициев гел – хидрофилен сорбент, лесно се намокря с вода. Поради това не може да се използва за сорбция от водни разтвори. Активността на силикагела зависи от неговото водно съдържание: колкото по-малко вода съдържа, толкова по-голяма е активността (скала на Брокман).

Зависимост на активността на силикагела от съдържанието на влага

Специфичната повърхност на силикагеловете е 500-600 m2 / g.

Активни въглениса форма на въглерод, която става изключително пореста по време на обработка и придобива много голяма повърхност за адсорбция или химични реакции (фиг.) Те имат специфична повърхност от 1300-1700 m2/g.

Ориз. Активен въглен

http: // електронен каталог. rusbiz. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

Основен ефект върху структурата на порите на активните въглени оказват изходните материали за тяхното производство. Активните въглени на базата на кокосови черупки се характеризират с по-голям дял микропори (до 2 nm), на базата на въглища - по-голям дял мезопори (2-50 nm). Голяма част от макропорите са характерни за активните въглени на дървесна основа (повече от 50 nm). Микропорите са особено подходящи за адсорбция на малки молекули, а мезопорите са особено подходящи за адсорбция на по-големи органични молекули.

зеолити (молекулярни сита)- порести кристални алумосиликати на алкални и алкалоземни метали от естествен и синтетичен произход. (ориз.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "ширина =" 211 височина = 211 "височина =" 211 ">

Ориз. зеолити

http: // www. зеолит. spb. ru / _img / _36 мм. jpg

http: // kntgroup. ru / палец. php? файл = / качвания / продукти / 6.jpg & x_width = 250

Има четири вида зеолити (A, X, Y, M) с различни кристални структури. В зависимост от катиона, зеолитите се обозначават, както следва: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Характеристика на зеолититее това порите на кристалите имат размери от порядъка на 0,4-1 nm, съизмерими с размера на молекулитемного течни или газообразни вещества. Ако молекулите на дадено вещество са в състояние да проникнат в тези пори, тогава се получава адсорбция в порите на зеолитните кристали. По-големите молекули на веществото не се адсорбират. Избирайки зеолити с различен размер на порите, е възможно ясно да се разделят смеси от различни вещества.

Специфичната повърхност на зеолитите е 750-800 m2 / g.

При избора на адсорбент е необходимо да се вземе предвид структурата на веществата и тяхната разтворимост. Например, наситените въглеводороди се адсорбират лошо, докато ненаситените (имат двойни връзки) се адсорбират по-добре. Функционалните групи повишават адсорбционния капацитет на веществото.

5. Елуенти

При избора на разтворител (елюент) е необходимо да се вземе предвид естеството на адсорбента и свойствата на веществата в сместа, която ще се отделя. Елуентите трябва да разтварят добре всички компоненти на хроматографираната смес, да имат нисък вискозитет, да осигуряват необходимото ниво на селективност, да са евтини, нетоксични, инертни и съвместими с методите за откриване (например бензолът не може да се използва като елуент с UV детектор).

Нормалната фазова хроматография обикновено използва въглеводороди (хексан, хептан, изооктан, циклохексан) с добавяне на малки количества хлороформ CHCl3, изопропанол изо-C3H7OH, диизопропилов етер; при обратнофазова хроматография - смес от вода с ацетонитрил CH3CN, метанол CH3OH, етанол C2H5OH, диоксан, тетрахидрофуран, диметилформамид. За изолиране на отделните компоненти на сместа, разделени по време на хроматографията, те често се промиват последователно (елуират). За целта се използват разтворители с различна десорбционна способност. Разтворителите са подредени в низходящ ред на десорбционния капацитет в полярните адсорбенти - елуотропна серия Trappe... Ако компонентите на сместа за отделяне имат близки стойности k "(съотношение на капацитета на колоната по отношение на даден компонент), след което се хроматографира с един елуент. Ако отделните компоненти на сместа се задържат силно от сорбента, се използва серия от елуенти с нарастваща сила.

Елуотропна гама от разтворители

6. Оборудване за течна хроматография

В съвременната течна хроматография се използват устройства с различна степен на сложност - от най-простите системи до хроматографи от висок клас.
Съвременният течен хроматограф включва: контейнери за елуенти, помпи за високо налягане, дозатор, хроматографска колона, детектор, записващо устройство, система за управление и математическа обработка на резултатите.

На фиг. представя блокова схема на течен хроматограф, съдържащ минимално необходимия набор от компоненти, под една или друга форма, присъстващи във всяка хроматографска система.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "width =" 361 "height =" 254 src = ">

Ориз. Схема на течен хроматограф: 1- резервоар за подвижната фаза, 2- помпа, 3- инжектор, 4- колона, 5- термостат, 6- детектори, 7- записваща система, 8- компютър.

Резервоар за съхранениеза мобилната фаза, трябва да има достатъчен капацитет за анализ и устройство за дегазиране на разтворителза да се изключи образуването на мехурчета от газове, разтворени в елуента в колоната и детектора.

помпапредназначени за създаване на постоянен поток от разтворител... Конструкцията му се определя преди всичко от работното налягане в системата. За работа в диапазона от 10-500 MPa се използват помпи тип бутало (спринцовка). Недостатъкът им е необходимостта от периодични спирания за пълнене с елюент. За прости системи с ниско работно налягане от 1-5 MPa се използват евтини перисталтични помпи. Елуентите влизат в помпата през филтър, който задържа прахови частици (повече от 0,2 микрона). Понякога през елуентите се пропуска малък ток от хелий, за да се отстрани разтворения въздух и да се предотврати образуването на мехурчета в детектора (особено в случай на водни и полярни елуенти). В аналитичните хроматографи се използват бутални помпи със система за обратна връзка за подаване на елуента към колоната, което позволява изглаждане на пулсацията на потока в рамките на 1–2% и осигуряване на обемни скорости от 0,1 до 25 ml / min при налягане до ~ 3,107 Ра. При микроколонна хроматография обемните скорости на потока на елуента са много по-ниски - 10-1000 μl / min. При градиентно елуиране се използват няколко помпи, които се управляват от програматор и доставят 2-3 компонента от елуента в смесителната камера, като общият дебит остава постоянен. За да инжектирате проба в колона под високо налягане, без да спирате потока, използвайте специални микродозиращи кранове, свързани към контур с известен обем за изследваната проба от разтвора. Разработени са дозиращи системи с автоматично вземане на проби и инжектиране на проби с помощта на микродозиращи клапани или спринцовки.

Инжекторосигурява инжектиране на проба на смескомпонентите да бъдат разделени в колона с достатъчно висока възпроизводимост. Простите системи за вземане на проби със спирачен поток изискват спиране на помпата и следователно са по-малко удобни от дозаторите Reodyne.

Високоговорителиза HPLC най-често се изработват от полирана тръба от неръждаема стомана с дължина 10-25 cm и вътрешен диаметър 3-5 mm.

Ориз. Хроматографски колони за течна хроматография

Също така използвайте стъклени колонипоставени в метален корпус; в микроколонна хроматография - печатни метални колонис вътрешен диаметър 1,0-1,5 мм, печатни стъклени микроколонис диаметър 70-150 микрона и кухи капилярни колонис диаметър 10-100 микрона; при препаративна хроматография - колони с диаметър от 2 до 10 cm и повече. За равномерно и плътно запълване на колоните със сорбент се използва метод за опаковане на суспензия. Суспензията се приготвя от сорбент и подходяща органична течност, която се подава под налягане до 5 × 107 Pa към колоната. За да определите отделените компоненти, напускащи колонатаизползване детектори. Постоянство на температуратапредоставени термостат.

Детекториза течна хроматография имат проточна клетка, в която има непрекъснато измерване на всяко свойство на течащия елуент. Трябва да са много чувствителни. За повишаване на чувствителността на детектора понякога се използва дериватизация на компонентите на сместа след колоната. За целта с потока на елуента се въвеждат такива реагенти, които, взаимодействайки с отделените вещества, образуват производни с по-изразени свойства, например абсорбират по-силно в UV или видимата област на спектъра или имат по-голяма флуоресцентна способност. Понякога дериватизацията се извършва преди хроматографски анализ и се отделят производните, а не изходните материали. Най-популярните видове детекториобщо предназначение са рефрактометриизмерване индекс на пречупване, и спектрофотометрични детекториопределящи оптичната плътност на разтворителяпри фиксирана дължина на вълната (обикновено в ултравиолетовата област). ДА СЕ Предимства на рефрактометрите(и недостатъци на спектрофотометрите) трябва да се припише ниска чувствителност към вида на връзки, които могат или не могат да съдържат хромофорни групи. От друга страна, използването на рефрактометри е ограничено до изократични системи (с постоянен състав на елуента), така че използването на градиент на разтворителя в този случай не е възможно.

Диференциален "href =" / text / category / differentcial / "rel =" bookmark "> диференциален усилвател и рекордер. интегратор, което ви позволява да изчислите относителните площи на получените върхове. Използване на сложни хроматографски системи интерфейсно устройствосвързване на хроматографа с персонален компютър, който извършва не само събиране и обработка на информация, но и контролира устройството, изчислява количествените характеристики и в някои случаи качествения състав на смесите. Микропроцесоросигурява автоматично инжектиране на проба, промяна от дадена програма за състав на елюентас градиентно елуиране, поддържане температура на колоната.

Брукер“.Ориз. Течен хроматограф Джаско

Въпроси за самотест

Какво е течна хроматография? Назовете неговите видове, области на приложение. Списък заОсновните хроматографски количества и тяхното определяне Какви видове течна хроматография съществуват в зависимост от механизма на задържане на отделените вещества от неподвижната фаза на LC? Какви видове хроматография съществуват в зависимост от начина на транспортиране на веществото? Какви вещества се използват като адсорбенти? Каква е разликата? Какво служи като течна подвижна фаза - елуент? Изисквания за разтворители. Каква е разликата между разделителната хроматография и адсорбционната хроматография? Избройте основните части на веригата на течния хроматограф, тяхното предназначение.

Списък на използваната литература

1 "Течна хроматография в медицината"

Http: // списание. issep rssi. ru / статии / pdf / 0011_035.pdf

2 "Въведение в методите на високоефективната течна хроматография"

HTTP: // www. chemnet. ru / rus / обучение / масло / spezprakt-chr. html

3 "Течна хроматография"

Http: // електронна наука. ru / index /? id = 1540

4 "Хроматография"

Http: // belchem. народ. ru / хроматография1.html

При HPLC като подвижни фази обикновено се използват чисти разтворители или техни смеси.

силикагелът, в сравнение с алуминиевия оксид, има по-широк диапазон на порьозност, повърхност и диаметър на порите;значително по-високата каталитична активност на алуминиевия оксид води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция.

HPLC детектори

Детектори:

Флуоресцентен детектор.Голямата популярност на флуоресцентните детектори се дължи на много високата селективност и чувствителност, както и на факта, че много замърсители на околната среда флуоресцират (например полиароматни въглеводороди).

Електрохимичен детекторсе използват за откриване на вещества, които лесно се окисляват или редуцират: феноли, меркаптани, амини, ароматни нитро- и халогенни производни, кетон алдехиди, бензидини.

Детектори.Регистрацията на изхода от колоната на отделен компонент се извършва с помощта на детектор. За регистрация можете да използвате промяна във всеки аналитичен сигнал, идващ от мобилната фаза и свързан с естеството и количеството на компонента на сместа. В течната хроматография се използват аналитични сигнали като поглъщане на светлина или излъчване на светлина от изходния разтвор (фотометрични и флуорометрични детектори), показател на пречупване (рефрактометрични детектори), потенциал и електрическа проводимост (електрохимични детектори) и др.

Въведение.

Бързото развитие на течната хроматография през последните 10 години се дължи главно на интензивното развитие на теоретичните основи и практическото използване на нейната високоефективна версия, както и на създаването и промишленото производство на необходимите сорбенти и оборудване.

Отличителна черта на високоефективната течна хроматография (HPLC) е използването на сорбенти с размер на зърното 3-10 микрона, което осигурява бърз масообмен с много висока ефективност на разделяне.

В момента HPLC е начело по отношение на скоростта на развитие сред инструменталните методи, надминавайки дори газовата хроматография. Най-важното предимство на HPLC пред газовата хроматография е способността да се изследва почти всеки обект без никакви ограничения върху техните физикохимични свойства, например по точки на кипене или молекулно тегло.

Днес HPLC е добре дефиниран инструментален метод, който се използва широко в различни области на науката и технологиите. Той е особено важен в такива критични области като биохимия, молекулярна биология, контрол на замърсяването на околната среда, както и в химическата, нефтохимическата, хранителната и фармацевтичната промишленост.

тъй като е необходимо да се вземат предвид редица много специфични изисквания поради следните особености на техниката.

а. HPLC колоните са опаковани със среда с много малък диаметър на частиците. В резултат на това върху колоната се генерира високо налягане при обемните скорости на разтворителя, които са необходими за бързото отделяне на пробата.

б. HPLC детекторите са чувствителни към флуктуации в потока на елуента и налягането (шум). Освен това, когато се използват концентрационни детектори, се изисква дори по-висока стабилност на обемната скорост на елуента.

v. Процесът на хроматографско разделяне е придружен от редица антагонистични ефекти, например дисперсията на пробата в подвижната фаза води до смесване на отделените компоненти и намалява максималната концентрация на веществото в елуирания пик (в детектора). Дисперсия се наблюдава във всички части на системата от точката на инжектиране до детектора.

г. Разтворителите, действащи като подвижна фаза, често са корозивни за оборудването. Това се отнася предимно за разтворители, използвани в обратнофазовата хроматография, която се предпочита при биохимични HPLC приложения.

Спецификата на HPLC като инструментална техника трябва да се вземе предвид при разработването, създаването и работата на тези системи. За създаването на търговски образци на хроматографски системи и техните компоненти, които са достатъчно надеждни, прости и безопасни за работа с приемливо съотношение между цена и технически характеристики, бяха необходими повече от десет години търсене и проучване. Последните тенденции към намаляване на колоните (както по дължина, така и по диаметър) налагат нови изисквания към инструментите.

1.1. ЕФЕКТИВНОСТИСЕЛЕКТИВНОСТ

Хроматографията е метод за разделяне на компонентите на смес въз основа на разликата в тяхното равновесно разпределение между две "несмесващи се фази, едната от които е неподвижна, а другата е подвижна. Компонентите на пробата се движат по протежение на колоната, когато са в подвижна фаза и остават на място, когато са Колкото по-голям е афинитетът на компонента към неподвижната фаза и по-малък към подвижната фаза, толкова по-бавно се движи по колоната и толкова по-дълго остава в нея. Поради разликата в афинитета на компонентите от сместа до стационарния и приемливия период от време на сместа в отделни ленти (върхове) на компонентите при движението им през колоната с подвижната фаза.

От тези общи концепции става ясно, че хроматографското разделяне е възможно само ако компонентите на пробата, влизащи в колоната по време на инжектирането на пробата, първо, ще бъдат разтворени в подвижната фаза и, второ, ще взаимодействат (задържат) със стационарната фаза. . Ако по време на инжектирането на пробата някои компоненти не са под формата на разтвор, те ще бъдат филтрирани и няма да участват в хроматографския процес. По същия начин, компоненти, които не взаимодействат с неподвижната фаза, ще преминат през колоната с подвижната фаза, без да се разделят на компоненти.

Нека приемем условието, че някои два компонента са разтворими в подвижната фаза и взаимодействат със стационарната фаза, тоест хроматографският процес може да протича без смущения. В този случай, след преминаване на сместа през колоната, могат да се получат хроматограми на формата а, били v(фиг. 1.1). Тези хроматограми илюстрират хроматографски разделяния, които се различават по ефективност. (аи б) с еднаква селективност и селективност (би v)с еднаква ефективност.

Колкото по-ефективна е колоната, толкова по-тесен е пикът при същото време на задържане. Ефективността на колоната се измерва чрез броя на теоретичните плочи (PTT) н: толкова по-висок е ефектът

Ориз. 1.2. Параметри на хроматографския пик и изчисляване на броя на теоретичните плаки:

t R - времето на задържане на пика; з - височина на пика; Wj / j - ширина на пика на половината височина

Ориз. 1.1. Тип хроматограма в зависимост от ефективността и селективността на колоната:

а- конвенционална селективност, намалена ефективност (по-малко теоретични плочи); b - конвенционална селективност и ефективност; v -конвенционална ефективност, повишена селективност (по-голямо съотношение на времената на задържане на компонентите)

ефективност, колкото по-голям е FTT, толкова по-малко е разширението на пика на първоначално тясната лента, докато преминава през колоната, толкова по-тесен е пикът на изхода от колоната. PTT характеризира броя на етапите за установяване на равновесие между подвижната и неподвижната фаза.

Познаване на броя на теоретичните плочи на колона и дължината на колоната Л (μm), както и средния диаметър на зърното на сорбента г в (μm), лесно е да се получат стойностите на височината, еквивалентна на теоретичната плоча (VETT), както и намалената височина, еквивалентна на теоретичната плоча (PVETT):

HETT = Л/ н

PVETT = B3TT / d c.

Имайки стойностите на PTT, HETT и PVETT, можете лесно да сравните ефективността на колони от различен тип, различни дължини, пълни със сорбенти с различно естество и размер на зърното. Чрез сравняване на CTT на две колони с еднаква дължина, производителността се сравнява. При сравняване на HETT се сравняват колони със сорбенти с еднакъв размер на зърното и различни дължини. И накрая, стойността на PVETT дава възможност за всякакви две колони да оценят качеството на сорбента, първо, и качеството на запълване на колоните, и второ, независимо от дължината на колоните, гранулирането на сорбента по своя характер.

Селективността на колоната играе важна роля за постигане на хроматографско разделяне.

Селективността на колона зависи от много фактори, а умението на експериментатора до голяма степен се определя от способността да се влияе върху селективността на разделяне. За това хроматографът има три много важни фактора: изборът на химичната природа на сорбента, изборът на състава на разтворителя и неговите модификатори и отчитането на химичната структура и свойствата на отделените компоненти. Понякога промяната в температурата на колоната има забележим ефект върху селективността, която променя коефициентите на разпределение на веществата между подвижната и неподвижната фаза.

Когато се разглежда разделянето на два компонента в хроматограмата и се оценява, разделителната способност е важен параметър. R s, който свързва времето на излизане и ширините на пика на двата отделни компонента

Разделителната способност, като параметър, характеризиращ разделянето на пиковете, се увеличава с увеличаване на селективността, отразено от увеличаване на числителя, и увеличаване на ефективността, отразено в намаляване на знаменателя поради намаляване на ширината на пиковете. Следователно бързият напредък на течната хроматография доведе до промяна в концепцията за „течна хроматография с високо налягане“ – тя беше заменена с „течна хроматография с висока разделителна способност“ (докато съкратената форма на термина на английски език остана HPLC като най-правилно характеризиращо посоката на развитие на съвременната течна хроматография).

По този начин размазването в колоната се намалява и ефективността се повишава при използване на по-фин сорбент, по-равномерен по състав (тясна фракция), по-плътно и равномерно набит в колоната, използвайки по-тънки слоеве от присадената фаза, по-малко вискозни разтворители и оптимален поток ставки.

Въпреки това, наред с размазването на лентата на хроматографската зона по време на процеса на разделяне в колоната, тя може да бъде замъглена и в устройството за въвеждане на пробата, в свързващите капиляри инжектор - колона и колона - детектор, в детекторната клетка и в някои спомагателни устройства (микрофилтри за улавяне на механични частици от проби, монтирани след инжектора, защитни колони, реактори с намотки и т.н.) - Колкото по-голям е обемът на извънколоната в сравнение с обема на задържащия пик, толкова по-голямо е размазването. Също така има значение къде се намира мъртвият обем: колкото по-тесен е хроматографският извик, толкова по-голямо замъгляване ще даде мъртвия обем. Ето защо трябва да се обърне специално внимание на дизайна на тази част от хроматографа, където хроматографската зона е най-тясна (инжектор и устройства от инжектора до колоната) - тук ерозията извън колона е най-опасна и има най-силен ефект. Въпреки че се смята, че в добре проектираните хроматографи източниците на допълнително извънколонно разреждане трябва да бъдат сведени до минимум, въпреки това всяко ново устройство, всяка промяна на хроматографа трябва задължително да завършват с тестване на колоната и сравняване на получената хроматограма с паспортната. Ако се наблюдава пиково изкривяване, рязко намаляване на ефективността, нововъведените капиляри и други устройства трябва да бъдат внимателно проверени.

Промиването извън колоната и погрешното изчисление могат да доведат до значителна (повече от 50%) загуба на ефективност, особено в случаите, когато се опитват да се използват сравнително дългосрочни хроматографи за високоскоростна HPLC, микроколонна HPLC и други съвременни опции за HPLC, които изискват микроинжектори , свързващи капиляри с вътрешен диаметър 0,05-0,15 mm минимална дължина, колони с капацитет 10-1000 μl, детектори с микро кювети с капацитет 0,03-1 μl и с висока скорост, високоскоростни записващи устройства и интегратори.

1.2. ЗАДЪРЖАНЕ И СКОРОСТ НА РАЗТВОРИТЕЛЯ

За да се отделят аналитите на колоната, както бе споменато по-горе, коефициентът на капацитет к" трябва да бъде по-голямо от 0, т.е. веществата трябва да се задържат от неподвижната фаза, сорбента. Въпреки това, коефициентът на капацитет не трябва да бъде твърде висок, за да се получи приемливо време за елуиране. Ако за дадена смес от вещества се избере стационарна фаза, която ги задържа, тогава по-нататъшната работа по разработването на аналитичен метод се състои в избора на разтворител, който в идеалния случай ще осигури различен за всички компоненти, но приемливо не много голям к". Това се постига чрез промяна на силата на елуиране на разтворителя.

В случай на адсорбционна хроматография върху силикагел или алуминиев оксид, като правило, силата на двукомпонентния разтворител (например хексан с добавка на изопропанол) се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на полярния компонент (изопропанол), или намалява чрез намаляване на съдържанието на изопропанол. Ако съдържащият полярен компонент стане твърде малък (по-малко от 0,1%), той трябва да бъде заменен с по-слаб по сила на елуиране. Същото се прави, като се заменят или полярният, или неполярният компонент с други, и в случай, че дадена система не осигурява желаната селективност по отношение на компонентите на сместа, които представляват интерес. При избора на разтворителна система се вземат предвид както разтворимостта на компонентите на сместа, така и елуотропните серии от разтворители, съставени от различни автори.

Приблизително по същия начин силата на разтворителя се избира в случай на използване на присадени полярни фази (нитрил, амино, диол, нитро и др.), като се вземат предвид възможните химични реакции и се изключват разтворители, които са опасни за фазата ( например кетони за аминофазата).

В случай на обратнофазова хроматография силата на разтворителя се увеличава чрез увеличаване на съдържанието на органичната съставка (метанол, ацетонитрил или THF) в елуента и се намалява чрез добавяне на повече вода. Ако не е възможно да се постигне желаната селективност, използвайте различен органичен компонент или опитайте да го смените с различни добавки (киселини, реагенти с йонни двойки и т.н.).

При разделяне чрез йонообменна хроматография силата на разтворителя се променя чрез увеличаване или намаляване на концентрацията на буферния разтвор или промяна на рН; в някои случаи се използва модификация с органични вещества.

Въпреки това, особено в случай на сложни природни и биологични смеси, често не е възможно да се избере силата на разтворителя по такъв начин, че всички компоненти на пробата да се елуират в рамките на разумно време. След това е необходимо да се прибегне до градиентно елуиране, тоест да се използва разтворител, чиято сила на елуиране се променя по време на анализа, така че постоянно да се увеличава по предварително определена програма. Тази техника позволява да се постигне елуиране на всички компоненти на сложни смеси за относително кратък период от време и разделянето им на компоненти под формата на тесни пикове.

1.3. РАЗМЕР НА СОРБЕНТНИ ЧАСТИЦИ, ПРОПУСКАНОСТ И ЕФЕКТИВНОСТ

Когато разглеждаме размазването на колоната, ние посочихме, че ефективността на колоната (HETP) зависи от размера на частиците на сорбента. До голяма степен бързото развитие на HPLC през последните 10-12 години беше причинено, първо, от разработването на методи за получаване на сорбенти с размер на частиците от 3 до 10 μm и с тесен фракционен състав, осигуряващи висока ефективност с добра пропускливост и, второ, чрез разработването на методи за пълнене на колони с тези сорбенти; и, трето, разработването и серийното производство на течни хроматографи с помпи за високо налягане, инжектори и детектори с кювети с малък обем, способни да регистрират малки - пикове на обема.

За добре опаковани суспензионни колони, теоретичната еквивалентна височина на плочата (PVETT) може да бъде 2, независимо дали за опаковане се използват 3, 5, 10 или 20 µm частици. В този случай ще получим съответно колони (със стандартна дължина 250 mm) с ефективност 41670, 25000, 12500 и 6250 tt. Изглежда естествено да се избере най-ефективната колона, пълна с 3 µm частици. Тази ефективност обаче ще дойде за сметка на много високи налягания и относително ниски скорости на разделяне, тъй като една съществуваща помпа вероятно ще може да изпомпва разтворител през такава колона с висока пространствена скорост. Тук просто сме изправени пред въпроса за връзката между размера на частиците на сорбента, ефективността и пропускливостта на колоните.

Ако изразим от това коефициента на съпротивление на колоната - безразмерна величина, получаваме следното уравнение:

Коефициентът на съпротивление за колони, пълни с микрочастици от един и същи тип, използващи същия метод, се променя незначително и възлиза на следните стойности:

Тип частица ".... Неправилна сферична

формуляр

Суха опаковка. ... ... ... ... 1000-2000 800-1200

Опаковка за суспензия. ... ... 700-1500 500-700

Входното налягане в колоната е пропорционално на линейния дебит, коефициента на съпротивление на колоната, вискозитета на разтворителя и дължината на колоната и е обратно пропорционално на квадрата на диаметъра на частиците.

Прилагайки тази зависимост за горните колони с частици с диаметър 3, 5, 10 и 20 μm и приемайки постоянен линеен дебит, коефициент на съпротивление на колоната и вискозитет на разтворителя, получаваме за колони с еднаква дължина съотношението на входното налягане 44: 16: 4: 1. По този начин, ако за сорбент с обърната фаза с размер на частиците от 10 микрона при използване на системи с разтворители метанол -. вода (70:30), обикновено на стандартна колона при скорост на потока на разтворителя 1 ml/min, налягането на входа на колоната е 5 MPa, след това за 5 μm частици - 20 MPa и за 3 μm - 55 MPa . При използване на силикагел и по-малко вискозна разтворителна система хексан - изопропанол (100: 2), стойностите ще бъдат значително по-ниски: съответно 1, 4 и 11 MPa. Ако в случай на сорбент с обърната фаза използването на частици с размер 3 μm е много проблематично, а 5 μm е възможно, но не на всички устройства, тогава за сорбент с нормална фаза няма проблеми с налягане. Трябва да се отбележи, че съвременният високоскоростен HPLC се характеризира с използването на по-висок разход на разтворители, отколкото в горния пример, следователно изискванията за налягане се увеличават още повече.

Въпреки това, в случаите, когато разделянето изисква определен брой теоретични плочи и е желателно да се извърши високоскоростен анализ, картината се променя донякъде. Тъй като дължините на колоните със сорбенти с размер на зърното 3, 5, 10 микрона с еднаква ефективност ще бъдат съответно 7,5; 12,5 и 25 см, тогава съотношението на налягането на входа към колоните ще се промени на 3: 2: 1. Съответно, продължителността на анализа на такива колони с еднаква ефективност ще бъде съотнесена като 0,3: 0,5: 1, т.е. при преминаване от 10 до 5 и 3 μm, продължителността на анализа ще бъде намалена с 2 и 3,3 пъти. Това ускоряване на анализа идва с цената на пропорционално по-високо входно налягане в колоната.

Представените данни са валидни за случаите, когато сорбентите с различен размер на зърното имат еднакви криви на гранулометрично разпределение, колоните са опаковани по същия начин и имат същия коефициент на съпротивление на колоната. Трябва да се има предвид, че трудността за получаване на тесни фракции от сорбента се увеличава с намаляване на размера на частиците и това. фракциите от различни производители имат различен фракционен състав. Следователно коефициентът на съпротивление на колоната ще варира в зависимост от размера на зърното, вида на сорбента, метода на опаковане на колоната и т.н.

КЛАСИФИКАЦИЯ НА HPLC МЕТОДИ ПО МЕХАНИЗЪМ НА СЕПАРАЦИЯ

Повечето от разделянията, извършени чрез HPLC метода, се основават на смесен механизъм на взаимодействие на вещества със сорбент, който осигурява повече или по-малко задържане на компонентите в колоната. Механизмите на разделяне в повече или по-малко чиста форма са доста редки на практика, например адсорбционните механизми при използване на абсолютно безводен силикагел и безводен хексан за отделяне на ароматни въглеводороди.

Със смесен механизъм на задържане за вещества с различни структури и молекулни тегла е възможно да се оцени приносът към задържането на адсорбция, разпределение, изключване и други механизми. Въпреки това, за по-добро разбиране и разбиране на механизмите на разделяне в HPLC, препоръчително е да се разглеждат разделянията с преобладаване на един или друг механизъм като принадлежащи към определен тип хроматография, например към йонообменна хроматография.

2.1.1 АДСОРБЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разделянето чрез адсорбционна хроматография се извършва в резултат на взаимодействието на вещество с адсорбенти, като силикагел или алуминиев оксид, които имат активни центрове на повърхността. Разликата в способността да взаимодействат с адсорбционните центрове на различните молекули на пробата води до разделянето им на зони по време на движението с подвижната фаза по колоната. Разделянето на зоните на компонентите, постигнато в този случай, зависи от взаимодействието както с разтворителя, така и с адсорбента.

Сорбцията върху повърхността на адсорбент с хидроксилни групи се основава на специфично взаимодействие между полярната повърхност на адсорбента и полярните (или поляризуеми) групи или области на молекулите. Тези взаимодействия включват дипол-диполно взаимодействие между постоянни или индуцирани диполи, образуване на водородна връзка до образуването на n-комплекси или комплекси за пренос на заряд. Възможна и доста често срещана в практическата работа е проявата на химиосорбция, която може да доведе до значително увеличаване на времето на задържане, рязко намаляване на ефективността, поява на продукти на разпадане или необратима сорбция на вещество.

Адсорбционните изотерми на веществата имат линейна, изпъкнала или вдлъбната форма. При линейна изотерма на адсорбция пикът на веществото е симетричен и времето на задържане не зависи от размера на пробата. Най-често адсорбционните изотерми на веществата са нелинейни и имат изпъкнала "форма, което води до известна асиметрия на пика с образуването на опашка.

Силикагелните адсорбенти с различни обеми на порите, повърхности и диаметри на порите са най-широко използвани в HPLC. Алуминият се използва много по-рядко и изключително рядко други адсорбенти, широко използвани в класическата колонна и тънкослойна хроматография. Основната причина за това е недостатъчната механична якост на повечето други адсорбенти, което не позволява те да бъдат опаковани и използвани при повишени налягания, характерни за сушилните с високо налягане.

Полярните групи, отговорни за адсорбцията и разположени на повърхността на силикагел и алуминиев оксид, са сходни по свойства. Следователно редът на елуиране на смеси от вещества и елуотропният диапазон на разтворителите обикновено са еднакви за тях. Въпреки това, разликата в химичната структура на силикагел и алуминиев оксид понякога води до различия в селективността; в този случай се дава предпочитание на един или друг адсорбент, който е по-подходящ за дадена конкретна задача. Например, алуминиевият триоксид осигурява по-голяма селективност при отделянето на някои полиядрени ароматни въглеводороди.

Предпочитанието, което обикновено се дава на силикагел пред алуминиев оксид, се обяснява с по-широк избор на силикагелове по отношение на порьозност, повърхност и диаметър на порите, както и много по-висока каталитична активност на алуминиев оксид, което често води до изкривяване на резултатите от анализа поради разлагането на компонентите на пробата или тяхната необратима хемосорбция. ...

2.1.2 Недостатъци на адсорбционната хроматография, ограничаващи нейното използване

Популярността на адсорбционната хроматография постепенно намалява с развитието на HPLC метода, тя все повече и повече се заменя и продължава да бъде заменена от други опции, като обратнофазова и нормална фаза HPLC върху сорбенти с присадена фаза. Какви са недостатъците на адсорбционната хроматография, довели до това?

На първо място, това е дългата продължителност на процесите на уравновесяване на адсорбенти с разтворители, съдържащи вода в следи от количества, трудността при приготвянето на такива разтворители с определено и възпроизводимо съдържание на влага. Това води до лоша възпроизводимост на параметрите на задържане, разделителна способност, селективност. По същата причина е невъзможно да се използва градиентно елуиране - връщането в първоначалното състояние е толкова дълго, че значително надвишава печалбата във времето поради използването на градиент.

Значителни недостатъци на адсорбентите, особено на алуминиевия оксид, свързани с чести пренареждания на съединения, чувствителни към катализа, тяхното разлагане, необратима сорбция, също са добре известни и са многократно отбелязани в литературата. Необратимо сорбираните вещества, натрупващи се в началния участък на колоната, променят естеството на сорбента, могат да доведат до повишаване на съпротивлението на колоната или дори до пълното й запушване. Последният недостатък може да бъде отстранен чрез използване на защитна колона, която На-С увеличаване на съпротивлението и възникване на запушване, той се заменя с нов * или се пълни с нов сорбент. Въпреки това, необратимата сорбция, която също се случва в този случай, води до хроматограма, в която компонентите на пробата, чувствителни към сорбция или каталитично разлагане, отсъстват напълно или частично.

2.2. ДИСТРИБУЦИОННА ХРОМАТОГРАФИЯ

Разпределителната хроматография е вариант на HPLC, при който разделянето на сместа на компоненти се извършва поради разликата в техните коефициенти на разпределение между две несмесващи се фази: разтворител (подвижна фаза) и фаза върху сорбент (неподвижна фаза). Исторически, първите са сорбенти от този тип, които са получени чрез отлагане на течни фази (оксидипропионитрил, парафиново масло и др.) върху порести носители, подобно на това как се приготвят и приготвят сорбентите за газо-течна хроматография (GLC). Недостатъците на такива сорбенти обаче бяха открити незабавно, основният от които беше сравнително бързото отмиване на фазата от носителя. Поради това количеството фаза в колоната постепенно намалява, времето на задържане също намалява и адсорбционните центрове, които не са покрити от фазата, се появяват в началния участък на колоната, причинявайки образуването на пикови опашки. Този недостатък се бори чрез насищане на разтворителя с отложената фаза дори преди да влезе в колоната. Преносът също намалява, когато се използват по-вискозни и по-малко разтворими полимерни фази, но в този случай, поради дифузия от дебели полимерни филми, ефективността на колоните е значително намалена.

Оказа се логично течната фаза да се присади към носителя чрез химични връзки по такъв начин, че нейното увличане да стане физически невъзможно, тоест да се трансформира носителят и фазата в едно цяло - в т.нар. сорбент.

В бъдеще усилията на изследователите бяха насочени към търсене на реагенти, чието присаждане щеше да протича сравнително бързо и напълно, а образуваните връзки бяха възможно най-стабилни. Алкилхлорсиланите и техните производни се превърнаха в такива реагенти, които направиха възможно получаването на сорбенти от присадена фаза от различни видове и с различни както полярни, така и неполярни групи на повърхността, като се използва подобна технология.

Успешното използване на последния тип сорбенти за HPLC насърчава растежа на тяхното производство от различни производители. Всяка компания произвежда такива сорбенти, като правило, на базата на свой собствен тип силикагел и по собствена технология, която обикновено представлява "ноу-хау" на производството. В резултат на това голям брой сорбенти, които са химически наречени точно еднакви (например силикагел с присаден октадецилсилан) имат много различни хроматографски характеристики. Това се дължи на факта, че силикагелът може да има по-широки или по-тесни пори, различна повърхност, порьозност, повърхността му преди присаждане може да бъде хидроксилирана или не, моно-, ди- или трихлорсилани могат да бъдат присадени, условията на присаждане могат да дадат мономерни, полимерни или смесен фазов слой се използват различни методи за отстраняване на остатъчни реагенти, може да се използва или не се използва допълнително дезактивиране на силанол и други активни групи.

Сложността на технологията на присаждане на реагенти и подготовка на суровини и материали, нейната многоетапна природа водят до факта, че дори партиди сорбенти, получени по една и съща технология от една и съща производствена компания, могат да имат малко по-различни хроматографски характеристики. Това е особено вярно, когато такива сорбенти се използват за анализ на многокомпонентни смеси, съдържащи вещества, които се различават значително по броя и положението на функционалните групи, по отношение на функционалността.

Като се има предвид горното, винаги трябва да се стремите * да използвате метода за анализ, описан в литературата, да използвате точно същия сорбент и същите работни условия. В този случай вероятността работата да не може да бъде възпроизведена е минимална. Ако това не е възможно, но се вземе сорбент от друга фирма с подобна присадена фаза, трябва да сте подготвени за факта, че модифицирането на техниката ще отнеме много време. В същото време съществува възможност (и трябва да се има предвид) необходимото разделяне да не бъде постигнато върху този сорбент дори след дългосрочно разработване. Наличието в литературата на много описани техники за разделяне върху стари сорбенти, произведени за дълго време, стимулира по-нататъшното им производство и използване по тази причина. Въпреки това, в случаите, когато е необходимо да се премине към разработването на оригинални методи, особено по отношение на вещества, склонни към разлагане, хемосорбция, прегрупиране, е препоръчително да се започне работа върху сорбенти, които са били наскоро разработени и произведени с помощта на нови, подобрени технологични опции. Новите сорбенти имат по-равномерен фракционен състав, по-равномерно и пълно покритие на повърхността с присадената фаза и по-съвършени крайни етапи на обработка на сорбента.

2.3. ЙОНООБМЕННА ХРОМАТОГРАФИЯ

При йонообменната хроматография разделянето на компонентите на сместа се постига благодарение на обратимото взаимодействие на йонизиращите се вещества с йонните групи на сорбента. Запазването на електронеутралността на сорбента се осигурява от наличието на противойони, способни на йонообмен, разположени в непосредствена близост до повърхността. Йонът на въведената проба, взаимодействащ с фиксиран заряд на сорбента, се обменя с противойон. Веществата с различен афинитет "към фиксирани заряди се разделят върху анионити или върху катиони. Анионитите имат положително заредени групи на повърхността и сорбират аниони от подвижната фаза. Катионитите, съответно, съдържат групи с отрицателен заряд, взаимодействащи с катиони.

Като подвижна фаза се използват водни разтвори на соли на киселини, основи и разтворители като течен амоняк, т.е. системи разтворители с висока диелектрична константа e и голяма склонност към йонизиране на съединения. Обикновено те работят с буферни разтвори, които позволяват регулиране на pH стойността.

При хроматографско разделяне йоните на аналита се конкурират с йоните, съдържащи се в елуента, стремейки се да взаимодействат с противоположно заредените групи на сорбента. От това следва, че йонообменната хроматография може да се използва за разделяне на всякакви съединения, които могат да бъдат йонизирани по какъвто и да е начин. Възможно е да се анализират дори неутрални захарни молекули под формата на техните комплекси с боратен йон:

Захар + VO 3 2 - = Захар -VO 3 2 -.

Йонообменната хроматография е незаменима за разделянето на силно полярни вещества, които не могат да бъдат анализирани чрез GLC без превръщане в производни. Такива съединения включват аминокиселини, пептиди, захари.

Йонообменната хроматография намира широко приложение в медицината, биологията, биохимията, за контрол на околната среда, при анализ на съдържанието на лекарства и техните метаболити в кръвта и урината, пестициди в хранителни суровини, както и за отделяне на неорганични съединения, в т.ч. радиоизотопи, лантаноиди, актиниди и др. Анализ на биополимери (протеини, нуклеинови киселини и др.), който обикновено отнема часове или дни, с помощта на йонообменна хроматография се извършва за 20-40 минути с по-добро разделяне. Използването на йонообменна хроматография в биологията направи възможно наблюдението на проби директно в биологична среда, намалявайки възможността за пренареждане или изомеризация, което може да доведе до погрешно тълкуване на крайния резултат. Интересно е да се използва този метод за контролиране на промените в биологичните течности. Използването на порести слаби анионообменници на базата на силикагел направи възможно разделянето на пептидите. V

Механизмът на йонообмен може да бъде представен под формата на следните уравнения:

за анионен обмен

X- + R + Y- з ->■ Y- + R + X-.

за катионен обмен |

X + + R-Y + h = * Y ++ R-X +.

В първия случай йонът на пробата X ~ се конкурира с йона на подвижната фаза Y ~ за йонните центрове R + на йонообменника, а във втория катионите на пробата X + влизат в конкуренция с йони на подвижната фаза Y + за йонните центрове на R ~.

Естествено, йоните на пробата, слабо взаимодействащи с йонообменника, с тази конкуренция ще бъдат слабо задържани върху колоната и първи се отмиват от нея, и обратно, по-силно задържаните йони ще бъдат последните. се елуира от колоната. Обикновено взаимодействията на BTqpH4Hbie от нейонна природа възникват поради адсорбция или водородни връзки на пробата с нейонната част на матрицата или поради ограничената разтворимост на пробата в подвижната фаза. Трудно е да се изолира "класическата" йонообменна хроматография в "чиста" форма и затова някои хроматографи изхождат от емпирични, а не от теоретични принципи в йонообменната хроматография.

Разделянето на специфични вещества зависи преди всичко от избора на най-подходящия сорбент и подвижна фаза. Като стационарни фази в йонообменната хроматография се използват йонообменни смоли и силикагелове с присадени йоногенни групи.

2.4. ЕКСКЛУЗИВНА ХРОМАТОГРАФИЯ

Изключваща хроматография е опция! течна хроматография, при която разделянето става поради разпределението на молекулите между разтворителя вътре в порите на сорбента и изтичащия разтворител " между неговите частици.

За разлика от други опции за HPLC, където разделянето отиваПоради различните взаимодействия на компонентите с повърхността на сорбента, ролята на твърдия пълнител в хроматографията с изключване по размер е само в образуването на пори с определен размер, а неподвижната фаза е разтворителят, който запълва тези пори. Следователно, прилагането на термина "сорбент" към тези пълнители е до известна степен произволно.

Основна характеристика на метода е способността да се разделят молекулите по техния размер в разтвор в диапазона на практически всякаква молекулна маса - от 10 2 до 10 8, което го прави незаменим за изследване на синтетични и биополимери.

Традиционно процесът, провеждан в органични разтворители, все още често се нарича гел-проникваща хроматография, а във водните системи - гел-филтрационна хроматография. В тази книга за двата варианта е възприет един термин, който идва от английското „Изключване на размера“ – изключение по размер – и отразява в най-голяма степен механизма на процеса.

Подробен анализ на съществуващите идеи за много сложна теория на процеса на хроматография с изключване по размер е извършен в монографии.

Общ обем разтворител в колоната Vt (това често се нарича общ обем на колоната, тъй като Vd не участва в хроматографския процес) е сумата от обемите на подвижната и неподвижната фаза.

Задържането на молекули в колоната за изключване се определя от вероятността за тяхната дифузия в порите и зависи от съотношението на размерите на молекулите и порите, което е схематично показано на фиг. 2.15. Коефициент на разпределение ка,както и при други варианти на хроматография, е съотношението на концентрациите на веществото в неподвижната и подвижната фаза.

Тъй като подвижната и неподвижната фаза имат еднакъв състав, тогава Kd вещество, за което и двете фази са еднакво достъпни, е равно на единица. Тази ситуация се реализира за най-малките C молекули (включително молекулите на разтворителя), които проникват във всички пори (виж фиг. 2.15) и следователно се движат през колоната най-бавно. Техният задържащ обем е равен на общия обем на разтворителя Vt-

Ориз. 2.15. Модел за разделяне на молекули чрез хроматография с изключване по размер

Всички молекули, чийто размер е по-голям от размера на порите на сорбента, не могат да попаднат в тях (пълно изключване) и да преминат през каналите между частиците. Те се елуират от колоната със същия задържащ обем, равен на обема на подвижната фаза V 0 - Коефициентът на разпределение за тези молекули е нула.

Молекули със среден размер, способни да проникнат само в част от порите, се задържат в колоната в съответствие с техния размер. Коефициентът на разпределение на тези молекули варира от нула до единица и характеризира частта от обема на порите, достъпна за молекули с даден размер.Техният задържащ обем се определя от сумата на Y около и наличната част от обема на порите.

КАЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Хроматографът, започващ с високоефективна течна хроматография, трябва да е запознат с основите на качествения анализ. Качественият анализ се използва за идентифициране на познат продукт, получен по нов начин или в смес с други продукти.„Необходим е за изолирането на различни компоненти от сложни биологични, химични смеси, което е особено важно в медицината, криминалистиката, екологията. , да контролира местоположението на някои лекарствени химични продукти и техните метаболити в биоматериали.. „." Познаването на основите на качествения "анализ ще помогне да се избегнат типични грешки, например / за разграничаване на примеси в проба от примеси в разтворител или за проверява чистотата на веществото на повече от един спектрофотометър с дължина на вълната и на различни и т.н.

Преди да се пристъпи към анализа, е необходимо да се установи дали цялата проба се елуира от колоната с тази система от разтворители или не. За да сте сигурни в пълното елуиране, е необходимо да се събере цялата течност, изтичаща от колоната, да се изпари разтворителят, да се претегли остатъкът и да се намери степента на извличане на пробата.

Идентификацията на компонентите в HPLC може да се извърши по три начина: 1) използване на информация за задържане; 2) изследвайте зоните, получени по време на разделяне в колона за течен хроматограф, използвайки спектрални или химични методи за анализ; 3) директно свържете спектралния анализатор към колоната.

Обемът на задържане се използва за записване на пикове в хроматографията. V R или време на задържане t R. И двете количества са характерни за дадено вещество в дадена хроматографска система. Тъй като времето на задържане на веществото, което трябва да се отдели, се състои от времето на взаимодействие в колоната и времето за преминаване на празните участъци от тръбата, то варира от устройство до устройство. Удобно е да има вещество, което не се задържа от дадена колона, като се приема за стандарт, чието време на задържане и обем T 0 , V o. Хроматографията на веществото и стандарта трябва да се извърши при едни и същи условия (налягане и скорост на потока). Когато се идентифицират чрез данни за задържане, известните отделни вещества, които могат да присъстват в пробите, се разделят в същата хроматографска система и се получават стойности за тях. t R. Сравняване на тези стойности t R с времето на задържане на неизвестния пик може да се установи, че те или съвпадат и тогава е вероятно пиковете да съответстват на едно и също вещество, или t R известното вещество не съвпада t R неизвестна зона. Тогава все още е възможна груба оценка на стойностите t R вещества, които не са достъпни за директно измерване на степента на тяхното задържане. Нека разгледаме и двата варианта.

В първия случай очевидно е необходимо предварително проучване на пробата, за да се постулира наличието на специфични вещества в нея. При работа с прости смеси е лесно да се определи дали степента на задържане на пробните зони и познатите вещества съвпада или не, т.е. т Б са еднакви или различни. В случай на сложни смеси, няколко вещества наведнъж могат да се елуират със сходни стойности. t R, и зоните, действително получени чрез хроматографско разделяне, се припокриват. В резултат на това се получават точни стойности t R за различни зони става невъзможно. Надеждността на идентификацията се увеличава с увеличаване на разделителната способност, по-внимателен контрол на условията на разделяне и многократно измерване на стойности t R и осредняване на намерените стойности. В този случай хроматографското разделяне на известни и неизвестни вещества трябва да се редува. При разделяне на сложни смеси, стойността t R веществата могат да се променят под въздействието на матрицата на самата проба. Този ефект е възможен в началото на хроматограмата и с припокриващи се пикове; възможно е и затягане на зоните, което вече беше споменато.

В такива случаи добавете стандарта към пробата в съотношение 1: 1. Ако веществата са идентични, стойността t R изходният материал не се променя и на хроматограмата се получава само един пик. Ако има инструмент с циклична хроматографска система, тогава за надеждност на идентификацията е желателно сместа да се премине през колоната няколко пъти.

Информация за задържане може да се намери и в литературата, но стойността на тази информация е ограничена. Тъй като колоните дори от една партида дават лоша възпроизводимост, литературните стойности не винаги съответстват на истинската стойност. t R на тази колона. За адсорбционната хроматография обаче е възможно да се предвиди t R въз основа на литературни данни. Друга трудност, свързана с използването на литературни значения t R, - сложността на тяхното търсене в специализираната литература, въпреки че библиографските прегледи, публикувани в Journal of Chromatography, имат актуализиран индекс на видовете вещества.

Във втория случай, когато времената на задържане на известните съединения и пробните зони не съвпадат, е възможно да се предвиди времето на задържане на неизвестния компонент. Прогнозите за относително задържане са доста надеждни въз основа на данните за структурата в хроматографията с изключване на пространството. Те са по-малко точни при адсорбция, разпределителна хроматография и особено при работа върху химически свързана фаза. За йонна и йонно-двойна хроматография на вещества с известни p Kaвъзможни са само приблизителни стойности tR. Винаги е по-лесно да се предвиди относително задържане или * x стойност, отколкото абсолютни стойности к". Относителни стойности t R по-лесно за оценка за свързани съединения или производни като заместени алкилкарбоксилни киселини или производни на бензол.

При изократично разделяне на хомолози или олигомери понякога се наблюдава следната закономерност:

\ gk" = А + Bn,

където Аи V- константи за редица избрани проби и за дадена хроматографска система (на една и съща колона, със същите подвижни и неподвижни фази); NS- броят на еднакви структурни единици в молекулата на пробата.

Въвеждането на функционалната група / в молекулата на пробата ще доведе до промяна к" в първото уравнение по някакъв постоянен коефициент a/ в дадена хроматографска система. Възможно е да се получат групови константи a / за различни заместващи групи /, чиито стойности ще се увеличават с увеличаване на полярността на функционалните групи във всички видове хроматография, с изключение на хроматография с обърната фаза, където стойностите на константите ще намалява с увеличаване на полярността.

Някои групови константи а / за различни групи заместители / са дадени в табл. 9.1.

При адсорбционната хроматография първото уравнение не винаги е приложимо, тъй като е валидно при условие, че всички изомери имат едно и също значение к", което не винаги се спазва. Възможно е обаче да се начертае зависимостта на lgfe на „същите съединения на една колона спрямо lgfe“ на същите съединения, но на различна колона или спрямо съответните характеристики в тънкослойна хроматография, например lg [(l - Rf) IRf].

При сравняване на данните за задържане на вещества могат да се използват стойностите на коефициента на капацитет к", тъй като върху него, за разлика от t R скоростта на подвижната фаза и геометричните характеристики на колоната не се засягат.

Разделянето на химически свързана фаза е подобно на разделянето с разпределителна хроматография с подобни фази и следователно данните за равновесната екстракция могат да се използват за прогнозиране на времената на задържане.

При йонообменната хроматография задържането се влияе от три фактора: степента на йонизация на киселини и основи, заряда на йонизираната молекула и способността на веществото от водната подвижна фаза, използвано в йонообменната хроматография, да мигрира в органичната фаза . Последното зависи от молекулното тегло на съединението и неговата хидрофобност. Следователно по-силните киселини или основи се задържат по-силно при анионообменно или катионно-обменно разделяне. При намаляване pK aна отделна киселина, включена в пробата, задържането се увеличава с отделянето на редица киселини поради анионообмен, а с увеличаване на p / C o задържането на основите се увеличава по време на разделянето им поради катионен обмен.

Така съвпадението на времената на задържане на известното вещество с наблюдаваното дава възможност да се приеме тяхната идентичност. Надеждността на идентификацията се повишава, ако се сравнят хроматограмите на известно вещество и неизвестен компонент при различни условия. Ако веществата в адсорбционната и обърната фаза или йонообменната и ексклюзивната хроматография се държат еднакво, надеждността на идентификацията се увеличава. Ако надеждността на идентификацията с еднакво относително задържане е 90%, тогава при изследване на поведението на едни и същи вещества при значително различни условия, надеждността на идентификацията вече е 99%.

Ценна характеристика на веществото, използвано при идентификацията, е съотношението на сигналите, получени за дадено вещество на два различни детектора. Аналитът след напускане на колоната преминава първо през първия детектор, след това през втория, а сигналите, идващи от детекторите, се записват едновременно с помощта на мулти-писател или два записващи устройства. Обикновено се използва серийно свързване на ултравиолетов детектор (по-чувствителен, но селективен) с рефрактометър, или ултравиолетов детектор с флуоресцентен детектор, или два ултравиолетови детектора, работещи на различни дължини на вълната. Относителният отговор, тоест съотношението на сигнала на рефрактометъра към сигнала на фотометъра, е характеристика на веществото, при условие че и двата детектора работят в своя линеен обхват; това се потвърждава чрез въвеждането на различни количества от едно и също вещество. Качествена информация може да бъде получена чрез работа с фотометрични детектори, оборудвани с устройство за спиране на потока, което записва спектъра на пика, излизащ „от колоната, докато е в проточната клетка, сравнявайки го със спектъра на известно съединение“.

Съвременните, все още скъпи спектрофотометри с диодни масиви представляват значителен интерес при идентификацията.

Напълно неизвестно вещество не може да бъде идентифицирано само с високоефективна течна хроматография и са необходими други методи.

КОЛИЧЕСТВЕН АНАЛИЗ

Количествената течна хроматография е добре разработен аналитичен метод, който не отстъпва по точност на количествената газова хроматография и значително превишава точността на TLC или електрофорезата. Следователно, за да се получат количествени резултати, инструментът трябва да бъде калибриран.

Количественият анализ се състои от следните етапи: 1) хроматографско разделяне; 2) измерване на площите или височините на върха; 3) изчисляване на количествения състав на сместа въз основа на хроматографски данни; 4) интерпретация на получените резултати, т.е. статистическа обработка. Нека разгледаме всички тези етапи.

4.1. ХМАТОГРАФСКО РАЗДЕЛЯНЕ

Извадката може да бъде податлива на грешки. Особено важно е да се избягват грешки и да се получи адекватна представителна проба от нехомогенни твърди проби, летливи или нестабилни вещества, както и селскостопански продукти и биоматериали. Нехомогенни проби, като хранителни продукти, се смесват старателно и се разрязват на четвъртинки. Чрез многократно извършване на тази операция се постига хомогенност на пробата.

Грешки и загуби на вещества могат да бъдат допуснати на етап извличане, изолиране, пречистване и др.

Пробите трябва да бъдат напълно разтворени и техните разтвори да бъдат приготвени с точност ± 0,1%. Желателно е пробата да се разтвори в подвижната фаза, което изключва възможността за утаяване след въвеждането й в хроматографа. Ако разтварянето в подвижната фаза е невъзможно, тогава трябва да се използва разтворител, който се смесва с него, и да се въведат обеми на пробата (по-малко от 25 μl) в хроматографа.

По време на инжектирането на пробата могат да възникнат значителни неточности поради нейното фракциониране, изтичане и пиково размазване. Замъгляването на върховете причинява образуването на опашки, което води до частично припокриване на върховете и като следствие, до грешки при откриването. За количествено инжектиране устройствата с кръгови клапани са предпочитани пред спринцовките поради по-високата точност и по-малката зависимост от оператора.

При хроматографското разделяне на веществата могат да възникнат и усложнения, които водят до изкривяване на данните: количествен анализ. Възможно е разлагане или трансформация на пробата по време на хроматографския процес или необратима адсорбция на веществото върху тази колона. Важно е да се гарантира, че тези нежелани явления отсъстват и, ако е необходимо, да се регенерира или да се смени колоната. Припокриването на върховете и опашката могат също да бъдат намалени чрез промяна на хроматографските условия.

Не можете да използвате фалшиви или размити пикове в количествения анализ, както и пикове, чието време на освобождаване е близко до да се, тъй като може да има недостатъчно разделяне. Обикновено се използват пикове със стойност ^ 0,5. Най-високата ефективност на колоната се постига с въвеждането на 10 ~ 5 -10 ~ 6 g разтворено вещество на грам сорбент. При инжектиране на големи количества проба зависимостта на височината на пика на натоварването може да бъде нелинейно и се изисква количествено определяне от пиковите площи.

Грешките, свързани с откриването или усилването, водят до значително изкривяване на резултатите от хроматографското разделяне. Всеки детектор се характеризира със специфичност, линейност и чувствителност. Тестът за селективност е особено важен при анализиране на следи от примеси. Реакцията на UV детекторите може да се промени към вещества със сходни функционални групи с коефициент 10 4. Необходимо е да се калибрира реакцията на детектора за всеки аналит. Естествено, веществата, които не абсорбират в UV областта, няма да дадат сигнал на записващото устройство, когато използвате фотометър като детектор. При използване на рефрактометър могат да се появят отрицателни пикове. В допълнение, този детектор трябва да бъде термостатиран, което не се изисква за UV детектор.

Линейността на детектора определя размера на инжектираната проба. Трябва да се помни, че дебитът на колоната, температурата на колоната и детектора и дизайнът ще повлияят на точността на количественото определяне. Грешки при предаването на електрически сигнал към изходно устройство (рекордер), интегратор или към компютър могат да възникнат поради улавяне на шум, липса на заземяване, колебания на напрежението в мрежата и др.

4.2. ИЗМЕРВАНЕ НА ПЛОЩ ИЛИ ВЪРХОВА ВИСОЧА

Пикова височина з (Фиг. 10.1) се нарича разстоянието от върха на пика до базовата линия, измерва се линейно или броят на деленията се брои на рекордера. Някои електронни интегратори и компютри предоставят информация за пиковите височини. Позицията на базовата линия на изместените пикове се намира чрез интерполиране на ординатните стойности, съответстващи на началото и края на пика (пик 1 и 3виж фиг. 10.1). За да подобрите точността, трябва да имате нежна, стабилна изходна линия. В случай на неразделени върхове, базовата линия се изчертава между началото и края на пика, вместо да се заменя с нулева линия. Тъй като височината на пика е по-малко зависима от влиянието на съседни припокриващи се върхове, оценката на височината на пика е по-точна и почти винаги се използва за анализ на следи.

Площта на пика може да се определи по различни начини. Нека да разгледаме някои от тях.

1. Планиметричният метод се състои във факта, че върхът е заобиколен от ръчен планиметър, който е устройство, което механично определя площта на върха. Методът е точен, но трудоемък и лошо възпроизводим. Този метод е нежелан.

2. Метод на хартиени силуети - върхът се изрязва и претегля. Методът е добре възпроизводим, но трудоемък и хроматограмата се разрушава. Неговата приложимост зависи от еднородността на лентата с графики. Методът също не може да бъде широко препоръчан.

4. Методът на триангулация се състои в конструиране на триъгълник чрез начертаване на допирателни линии към страните на върха. Върхът на триъгълника е по-висок от върха на върха. Увеличаването на площта, образувана от този удължен връх, ще бъде последователно в цялата хроматограма и няма да повлияе твърде много на точността. В допълнение, част от площта, загубена при изчертаване на допирателни, ще бъде компенсирана. Основата на триъгълника се определя от пресечната точка на допирателните с основната линия, а площта се определя от произведението на 7g от основата и височината. Този метод е най-добрият за определяне на площите на асиметричните върхове. Възпроизводимостта при конструирането на тангенси от различни оператори обаче е различна и следователно; ниско.

5. Методът на дисковия интегратор се основава на електромеханично устройство, свързано към записващо устройство. Писалката, прикрепена към интегратора, се движи по лентата в долната част на лентата със скорост, пропорционална на движението на писалката на записващото устройство.

Както при ръчното измерване, пикът трябва да остане в скалата на рекордера, но корекциите за компенсиране на отклонението на базовата линия и непълното разделяне на съседните пикове намаляват надеждността и увеличават времето за анализ.

Методът е по-точен от методите за ръчно измерване, особено с асиметрични пикове, и предлага предимство в скоростта. В допълнение, той осигурява непрекъснат количествен запис на анализа.

6. Методите, използващи електронни интегратори за определяне на пиковите зони и отпечатване на информация за тази област и времената на задържане, могат да включват коригиране на отклонението на изходната линия и определяне на площта само на частично разделени пикове. Основните предимства са точност, бързина, независимост на действието от работата на рекордера. Интеграторите имат памет и могат да бъдат програмирани за конкретен анализ с помощта на предварително програмирана програма. Предимствата на интегратора включват неговата способност да използва корекционни фактори за реакцията на детектора при преизчисляване на първоначалните данни за пиковите площи, компенсирайки разликата в чувствителността на детектора към различни вещества. Такива системи спестяват време, подобряват аналитичната точност и са полезни за рутинен аналитичен анализ.

7. В течната хроматография компютрите се използват широко за измерване на пиковите площи. Те разпечатват пълно съобщение, включващо наименованието на веществата, пиковите площи, времената на задържане, корекционните фактори за реакцията на детектора и съдържанието (в тегл.%) за различните компоненти на пробата.