Principio de cromatografía líquida del método. Cromatografía líquida de alta resolución de contaminantes naturales y de aguas residuales

Introducción

Capítulo 1. Conceptos básicos y clasificación de los métodos de cromatografía líquida

1.1 Aparato para cromatografía líquida

Capítulo 2. La esencia de la HPLC

2.1 Aplicación

Capítulo 3. Ejemplos del uso de HPLC en el análisis de objetos ambientales

Capítulo 4. Equipo para HPLC

Literatura

Solicitud

Introducción

Métodos cromatográficos a menudo son indispensables para identificar y cuantificar sustancias orgánicas con una estructura similar. Al mismo tiempo, los más utilizados para el análisis de rutina de contaminantes ambientales son la cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución. El análisis cromatográfico de gases de contaminantes orgánicos en el agua potable y residual se basó primero en el uso de columnas empaquetadas, luego las columnas capilares de cuarzo también se generalizaron. El diámetro interior de las columnas capilares suele ser de 0,20-0,75 mm, la longitud es de 30-105 m. Los resultados óptimos en el análisis de contaminantes en el agua se obtienen con mayor frecuencia cuando se utilizan columnas capilares con diferentes espesores de película fabricadas con metilfenilsiliconas que contienen grupos fenilo de 5 y 50% ... El sistema de introducción de muestras a menudo se convierte en una vulnerabilidad en las técnicas cromatográficas que utilizan columnas capilares. Los sistemas de introducción de muestras se pueden dividir en dos grupos: universal y selectivo. Las aplicaciones versátiles incluyen sistemas de inyección split y splitless, inyección en columna “fría” y evaporación programada por temperatura. Con inyección selectiva, se utiliza soplado con atrapamiento intermedio, análisis del espacio de cabeza, etc. Cuando se utilizan sistemas de inyección universales, toda la muestra se suministra a la columna; con la inyección selectiva, solo se inyecta una determinada fracción. Los resultados obtenidos con la inyección selectiva son mucho más precisos, ya que la fracción que ingresa a la columna contiene solo sustancias volátiles, y la técnica se puede automatizar por completo.

Los detectores cromatográficos de gases utilizados en la monitorización de contaminantes se suelen dividir en detectores universales que responden a cada componente en la fase móvil y detectores selectivos que responden a la presencia de un determinado grupo de sustancias con características químicas similares en la fase móvil. Los universales incluyen ionización de llama, emisión atómica, detectores espectrométricos de masas y espectrometría infrarroja. Los detectores selectivos utilizados en el análisis de agua son la captura de electrones (selectiva para sustancias que contienen átomos de halógeno), termoiónicos (selectivos para compuestos que contienen nitrógeno y fósforo), fotoionización (selectiva para hidrocarburos aromáticos), detector de conductividad electrolítica (selectivo para compuestos, que contienen átomos de halógenos , azufre y nitrógeno). Las cantidades mínimas detectables de sustancias van desde nanogramos hasta picogramos por segundo.

Cromatografía líquida de alta resolución.(HPLC) es un método ideal para la determinación de un gran número de compuestos térmicamente lábiles que no pueden analizarse mediante cromatografía de gases. Los agroquímicos modernos, incluidos los metilcarbonatos y los insecticidas organofosforados, y otras sustancias no volátiles, a menudo se convierten en objetos de análisis por cromatografía líquida. La cromatografía líquida de alta resolución está ganando popularidad entre otros métodos utilizados en el control ambiental, también porque tiene perspectivas brillantes en términos de automatización de la preparación de muestras.

CAPÍTULO 1. CONCEPTOS BÁSICOS Y CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

La cromatografía líquida se clasifica en varias clases según el tipo de soporte de fase estacionaria. El diseño de hardware simple del papel y la cromatografía de capa fina ha llevado al uso generalizado de estos métodos en la práctica analítica. Sin embargo, las grandes posibilidades de la cromatografía en columna de líquidos estimularon la mejora de los equipos para este método clásico y llevaron a la rápida introducción de la HPLC. El paso del eluyente a través de la columna a alta presión hizo posible aumentar drásticamente la velocidad de análisis y aumentar significativamente la eficiencia de separación debido al uso de un sorbente finamente disperso. Actualmente, el método HPLC permite aislar, analizar cuantitativa y cualitativamente mezclas complejas de compuestos orgánicos.

Según el mecanismo de interacción de la sustancia a separar (eluir) con la fase estacionaria, se distinguen cromatografía de adsorción, distribución, intercambio iónico, exclusión por tamaño, par iónico, intercambio de ligando y afinidad.

Cromatografía de adsorción... La separación por cromatografía de adsorción se realiza como resultado de la interacción de la sustancia a separar con un adsorbente, como alúmina o gel de sílice, que tienen centros polares activos en la superficie. El disolvente (eluyente) es un líquido no polar. El mecanismo de sorción consiste en una interacción específica entre la superficie polar del sorbente y las regiones polares (o capaces de polarización) de las moléculas del componente analizado (Fig. 1).

Arroz. 1. Cromatografía líquida de adsorción.

Cromatografía de partición... En la variante de distribución de la cromatografía líquida, la separación de una mezcla de sustancias se lleva a cabo debido a la diferencia en sus coeficientes de distribución entre dos fases inmiscibles: el eluyente (fase móvil) y la fase del sorbente (fase estacionaria).

A fase normal En una variante de la cromatografía líquida de distribución, se utilizan un eluyente no polar y grupos polares, injertados en la superficie del sorbente (más a menudo, gel de sílice). Los alquilclorosilanos sustituidos que contienen grupos polares, como nitrilo, grupos amino, etc., se utilizan como modificadores de la superficie del gel de sílice (fases injertadas) (Fig. 2). El uso de fases injertadas permite controlar con precisión las propiedades de sorción de la superficie de la fase estacionaria y lograr una alta eficiencia de separación.

Arroz. 2. Cromatografía de partición con fase injertada (variante de fase normal).

Arroz. 3. Cromatografía de partición en fase injertada (versión de fase inversa).

Una versión menos utilizada de la cromatografía líquida con fases soportadas es cuando una fase líquida estacionaria se deposita sobre un soporte estacionario.

Exclusivo (gel penetrante) La cromatografía es una variante de la cromatografía líquida, en la que la separación de sustancias se produce debido a la distribución de moléculas entre el disolvente en los poros del sorbente y el disolvente que fluye entre sus partículas.

Afín La cromatografía se basa en interacciones específicas de las proteínas separadas (anticuerpos) con sustancias (antígenos) injertadas en la superficie del sorbente (resina sintética), formando selectivamente complejos (conjugados) con proteínas.

La cromatografía de intercambio iónico, de pares iónicos y de intercambio de ligandos se utiliza principalmente en análisis inorgánicos.

Parámetros básicos de separación cromatográfica.

Los principales parámetros de la separación cromatográfica son el volumen de retención y el tiempo de retención del componente de la mezcla (Fig. 4).

El tiempo de retención tR es el tiempo transcurrido desde el momento en que se inyecta la muestra en la columna hasta que emerge el máximo del pico correspondiente. Multiplicando el tiempo de retención por la velocidad volumétrica del eluyente F, obtenemos el volumen de retención VR:

Tiempo de retención corregido: el tiempo transcurrido desde el momento en que aparece el pico máximo del componente no absorbido hasta el pico del compuesto correspondiente:

tR "= tR - t0;

El volumen de retención reducido o corregido es el volumen de retención corregido por el volumen muerto de la columna V0, es decir, el volumen de retención del componente no absorbido:

VR "= VR - V0;

La característica de retención es también el coeficiente de capacidad k ", definido como la relación entre la masa de la sustancia en la fase estacionaria y la masa de la sustancia en la fase móvil: k" = mn / mp;

El valor de k "es fácil de determinar a partir del cromatograma:

Los parámetros más importantes de la separación cromatográfica son su eficiencia y selectividad.

La eficiencia de la columna, medida por la altura de los platos teóricos (HETT) e inversamente proporcional a su número (N), cuanto mayor, más estrecho es el pico de la sustancia que sale en el mismo tiempo de retención. El valor de eficiencia se puede calcular a partir del cromatograma utilizando la siguiente fórmula:

N = 5,54 . (tR / 1/2) 2 ,

dónde tR- tiempo de retención,

w 1/2 - ancho de pico a media altura

Conociendo el número de platos teóricos por columna, la longitud de la columna L y el diámetro medio del grano sorbente dc, es fácil obtener los valores de la altura equivalente al plato teórico (HETT) y la altura reducida (PVETT):

VETT = L / N PVETT = VETT / d C

Estas características permiten comparar la eficiencia de diferentes tipos de columnas, evaluando la calidad del sorbente y la calidad de llenado de las columnas.

La selectividad de la separación de dos sustancias está determinada por la ecuación:

Al considerar la separación de una mezcla de dos componentes, un parámetro importante también es el grado de separación RS:

;

Los picos se consideran permitidos si el valor de RS es mayor o igual a 1,5.

Los principales parámetros cromatográficos están vinculados por la siguiente ecuación de resolución:

;

Los factores que determinan la selectividad de la separación son:

1) la naturaleza química del sorbente;

2) la composición del solvente y sus modificadores;

3) la estructura química y propiedades de los componentes de la mezcla a separar;

4) temperatura de la columna

1.1 Aparato para cromatografía líquida

En la cromatografía líquida moderna, se utilizan dispositivos de diversos grados de complejidad, desde los sistemas más simples hasta cromatógrafos de clase alta equipados con varios dispositivos adicionales.

En la Fig. 4. Se presenta un diagrama de bloques de un cromatógrafo de líquidos, que contiene el conjunto mínimo requerido de componentes, de una forma u otra, presentes en cualquier sistema cromatográfico.

Arroz. 4. Diagrama de bloques de un cromatógrafo de líquidos.

La bomba (2) está diseñada para crear un flujo constante de disolvente. Su diseño está determinado principalmente por la presión de funcionamiento en el sistema. Para el funcionamiento en el rango de 10-500 MPa, se utilizan bombas de émbolo (jeringa) o de pistón. La desventaja del primero es la necesidad de paradas periódicas para el llenado del eluyente y, del segundo, la gran complejidad del diseño y, en consecuencia, el elevado precio. Para sistemas simples con presiones de funcionamiento bajas de 1 a 5 MPa, se utilizan con éxito bombas peristálticas económicas, pero como es difícil lograr una presión y un caudal constantes, su uso se limita a tareas preparativas.

El inyector (3) asegura que se inyecte en la columna una muestra de una mezcla de componentes a separar con una reproducibilidad suficientemente alta. Los sistemas de muestreo de flujo de parada simples requieren una parada de la bomba y, por lo tanto, son menos convenientes que los dispensadores de bucle Reodyne.

Las columnas de HPLC (4) son tubos de acero inoxidable de paredes gruesas que pueden soportar altas presiones. La densidad y uniformidad del relleno de la columna con el sorbente juega un papel importante. Para la cromatografía líquida de baja presión, se han utilizado con éxito columnas de vidrio de paredes gruesas. La constancia de la temperatura está garantizada por un termostato (5).

Los detectores (6) para cromatografía líquida tienen una celda de flujo en la que se mide continuamente alguna propiedad del eluyente que fluye. Los tipos más populares de detectores de uso general son los refractómetros, que miden el índice de refracción, y los detectores espectrofotométricos, que miden la absorbancia de un solvente a una longitud de onda fija (generalmente en la región ultravioleta). Las ventajas de los refractómetros (y las desventajas de los espectrofotómetros) incluyen una baja sensibilidad al tipo de compuesto que se está determinando, que puede no contener grupos cromóforos. Por otro lado, el uso de refractómetros se limita a sistemas isocráticos (con una composición de eluyente constante), por lo que en este caso no es posible el uso de un gradiente de disolvente.

Las columnas de HPLC, que se utilizan con mayor frecuencia en el análisis de contaminantes ambientales, tienen 25 cm de largo y 4,6 mm de diámetro interno, llenas de partículas esféricas de gel de sílice del tamaño de 5-10 micrones injertadas con grupos octadecilo. En los últimos años han aparecido columnas con diámetros internos más pequeños, llenas de partículas más pequeñas. El uso de tales columnas conduce a una disminución en el consumo de solventes y la duración del análisis, un aumento en la sensibilidad y eficiencia de la separación y también facilita el problema de conectar las columnas a los detectores espectrales. Las columnas con un diámetro interno de 3,1 mm están equipadas con un cartucho de seguridad (precolumna) para aumentar la vida útil y mejorar la reproducibilidad de los análisis.

Como detectores en los instrumentos de HPLC modernos, se suele utilizar un detector de UV en una matriz de diodo, fluorescencia y electroquímico.

Debe tenerse en cuenta que en el trabajo práctico, la separación a menudo se produce no uno por uno, sino a través de varios mecanismos simultáneamente. Entonces, la separación por exclusión se complica por los efectos de adsorción, adsorción - distribución y viceversa. Además, cuanto mayor sea la diferencia entre las sustancias de la muestra en términos de grado de ionización, basicidad o acidez, peso molecular, polarizabilidad y otros parámetros, mayor será la probabilidad de un mecanismo de separación diferente para tales sustancias.

En la práctica, la más extendida es la cromatografía de "fase inversa" (distribución), en la que la fase estacionaria no es polar, pero la fase móvil es polar (es decir, la inversa de la cromatografía de "fase directa").

En la mayoría de los laboratorios del mundo, un grupo de 16 HAP prioritarios se analizan mediante HPLC o CMS.

CAPÍTULO 2. ESENCIA DE HPLC

En la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la naturaleza de los procesos que ocurren en una columna cromatográfica es generalmente idéntica a los procesos en la cromatografía de gases. La única diferencia es el uso de un líquido como fase estacionaria. Debido a la alta densidad de las fases móviles líquidas y la alta resistencia de la columna, la cromatografía de gases y de líquidos difieren enormemente en el diseño de su hardware.

En HPLC, los disolventes puros o sus mezclas se utilizan habitualmente como fases móviles.

Para crear una corriente de disolvente puro (o mezclas de disolventes), llamado eluyente en cromatografía líquida, se utilizan bombas en el sistema hidráulico del cromatógrafo.

La cromatografía de adsorción se realiza como resultado de la interacción de una sustancia con adsorbentes, como el gel de sílice o la alúmina, que tienen centros activos en la superficie. La diferencia en la capacidad de interactuar con los centros de adsorción de diferentes moléculas de muestra conduce a su división en zonas durante el movimiento con la fase móvil a lo largo de la columna. La separación de las zonas de los componentes conseguida en este caso depende de la interacción tanto con el disolvente como con el adsorbente.

Los adsorbentes de gel de sílice con diferentes volúmenes, superficies y diámetros de poros son los más utilizados en HPLC. La alúmina y otros adsorbentes se utilizan con mucha menos frecuencia. La principal razón de esto:

resistencia mecánica insuficiente, que no permite el envasado y uso a presiones elevadas típicas de HPLC;

el gel de sílice, en comparación con el óxido de aluminio, tiene un rango más amplio de porosidad, área superficial y diámetro de poro; una actividad catalítica significativamente mayor del óxido de aluminio conduce a la distorsión de los resultados del análisis debido a la descomposición de los componentes de la muestra o su quimisorción irreversible.

Detectores de HPLC

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza para detectar sustancias polares no volátiles que, por alguna razón, no se pueden convertir en una forma conveniente para la cromatografía de gases, incluso en forma de derivados. Estas sustancias incluyen, en particular, ácidos sulfónicos, colorantes solubles en agua y algunos pesticidas, como los derivados de fenilurea.

Detectores:

Detector de matriz de diodos UV. La "matriz" de fotodiodos (hay más de doscientos) registra constantemente señales en las regiones espectrales UV y visible, proporcionando así el registro de espectros UV-B en el modo de barrido. Esto hace posible registrar de forma continua espectros no distorsionados de alta sensibilidad de componentes que pasan rápidamente a través de una celda especial.

En comparación con la detección de longitud de onda única, que no proporciona información sobre la "pureza" del pico, la capacidad de comparar los espectros completos de una matriz de diodos proporciona un resultado de identificación con un grado de confianza mucho mayor.

Detector fluorescente. La gran popularidad de los detectores fluorescentes se debe a la muy alta selectividad y sensibilidad, y al hecho de que muchos contaminantes ambientales emiten fluorescencia (por ejemplo, hidrocarburos poliaromáticos).

Se utiliza un detector electroquímico para detectar sustancias que se oxidan o reducen fácilmente: fenoles, mercaptanos, aminas, derivados nitro aromáticos y halógenos, aldehídos cetónicos, bencidinas.

La separación cromatográfica de la mezcla en la columna debido al lento avance del PP lleva mucho tiempo. Para acelerar el proceso, la cromatografía se realiza a presión. Este método se denomina cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La modernización del equipo utilizado en la cromatografía de columna líquida clásica lo ha convertido en uno de los métodos de análisis más prometedores y modernos. La cromatografía líquida de alto rendimiento es un método conveniente para la separación, el aislamiento preparativo y el análisis cualitativo y cuantitativo de compuestos termolábiles no volátiles de bajo y alto peso molecular.

Dependiendo del tipo de sorbente utilizado en este método, se utilizan 2 opciones de cromatografía: en un sorbente polar utilizando un eluyente no polar (opción de fase directa) y en un sorbente no polar utilizando un eluyente polar - el llamado invertido- cromatografía líquida de alta resolución en fase (HPLC).

Cuando el eluyente pasa al eluyente, el equilibrio en las condiciones de HPLC se establece muchas veces más rápido que en las condiciones de sorbentes polares y PP no acuosos. Como resultado de esto, además de la conveniencia de trabajar con eluyentes acuosos y hidroalcohólicos, Off-HPLC ha ganado una gran popularidad en la actualidad. La mayoría de los análisis de HPLC se realizan mediante este método.

Detectores El registro de la salida de la columna de un componente separado se realiza mediante un detector. Para el registro, puede utilizar un cambio en cualquier señal analítica proveniente de la fase móvil y asociada con la naturaleza y cantidad del componente de la mezcla. En cromatografía líquida se utilizan señales analíticas como absorción de luz o emisión de luz de la solución de salida (detectores fotométricos y fluorométricos), índice de refracción (detectores refractométricos), conductividad potencial y eléctrica (detectores electroquímicos), etc.

La señal detectada continuamente es registrada por una grabadora. Un cromatograma es una secuencia de señales detectoras registradas en la cinta del registrador, que se genera cuando los componentes individuales de la mezcla abandonan la columna. En el caso de separación de la mezcla, los picos individuales son visibles en el cromatograma externo. La posición del pico en el cromatograma se usa con fines de identificación, la altura o área del pico se usa con fines de cuantificación.

2.1 Aplicación

La HPLC se utiliza más ampliamente en las siguientes áreas de análisis químico (se destacan los objetos de análisis, donde la HPLC prácticamente no tiene competencia):

Control de calidad de los alimentos: aditivos tónicos y aromatizantes, aldehídos, cetonas, vitaminas, azúcares, colorantes, conservantes, hormonas, antibióticos, triazina, carbamato y otros pesticidas, micotoxinas, nitrosaminas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc.

Protección del medio ambiente: fenoles, compuestos nitrogenados orgánicos, hidrocarburos aromáticos mono y policíclicos, varios plaguicidas, aniones y cationes principales.

Ciencias forenses: medicamentos, explosivos y colorantes orgánicos, productos farmacéuticos potentes.

Industria farmacéutica: hormonas esteroides, casi todos los productos de síntesis orgánica, antibióticos, preparaciones de polímeros, vitaminas, preparaciones de proteínas.

Medicina: las sustancias bioquímicas y medicinales enumeradas y sus metabolitos en fluidos biológicos (aminoácidos, purinas y pirimidinas, hormonas esteroides, lípidos) en el diagnóstico de enfermedades, determinación de la tasa de eliminación de medicamentos del cuerpo para el propósito de su individuo Dosis.

Agricultura: determinación de nitratos y fosfatos en suelos para determinar la cantidad requerida de fertilizantes aplicados, determinación del valor nutricional de los alimentos (aminoácidos y vitaminas), análisis de plaguicidas en el suelo, el agua y los productos agrícolas.

Bioquímica, química bioorgánica, ingeniería genética, biotecnología: azúcares, lípidos, esteroides, proteínas, aminoácidos, nucleósidos y sus derivados, vitaminas, péptidos, oligonucleótidos, porfirinas, etc.

Química orgánica: todos los productos estables de síntesis orgánica, tintes, compuestos termolábiles, compuestos no volátiles; química inorgánica (casi todos los compuestos solubles en forma de iones y compuestos complejos).

control de calidad e inocuidad de productos alimenticios, bebidas alcohólicas y no alcohólicas, agua potable, productos químicos domésticos, perfumes en todas las etapas de su producción;

determinación de la naturaleza de la contaminación en el lugar de un desastre o emergencia provocados por el hombre;

detección y análisis de sustancias narcóticas, potentes, venenosas y explosivas;

determinación de la presencia de sustancias nocivas (policíclicos y otros hidrocarburos aromáticos, fenoles, pesticidas, colorantes orgánicos, iones de metales pesados, alcalinos y alcalinotérreos) en efluentes líquidos, emisiones atmosféricas y desechos sólidos de empresas y en organismos vivos;

seguimiento de procesos de síntesis orgánica, procesamiento de petróleo y carbón, industrias bioquímicas y microbiológicas;

análisis de la calidad del suelo para la fertilización, la presencia de pesticidas y herbicidas en el suelo, el agua y los productos, así como el valor nutricional de los piensos; tareas analíticas de investigación complejas; obteniendo una pequeña cantidad de sustancia ultrapura.

CAPÍTULO 3. EJEMPLOS DE USO DE HPLC EN EL ANÁLISIS DE OBJETOS AMBIENTALES

HPLC: un método para monitorear HAP en objetos ambientales

Para los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), ecotoxicantes de la 1ª clase de peligro, se han establecido niveles extremadamente bajos de concentraciones máximas permisibles (MPC) en objetos naturales. La determinación de PAH a nivel de MPC e inferior es una de las tareas analíticas muy complejas y se utilizan métodos de análisis de alta tecnología (GC-MS, GC, HPLC) para resolverlos. Al elegir un método de monitoreo, a las principales características consideradas: se agregan sensibilidad y selectividad, rapidez y economía, ya que el seguimiento implica un análisis en serie. La opción de HPLC en columnas cortas y de diámetro pequeño cumple estos requisitos en gran medida. Utilizando este método, los autores han desarrollado y certificado métodos para monitorear el benzo [a] pireno en tres ambientes naturales: aerosol, manto de nieve y aguas superficiales. Las técnicas se caracterizan por: preparación de muestras unificada simple, que incluye la extracción de HAP con disolventes orgánicos y concentración del extracto, introducción directa del extracto concentrado en la columna cromatográfica, uso de detección fotométrica de longitud de onda múltiple en la región UV del espectro, identificación de picos de PAH en cromatogramas utilizando dos parámetros, tiempo de retención y relación espectral ... El error total no excede el 10% al determinar benzo [a] pireno en aerosol en el rango de concentración de 0.3 a 450 ng / m 3, en aguas superficiales en el rango de concentración de 10 a 1000 ng / L, en la capa de nieve en el rango de densidad superficial de 0,5 a 50 μg / m 2. Para el caso de la determinación simultánea de HAP prioritarios (hasta 12 compuestos) y el registro de picos no homogéneos de analitos, se propone volver a separar el extracto con un cambio en la selectividad de la fase móvil, la longitud de onda de detección y la temperatura de la columna. teniendo en cuenta las propiedades individuales de los HAP determinados.

1 ... Calidad del aire ambiente. Concentración másica de benzo [a] pireno. Técnica de medición por HPLC. Certificado de atestación MVI No. 01-2000.

2 ... La calidad de las aguas residuales superficiales y tratadas. Concentración másica de benzo [a] pireno. Técnica de medición por HPLC. Certificado de atestación MVI No. 01-2001.

3 ... Calidad de la nieve. Concentración másica de benzo [a] pireno. Técnica de medición por HPLC. Certificado de atestación MVI No. 02-2001.

Eliminación de anilina de soluciones acuosas mediante reducción alumotérmica residual de cascarilla de cobre laminado

El problema de eliminar los hidrocarburos de las aguas residuales es una tarea urgente. En muchas industrias químicas, petroquímicas y otras se forman la anilina y sus derivados, que son sustancias tóxicas. La anilina es una sustancia altamente tóxica, el límite de concentración máximo es de 0,1 mg / m 3. La anilina y sus derivados son solubles en agua y, por lo tanto, no se pueden eliminar por sedimentación por gravedad.

Uno de los mejores métodos para depurar aguas residuales de contaminantes orgánicos es el uso de adsorbentes inorgánicos y orgánicos capaces de regenerar (aluminosilicatos, arcillas modificadas, madera, fibras, etc.) e incapaces de regenerar (carbón activado, materiales poliméricos macroporosos, etc.) .).

Los adsorbentes regenerados pueden eliminar del agua sustancias orgánicas de diferentes polaridades. La búsqueda de adsorbentes eficaces es una tarea urgente.

Este informe presenta los resultados de un estudio en el campo de aplicación de la escala de cobre laminado de la Planta de Cable de Ereván (OPMOERKZ) como sorbentes de anilina.

Los estudios cromatográficos se realizaron en un cromatógrafo HPLC / cromatografía líquida de alta resolución / sistemas (Waters 486 - detector, Waters 600S - controlador, Waters 626 - Pump), en una columna de 250 x 4 mm llena con los sorbentes en estudio, el móvil tasa de fase 1 ml / m / fase móvil son los solventes que investigamos /, el detector es UV-254. El análisis espectroscópico UV se realizó en un espectrofotómetro Specord-50, los espectros se obtuvieron utilizando el programa informático ASPECT PLUS.

Se añadieron porciones de sorbentes pesadas con precisión a determinados volúmenes de anilina en agua, cuyas concentraciones iniciales se variaron. La mezcla se agitó a fondo durante 6 horas y luego se dejó reposar la muestra. La adsorción se completa prácticamente en 48 horas La cantidad de anilina precipitada se determinó mediante análisis espectrofotométrico y refractométrico UV.

Primero, se investigaron las propiedades de adsorción de OPMOErKZ cuando se eliminó la anilina de una solución en tetracloruro de carbono. Resultó que la anilina absorbe mejor el sorbente 3 (tabla).

También se realizaron mediciones para soluciones acuosas de anilina en concentraciones de 0,01-0,0001 mol / l. La tabla muestra datos para una solución de 0.01 M.

Absorción de anilina por varios sorbentes de una solución acuosa de anilina 0,01 M a 20 ° C

Anteriormente, se encontró que la adsorción aumenta dentro del rango de concentración especificado y depende linealmente del índice de refracción. La cantidad de anilina se determinó a partir de la relación gráfica "índice de refracción - concentración molar" y se corrigió mediante los datos de cromatografía líquida y análisis espectral UV.

El absorbente 3 es el más activo para las soluciones acuosas La cantidad de contaminante adsorbido se calculó como la diferencia entre la cantidad total de contaminante agregada a la solución inicial y su resto en la solución final.

Métodos para la determinación de HAP en objetos ambientales.

Normalmente, los métodos de cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan para determinar los HAP. La separación de los 16 HAP principales, suficiente para el análisis cuantitativo, se logra mediante el uso de columnas capilares en cromatografía de gases o columnas de alto rendimiento utilizadas en HPLC. Debe recordarse que una columna que separa bien las mezclas de calibración de dieciséis PAH no garantiza que también se separen bien en el contexto de los compuestos orgánicos acompañantes en las muestras de prueba.

Para simplificar el análisis, así como para lograr una alta calidad de los resultados obtenidos, la mayoría de los procedimientos analíticos contienen la etapa de aislamiento preliminar (separación) de los HAP de otros grupos de compuestos relacionados en las muestras. Las técnicas de cromatografía líquido-sólido o líquido-líquido de baja presión se utilizan con mayor frecuencia para este propósito utilizando mecanismos de adsorción como gel de sílice o alúmina, a veces se utilizan mecanismos mixtos, como adsorción y eliminación mediante Sephadex.

El uso de la purificación preliminar de muestras permite evitar la influencia de:

Compuestos completamente apolares como los hidrocarburos alifáticos;

Compuestos de moderada a muy polares tales como ftalanos, fenoles, alcoholes polihídricos, ácidos;

Compuestos de alto peso molecular como resinas.

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) utiliza principalmente dos tipos de detectores: un detector fluorométrico o un detector espectrofotométrico con una matriz de fotodiodos. El límite de detección de HAP en la detección fluorométrica es muy bajo, lo que hace que este método sea especialmente adecuado para la determinación de trazas de compuestos poliaromáticos. Sin embargo, los detectores fluorométricos clásicos no proporcionan prácticamente información sobre la estructura del compuesto en estudio. Los diseños modernos permiten registrar los espectros de fluorescencia que son característicos de los compuestos individuales, pero aún no se han generalizado en la práctica de las mediciones de rutina. Un detector espectrofotométrico con regla de fotodiodo (PDL) permite registrar espectros de absorción en el rango espectral visible y UV, estos espectros se pueden utilizar para la identificación. Se puede obtener información similar utilizando detectores de escaneo rápido.

Al elegir una técnica analítica para la separación, identificación y análisis cuantitativo de los HAP mencionados, se deben tener en cuenta las siguientes condiciones:

El nivel de los contenidos determinados en las muestras de prueba;

El número de sustancias relacionadas;

Procedimiento analítico utilizado (técnica de medición);

Capacidades de los equipos en serie.

Desarrollo de un método para la determinación de elementos alcalinotérreos y magnesio mediante cromatografía líquida iónica de alta resolución

El desarrollo y mejora de métodos que permitan resolver los problemas del análisis del agua es un problema importante en química analítica. El desarrollo de la cromatografía líquida de alta presión de alta resolución estimuló el desarrollo de una nueva dirección en la cromatografía de intercambio iónico, la denominada cromatografía iónica. La síntesis de sorbentes para cromatografía iónica es difícil, ya que existen muchos requisitos para ellos. Debido a la falta de intercambiadores de cationes altamente efectivos disponibles comercialmente, se utilizó una fase inversa modificada dinámicamente, para la cual se sintetizó un modificador: ácido N-hexadecil-N-decanoil-paraminobenoilsulfónico etil-diisopropilamonio (DHDASK), donde una amina hidrófoba que contiene un SO 3 - grupo, capaz de intercambio catiónico. Después de pasar la solución modificadora, la absorción a l = 260 nm alcanzó 6.4 unidades de densidad óptica (° E) con una meseta. La capacidad de intercambio iónico calculada es de 15,65 μmol. Dado que los cationes de elementos alcalinotérreos y magnesio no absorben en la región UV del espectro, se utilizó la detección UV indirecta usando el eluyente sintetizado que absorbe UV bromuro de 1,4-dipiridinio butano (bromuro de DPB). Dado que los iones halógeno destruyen las partes de acero de la columna, el ión bromuro de 1,4-dipiridiniumbutano se reemplazó por ión acetato. Cuando la columna se lava con el eluyente, el contraión modificador, etildiisopropilamonio, se reemplaza por el ion 1,4-dipiridiniumbutano que absorbe UV. La separación de cationes se llevó a cabo a la longitud de onda óptima l = 260 nm en una escala de 0,4 A en el modo de "plegado de escala"; la polaridad de la grabadora se invirtió. La separación de todos los cationes estudiados se logró mediante la introducción de un aditivo complejante, el ácido oxálico. Los límites de detección para Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ son 8 μg / L; 16 μg / L; 34 μg / L; 72 μg / L, respectivamente. En las condiciones seleccionadas, se analizó el agua del grifo, cuyo contenido de Ca 2+ es 10,6 +1,9 mg-ion / l, Mg 2+ -2,5 + mg-ion / l. El error de reproducibilidad no supera el -2,2% para Ca 2+ y el 1,4% para Mg 2+.

Análisis de complejos de cadmio en el medio ambiente.

Para estudiar los mecanismos de migración de metales pesados en la biosfera, se necesitan datos sobre las formas químicas de la existencia de metales en la naturaleza. Las dificultades en el análisis de compuestos de uno de los metales más tóxicos, el cadmio, están asociadas con el hecho de que forma complejos frágiles y, al intentar aislarlos, se distorsionan los equilibrios naturales. En este trabajo se investigaron compuestos de cadmio en suelo y plantas mediante una técnica basada en la separación cromatográfica de extractos con posterior identificación de los componentes mediante análisis químico. Este enfoque hizo posible no solo identificar las formas químicas del cadmio, sino también rastrear sus transformaciones en los objetos ambientales.

Los grupos OH de carbohidratos y polifenoles (incluidos los flavonoides), C = O, fosfatos, NH 2, NO 2, los grupos SH se coordinan con el cadmio en los objetos de la biosfera. Para los propósitos de este estudio, se compiló un conjunto de ligandos modelo que representan estas clases de compuestos. La interacción de los ligandos modelo con las sales de cadmio solubles en agua se investigó mediante espectroscopía UV y HPLC.

Para aislar los compuestos de cadmio, utilizamos la extracción con disolventes especialmente seleccionados (que no forman complejos con Cd). Por lo tanto, es posible separar el cadmio de todos los metales pesados, a excepción de su análogo químico cercano: el zinc. Los picos que contienen cadmio y zinc en los cromatogramas de los extractos obtenidos se detectaron mediante la unión de metales en forma de sus ditizonatos. Para la separación del zinc, se utilizó la diferencia en la estabilidad de los complejos de Cd y Zn a pH 6-8. Los compuestos de Cd aislados se identificaron mediante HPLC con un cambio de pH durante la elución. Se realizó un análisis de los compuestos de cadmio con componentes de suelos y tejidos vegetales, y se identificaron las sustancias producidas por las plantas en respuesta a un aumento en la ingesta de cadmio del suelo. Se ha demostrado que los flavonoides, en particular la tricina, son agentes protectores en los cereales, derivados alcoxi de la cisteína en las legumbres y polifenoles y tioles en las crucíferas.

CAPÍTULO 4. EQUIPO DE HPLC

SERIE ACCELA

El nuevo cromatógrafo de líquidos de ultra alto rendimiento ACCELA es capaz de operar en la más amplia gama de caudales y presiones, proporcionando tanto una separación HPLC típica en columnas convencionales como una separación ultrarrápida y eficiente en columnas con un tamaño de partícula de sorbente inferior a 2 μm a presiones ultra altas (más de 1000 atm.).

El sistema incluye una bomba de entrada de gradiente trimestral capaz de presiones superiores a 1000 bar y con un volumen de retención de solo 65 µl para separación cromatográfica de alta velocidad. Muestreador automático ACCELA es capaz de funcionar en un ciclo de inyección de muestra de 30 segundos y proporciona la máxima reproducibilidad de inyección. Detector de red de diodos Accela PDA con un volumen de celda de flujo minimizado (2 μL) está optimizado para el modo de cromatografía de alta velocidad, utiliza la tecnología LightPipe patentada y mantiene la forma de pico simétrica, que resulta del uso de un sistema y columnas cromatográficas impecables.

El sistema se integra perfectamente con espectrómetros de masas para crear los mejores y más potentes sistemas HPLC / MS disponibles en el mundo.

Columnas UHP con un tamaño de grano de 1,9 μm disponibles de Thermo Electron para cualquier aplicación

SERIE TSP

El principio de diseño modular de los dispositivos HPLC permite al cliente completar de manera flexible el equipo para resolver cualquier tarea analítica y, si cambian, se pueden modificar de manera rápida y económica. La amplia gama de módulos incluye bombas que van desde gradiente isocrático hasta de cuatro componentes, desde microcolumnas hasta semipreparativas, todos los detectores disponibles, sistemas de inyección de muestras, desde inyectores manuales hasta inyectores automáticos con cualquier capacidad de manipulación de muestras, un potente software para procesar los resultados de las mediciones y controlar todo módulos del sistema. Todos los módulos están certificados según CSA, TUF / GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000, son compactos, tienen un diseño moderno, son fáciles de operar, están equipados con una pantalla incorporada y una -sistema de diagnóstico, le permite crear y guardar parámetros de métodos de tarea. Cumplen los criterios de "Buenas prácticas de laboratorio" (BPL) y están incluidos en el Registro de instrumentos de medida de la Federación de Rusia. Los informes de medición se emiten de acuerdo con las farmacopeas de Inglaterra, EE. UU., Alemania y Francia.

Los sistemas modulares TSP se caracterizan por la máxima fiabilidad y estabilidad operativa.

La combinación de módulos proporciona al analista todas las ventajas de un sistema integral por un lado y la flexibilidad de un sistema modular por el otro. En cualquier campo de aplicación de la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC): farmacología, biotecnología, análisis medioambiental, análisis clínico,

Aire interior: métodos de control y limpieza. Control de la fuente de sustancias nocivas y del medio ambiente. Analizadores de gases: aplicación y sus tipos modernos para controlar la composición de la mezcla de gases: líquido fotométrico universal y cinta.

Monitorización como sistema de seguimiento y control del medio ambiente. Métodos de seguimiento de contaminantes en objetos ambientales.

Separación de aniones mediante cromatografía iónica de columna única. Imagen de la estructura de una partícula de resina de intercambio iónico. Ejemplos del uso de la cromatografía de intercambio iónico en el análisis de objetos ambientales. Características del análisis de cerveza por cromatografía iónica.

Características generales de los compuestos organoclorados, sus principales propiedades y aplicaciones físicas y químicas, impacto negativo en el medio ambiente, el organismo de los animales, peces y seres humanos. Plaguicidas organoclorados en alimentos y métodos para su determinación.

Fundamentos de la cromatografía plana (capa fina): estado y perspectivas del uso de métodos instrumentales modernos para el análisis de plaguicidas, plaguicidas organoclorados en agua, alimentos, piensos y productos del tabaco mediante cromatografía en capa fina.

Métodos disponibles para tomar muestras de aire interior para su análisis. El principio de funcionamiento de los tubos colorimétricos. Decoloración de un reactivo en particular al entrar en contacto con un contaminante en particular. Detección de compuestos orgánicos volátiles.

Fundamentos teóricos de la fluometría (luminiscencia), áreas de su aplicación en el análisis de objetos ambientales y modernos equipos de investigación. Extraordinaria sensibilidad y velocidad de análisis de luminiscencia. Problemas de suministro de energía de excitación.

El desarrollo de equipos de análisis químico no solo no elimina el problema de la calidad de las mediciones realizadas, sino que, por el contrario, plantea exigencias cada vez mayores en todos los aspectos de las mediciones.

Información general sobre la instalación industrial. Condiciones climáticas de la zona. Cadena tecnológica. Fuentes de contaminación y perturbación del medio natural. Contaminación de aguas naturales. Puntos de observación de la calidad del agua superficial. Métodos de muestreo y análisis de agua.

Una amplia gama de compuestos orgánicos introducidos al medio ambiente en el curso de la actividad económica humana lleva a que estas sustancias se hayan convertido en los principales contaminantes que determinan la naturaleza de la contaminación tecnogénica de la hidrosfera.

Características de los métodos de análisis espectroscópicos. La esencia de los métodos fotométricos de extracción. Ejemplos de uso del método para la determinación de metales pesados en aguas naturales. Método de detección de iones bromuro, iones nitrato. Equipo moderno.

El concepto y propósito de la cromatografía de gases, los parámetros de su retención. Tiempo de retención y volumen de retención. Ecuaciones en cromatografía de gases. Dispositivos adicionales para cromatografía de gases. Control de la contaminación atmosférica en situaciones de emergencia.

El concepto y las características del método de espectrometría de masas. Espectrómetros de masas de doble enfoque en espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. El uso de cromatografía-espectrometría de masas en la identificación de contaminantes ambientales, equipos.

Métodos para evaluar la contaminación de corrientes de gas. Requisitos básicos para métodos de medición y análisis y muestreo de gases. Métodos para evaluar la contaminación paramétrica. Métodos para evaluar la contaminación del medio acuático, suelo, suelo y vegetación. Identificación de cambios.

Determinación de milésimas de porcentaje del contenido de sustancia en metales puros por métodos ópticos de análisis mediante métodos de adsorción por espectrofotometría, fotocolorimetría y colorimetría. Venta de equipos analíticos químicos a través de sitios web.

Propósito y principios básicos para la implementación de métodos de análisis conductimétrico. Variedades de métodos utilizados y características de su aplicación. Ejemplos del uso de la conductometría en el análisis de objetos ambientales y los equipos necesarios para ello.

Con respecto a las aguas naturales, se consideran los problemas de determinación cuantitativa y separación en componentes antropogénicos y naturales de los hidrocarburos (CH).

Los métodos de sorción para la purificación del agua se utilizan cada vez más y uno de los sorbentes más utilizados es el carbón activado.

Los principales tipos de cromatografía. Aplicación de métodos cromatográficos en monitorización ambiental. Aplicación de la cromatografía en el análisis de objetos ambientales. Diseño de hardware moderno. Métodos para el desarrollo de cromatogramas y el trabajo de un cromatógrafo.

Seguimiento de aguas naturales por métodos fisicoquímicos: planar (cromatografía en capa fina) y su aplicación para lisis de agua. Separación de una mezcla de sustancias en una capa plana de sorbente y disolvente. Intensidad de luminiscencia de productos petrolíferos en un fluorómetro.

(OFS 42-0096-09)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de cromatografía en columna en la que la fase móvil (FP) es un líquido.

hueso moviéndose a través de una columna cromatográfica llena de

la fase móvil (sorbente). Las columnas de HPLC tienen altas presiones hidráulicas en la entrada de la columna, por lo que a veces se hace referencia a HPLC como

vyvayut "cromatografía líquida de alta presión".

Dependiendo del mecanismo de separación de sustancias, se distinguen los siguientes:

Opciones de HPLC: adsorción, distribución, intercambio iónico,

exclusivo, quiral, etc.

En la cromatografía de adsorción, la separación de sustancias se produce debido a su diferente capacidad para adsorber y desorber con

la superficie de un adsorbente con una superficie desarrollada, por ejemplo, gel de sílice.

En la HPLC de distribución, la separación se produce debido a la diferencia en los coeficientes de distribución de las sustancias a separar entre los componentes estacionarios.

(generalmente injertado químicamente a la superficie de un soporte inmóvil) y

fases móviles.

Según la polaridad de PP y NF, la HPLC se divide en fase normal y vol-

fase expandida.

La cromatografía en fase normal se denomina una variante de cromatografía en la que

utilice un sorbente polar (por ejemplo, gel de sílice o gel de sílice con

NH2 - o grupos CN trenzados) y PF no polar (por ejemplo, hexano con desarrollo

adiciones personales). En la cromatografía de fase inversa, el

utilizar sorbentes no polares modificados químicamente (por ejemplo,

radical alquilo no polar C18) y fases móviles polares (por ejemplo,

metanol, acetonitrilo).

En cromatografía de intercambio iónico, moléculas de sustancias en una mezcla, disociación

formados en la solución en cationes y aniones, se separan cuando se mueven a través de

sorbente (catión o anión) debido a sus diferentes tipos de intercambio con iónico

mi grupos absorbentes.

En exclusión (tamiz, gel penetrante, gel filtración)

En la cromatografía, las moléculas de sustancias se separan por tamaño debido a su diferente capacidad para penetrar en los poros de la fase estacionaria. En este caso, el primero de los

emergen las moléculas más grandes (con el peso molecular más alto), capaces de penetrar en el número mínimo de poros de la fase estacionaria,

y las últimas son sustancias con moléculas de pequeño tamaño.

La separación a menudo no se produce de uno en uno, sino de varios mecanismos simultáneamente.

El método HPLC se puede utilizar para controlar la calidad de cualquier negativo.

de analitos cigomáticos. Para el análisis, utilice los instrumentos adecuados: cromatógrafos de líquidos.

La composición de un cromatógrafo de líquidos generalmente incluye los siguientes conceptos básicos:

ny nodos:

– Unidad de preparación de FP, que incluye un contenedor con una fase móvil (o un capacitivo

con disolventes individuales que forman parte de la fase móvil

zy) y el sistema de desgasificación de PF;

– sistema de bombeo;

– mezclador de fase móvil (si es necesario);

– sistema de inyección de muestra (inyector);

– columna cromatográfica (se puede instalar en un termostato);

- detector;

– sistema de recopilación y procesamiento de datos.

Sistema de bombeo

Las bombas proporcionan suministro de PF a la columna a una velocidad constante determinada. La composición de la fase móvil puede ser constante o variable.

durante el análisis. En el primer caso, el proceso se llama isocrático,

y en el segundo - gradiente. Frente al sistema de bombeo, a veces se instala

filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm para la filtración de la fase móvil. Moderno

El sistema de bombeo del cromatógrafo de líquidos consta de una o más bombas controladas por una computadora. Esto le permite cambiar el co-

convirtiéndose en PF de acuerdo con un programa determinado durante la elución del gradiente. Sme-

Los componentes de PF en el mezclador pueden ocurrir tanto a baja presión

inclinado (antes de las bombas) y a alta presión (después de las bombas). El mezclador se puede utilizar para la preparación de PP y para elución isocrática,

sin embargo, se logra una proporción más precisa de componentes mediante

mezcla de componentes PF para un proceso isocrático. Las bombas para HPLC analítica permiten mantener un caudal constante de PP en la columna en el rango de 0,1 a 10 ml / min a una presión en la entrada de la columna de hasta 50 MPa. Sin embargo, es aconsejable que este valor no supere

shalo 20 MPa. Las pulsaciones de presión se minimizan mediante una amortiguación especial.

sistemas ferrosos incluidos en el diseño de las bombas. Piezas de trabajo en

Las bombas están fabricadas con materiales resistentes a la corrosión, lo que permite el uso de componentes agresivos en la composición del PF.

Mezcladores

Por su diseño, los mezcladores pueden ser estáticos o dinámicos.

mental.

En el mezclador, se forma una sola fase móvil a partir del

disolventes separados suministrados por bombas, si la mezcla requerida no se ha preparado de antemano. La mezcla de disolventes suele producirse de forma espontánea, pero a veces se utilizan sistemas de mezcla forzada.

de coser.

Inyectores

Los inyectores pueden ser versátiles para la inyección de muestras desde

1 μl a 2 ml o discretos para inyectar una muestra de solo un cierto volumen

ema. Ambos tipos de inyectores pueden ser automáticos ("autoinyectores" o "automuestreadores"). El inyector para inyección de la muestra (solución) no está ubicado

directamente delante de la columna cromatográfica. El diseño del inyector permite cambiar la dirección del flujo de PF y realizar una inyección preliminar de la muestra en un bucle de cierto volumen (generalmente de 10 a 100 μL).

Este volumen está indicado en la etiqueta de la bisagra. El diseño del inyector permite la sustitución del bucle. Para la introducción de la solución analizada en lo desconocido.

el inyector de tomate es una micro-jeringa manual con un volumen que es

superando significativamente el volumen del bucle. El exceso de la solución inyectada, no

en el bucle se desecha y se inyecta en la columna un volumen exacto y siempre igual de muestra. El llenado manual incompleto del bucle reduce la precisión

precisión y reproducibilidad de la dosificación y, por lo tanto, perjudica la precisión

ness y reproducibilidad del análisis cromatográfico.

Columna cromatográfica

Las columnas cromatográficas suelen ser tubos de acero inoxidable, vidrio o plástico llenos de sorbente y cerrados

en ambos lados con filtros con un diámetro de poro de 2–5 µm. Longitud analítica

columna, dependiendo del mecanismo de separación cromatográfica, puede estar en el rango de 5 a 60 cm o más (generalmente es

10-25 cm), diámetro interior: de 2 a 10 mm (generalmente 4,6 mm). Las columnas con un diámetro interior inferior a 2 mm se utilizan en microcolumnas de cromo.

tografía. También se utilizan columnas capilares con diámetros internos.

ron alrededor de 0.3-0.7 mm. Las columnas para cromatografía preparativa tienen un diámetro interior de hasta 50 mm o más.

Se pueden instalar cables cortos delante de la columna analítica.

columnas (columnas de protección) que realizan diversas funciones auxiliares

(más a menudo - protección de la columna analítica). Por lo general, el análisis se lleva a cabo con un

temperatura, sin embargo, para aumentar la eficiencia de separación y

reduciendo la duración del análisis, se puede utilizar un termostato

columnas tirovanie a temperaturas no superiores a 60 C. A temperaturas más altas, es posible la destrucción del sorbente y un cambio en la composición del PF.

Fase estacionaria (sorbente)

Usualmente utilizado como sorbentes:

1. El gel de sílice, el óxido de aluminio y el grafito poroso se utilizan en condiciones normales.

cromatografía de fase pequeña. El mecanismo de sujeción en este caso.

té - generalmente adsorción;

2. Resinas o polímeros con grupos ácidos o básicos. Área de aplicación: cromatografía de intercambio iónico;

3. Polímeros o gel de sílice poroso (cromatografía de exclusión por tamaño);

4. Sorbentes químicamente modificados (sorbentes con injertos

zami), preparado con mayor frecuencia a base de gel de sílice. El mecanismo de retención en la mayoría de los casos es la distribución entre los

noé y fases estacionarias;

5. Sorbentes quirales modificados químicamente, por ejemplo,

celulosas y amilosas acuosas, proteínas y péptidos, ciclodextrinas,

utilizado para la separación de enantiómeros (cromatografía quiral

Los sorbentes con fases injertadas pueden tener diversos grados de sustancia química.

modificación técnica. Las partículas absorbentes pueden ser esféricas o no

forma regular y porosidad variada.

Las fases injertadas más utilizadas son:

– grupos octilo(octilsilano sorbente o C8);

– grupos octadecilo(octadecilsilano absorbente

(ODS) o C18);

– grupos fenilo(sorbente de fenilsilano);

– grupos cianopropilo(Sorbente de CN);

– grupos aminopropilo(Sorbente de NH2);

- grupos diol (diol sorbente).

Muy a menudo, el análisis se realiza en fases injertadas no polares en

Modo de fase inversa con sorbente C18.

En algunos casos, es más recomendable aplicar normal

cromatografía de fase. En este caso, se utiliza gel de sílice o fases injertadas polares ("CN", "NH2", "diol") en combinación con disolventes no polares.

Los sorbentes con fases injertadas son químicamente estables a valores de pH de 2,0 a 8,0, a menos que el fabricante especifique lo contrario.

Las partículas absorbentes pueden tener formas esféricas o irregulares y diversas porosidades. El tamaño de partícula del sorbente en HPLC analítica suele ser de 3 a 10 µm, en HPLC preparativa, hasta 50 µm o más.

También se utilizan sorbentes monolíticos.

La alta eficiencia de separación es proporcionada por la alta área de superficie de las partículas absorbentes (que es una consecuencia de su microscópico

tamaño y presencia de poros), así como la uniformidad de la composición absorbente y su empaquetamiento denso y uniforme.

Detectores

Se utilizan varios métodos de detección. En el caso general, el PP con los componentes disueltos en él después de la columna cromatográfica

Ki entra en la celda detectora, donde una u otra de sus propiedades (absorción en la región UV o visible del espectro, fluorescencia,

índice de refracción, conductividad eléctrica, etc.). El cromatograma resultante es un gráfico de la dependencia de algunos

o parámetro fisicoquímico del FP frente al tiempo.

Los más comunes son los espectrofotométricos

tectores (incluida la matriz de diodos), que registran un cambio en la óptica

densidad en ultravioleta, visible y, a menudo, infrarrojo cercano

regiones espectrales de 190 a 800 o 900 nm. El cromatograma en este caso

El té representa la dependencia de la densidad óptica del FP con el tiempo.

El detector espectrofotométrico de uso tradicional permite

Puede realizar la detección en cualquier longitud de onda en su rango de trabajo.

zona. También se utilizan detectores de longitud de onda múltiple, lo que permite

para proporcionar detección en varias longitudes de onda simultáneamente.

Con la ayuda de un detector de matriz de diodos, es posible no solo realizar la detección en varias longitudes de onda a la vez, sino también de manera prácticamente instantánea

para obtener el espectro óptico del FS en cualquier instante (sin escaneo), lo que simplifica enormemente el análisis cualitativo de los componentes separados.

ponentes.

La sensibilidad de los detectores fluorescentes es aproximadamente 1000 veces mayor que la sensibilidad de los espectrofotométricos. En este caso, se utiliza la fluorescencia intrínseca o la fluorescencia de los correspondientes derivados, si la sustancia que se va a determinar por sí misma no presenta fluorescencia. Moderno

Los detectores fluorescentes permiten no solo obtener cromatográficos

gramos, sino también para registrar los espectros de excitación y fluorescencia del análisis

conexiones.

Los detectores refractométricos se utilizan para analizar muestras que no absorben en las regiones espectrales visibles y UV (por ejemplo, carbohidratos).

(refractómetros). Las desventajas de estos detectores son su baja sensibilidad (en comparación con los detectores espectrofotométricos) y una dependencia significativa de la temperatura de la intensidad de la señal (el detector debe estar termostatizado).

También se utilizan detectores electroquímicos (conductimétricos

cielo, amperométrico, etc.), espectrometría de masas y Fourier-IR

detectores, detectores de dispersión de luz, radiactividad y algunos otros

Fase móvil

V Como PP, se pueden utilizar una variedad de disolventes, tanto individuales como en mezclas.

V fase normal La cromatografía suele utilizar carbono líquido.

levodorods (hexano, ciclohexano, heptano) y otros relativamente no polares

disolventes con pequeñas adiciones de compuestos orgánicos polares,

que regulan el poder de elución del PF.

En la cromatografía de fase inversa, el PF contiene polar

disolventes orgánicos (generalmente acetonitrilo y metanol) y agua. Para optar

Las separaciones suelen utilizar soluciones acuosas con un cierto

el pH, en particular las soluciones tampón. Se utilizan aditivos inorgánicos

ácidos, bases y sales químicos y orgánicos y otros compuestos (para

ejemplo, modificadores quirales para la separación de enantiómeros en aquirales

sorbente).

El control del valor de pH debe realizarse por separado para el componente acuoso y no para su mezcla con un disolvente orgánico.

PF puede constar de un solvente, a menudo de dos, si es necesario

alcance - de tres o más. La composición del PP se indica como la relación en volumen de los disolventes incluidos en él. En algunos casos, masa

la proporción, que debe estipularse especialmente.

Cuando se utiliza un detector espectrofotométrico UV, el FP no debería tener una absorción pronunciada en la longitud de onda seleccionada para la detección. Límite de transparencia o densidad óptica al determinar

A menudo se indica la longitud de onda específica del disolvente de un fabricante en particular.

que se encuentra en el embalaje.

El análisis cromatográfico está muy influenciado por el grado de pureza del PF, por lo que es preferible utilizar disolventes fabricados

específicamente para cromatografía líquida (incluida agua).

El PP y las soluciones analizadas no deben contener insolubles.

partículas y burbujas de gas. Agua obtenida en condiciones de laboratorio

soluciones acuosas, premezcladas con agua, soluciones orgánicas

Los instrumentos, así como las soluciones analizadas, deben someterse a una fina filtración y desgasificación. La filtración se usa generalmente para estos fines.

al vacío a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm inerte con respecto al disolvente o solución dados.

Sistema de recopilación y procesamiento de datos

El moderno sistema de procesamiento de datos es una interfaz

ordenador personal conectado con el cromatógrafo con instalado

software que le permite registrar y procesar

matograma, así como controlar el funcionamiento del cromatógrafo y supervisar los principales

parámetros del sistema cromatográfico.

Lista de condiciones cromatográficas a indicar

En una monografía privada, los tamaños de

columnas, tipo de sorbente con indicación del tamaño de partícula, temperatura de la columna (si es necesario, termostatización), volumen de muestra inyectada (volumen del circuito),

convirtiéndose en PF y el método de su preparación, velocidad de alimentación de PF, condiciones de detección y detector, descripción del modo de gradiente (si se usa), tiempo de cromatografía.

INTERCAMBIO IÓNICO Y HPLC IÓNICA

La cromatografía de intercambio iónico se utiliza para el análisis de ambos compuestos orgánicos.

(bases heterocíclicas, aminoácidos, proteínas, etc.) e inor-

compuestos ganicos (varios cationes y aniones). Separación de componentes

Los contenidos de la mezcla analizada en la cromatografía de intercambio iónico se basan en la interacción reversible de los iones de las sustancias analizadas con los grupos iónicos.

sorbente pami. Anionitos o cationes

usted. Estos sorbentes son principalmente iónicos poliméricos

resinas de intercambio (generalmente copolímeros de estireno y divinilbenceno con injertos

grupos iónicos) o geles de sílice con grupos de intercambio iónico injertados. Los sorbentes con grupos - (СН2) 3 N + X– se utilizan para separar aniones, y los sorbentes con grupos - (СН2) SO3 - Н + se utilizan para separar cationes.

Por lo general, las resinas poliméricas se utilizan para separar aniones y

lixiviación de cationes - geles de sílice modificados.

Como PF en cromatografía de intercambio iónico, se utilizan soluciones acuosas de ácidos, bases y sales. Las carreras de amortiguadores se utilizan comúnmente.

cremas que te permiten mantener determinados valores de pH. También es posible utilizar pequeños aditivos orgánicos miscibles en agua.

disolventes químicos: acetonitrilo, metanol, etanol, tetrahidrofurano.

Cromatografía iónica- una variante de la cromatografía de intercambio iónico, en

que para determinar la concentración de iones del analito es

utiliza un detector conductimétrico. Para operaciones muy sensibles

Determinación de cambios en la conductividad que pasa a través del detector PF, la conductividad de fondo del PF debe ser baja.

Hay dos opciones principales para la cromatografía iónica.

El primero de ellos se basa en la supresión de la conductividad eléctrica de la electrólisis.

el PF usando una segunda columna de intercambio iónico ubicada entre los

columna lítica y detector. En esta columna se produce la neutralización

El PF y los compuestos analizados ingresan a la celda detectora en el

agua. Los iones detectados son los únicos iones

proporcionando conductividad PF. La desventaja de la columna supresora es la necesidad de regenerarla a intervalos bastante cortos.

me. La columna supresora se puede reemplazar por un

un supresor de membrana, en el que la composición de la membrana es continuamente

se renueva por el flujo de la solución regeneradora que se mueve en la dirección,

opuesta a la dirección del flujo de PF.

La segunda variante de la cromatografía iónica es la cromatografía iónica de columna única.

matografía. En esta versión, se utiliza un PF con una conductividad eléctrica muy baja.

contenido de agua. Los compuestos orgánicos débiles se utilizan ampliamente como electrolitos.

Ácidos skic - benzoico, salicílico o isoftálico.

HPLC EXCLUSIVO

La cromatografía de exclusión por tamaño (cromatografía de exclusión por tamaño) es un tipo especial de HPLC basado en la separación de moléculas por su tamaño. Distribución

moléculas entre las fases estacionaria y móvil se basa en el tamaño del mo-

léculas y en parte en su forma y polaridad. Para la separación, utilice un

Sorbentes porosos: polímeros, gel de sílice, vidrios porosos y polisacáridos.

El tamaño de partícula de los sorbentes es de 5 a 10 µm.

Las ventajas de los vidrios porosos y el gel de sílice son la rápida difusión del PP y las moléculas de analito en los poros y la estabilidad en diversas condiciones (incluso a altas temperaturas). Polímero absorbente

son copolímeros de estireno y divinilbenceno (estos son hidro-

absorbentes fóbicos utilizados con fases móviles no polares) y

geles hidrófilos hechos de resinas sulfonadas de divinilbenceno o poliacrilamida.

Son posibles dos tipos limitantes de interacción de moléculas con una fase estacionaria porosa. Las moléculas, cuyo tamaño es mayor que el diámetro medio de los poros a, no penetran en absoluto en el sorbente y se eluyen junto con la fase móvil.

ir primero. Moléculas con un diámetro mucho más pequeño que el tamaño de los poros del sor-

benta penetran libremente en él, permanecen en la fase estacionaria durante más tiempo y son eluidos en último lugar. Las moléculas de tamaño mediano penetran en los poros del sorbente según el tamaño y, en parte, según su forma. Eluyen con diferentes tiempos de retención entre ca-

nuestras moléculas más grandes y más pequeñas. La separación de los componentes de la muestra cromatografiada se produce como resultado de repetidas acciones

difusión de los componentes de la muestra en los poros del sorbente y viceversa.

En cromatografía de exclusión por tamaño para caracterizar la retención de

utiliza un volumen de retención igual al producto del caudal de PF y el tiempo de retención.

Fase móvil. La elección del PP depende del tipo de sorbente. Exclusivo-

ny cromatografía se divide generalmente en filtración en gel y gel

cromatografía de penetración.

El método de cromatografía de filtración en gel se utiliza para separar

de compuestos solubles en agua sobre absorbentes hidrófilos. Las fases móviles son soluciones tampón acuosas con un valor de pH determinado.

En cromatografía de permeación en gel, sor-

disolventes orgánicos no polares (tolueno, diclorometano, tet-

rahidrofurano). Este método se utiliza para analizar compuestos con baja solubilidad.

borde en el agua.

Detectores Los detectores refractométricos diferenciales, así como los detectores espectrofotométricos (incluidos los de la región infrarroja del espectro) se utilizan como detectores en la cromatografía de exclusión por tamaño.

También se utilizan detectores láser viscosimétricos y de flujo continuo.

Estos detectores, en combinación con un refractómetro u otra concentración

detector le permite determinar continuamente el peso molecular del

limer en PF.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ULTRA EFICIENTE

La cromatografía líquida de ultra rendimiento es una variante de la cromatografía líquida que es más eficiente

en comparación con la HPLC clásica.

Una característica de la cromatografía líquida de ultra rendimiento es

Se utiliza el uso de sorbentes con un tamaño de partícula de 1,5 a 2 micrones. Dimensiones cromado

Las columnas matográficas suelen tener de 50 a 150 mm de longitud y de 1

hasta 4 mm de diámetro. El volumen de la muestra inyectada puede ser de 1 a 50 μl.

Equipo cromatográfico utilizado en la clásica

HPLC riante, generalmente especialmente adaptada para este tipo de cromatografía

El equipo diseñado para cromatografía líquida de ultra rendimiento también se puede utilizar en la versión clásica de HPLC.

Cromatografía líquida

Cromatografía líquida es un tipo de cromatografía en la que fase móvil, llamado eluyente, es líquido. Fase estacionaria quizás sorbente sólido, portador sólido con un líquido aplicado a su superficie o gel.

Distinguir de columna y capa fina cromatografía líquida. En la versión de columna, una parte de la mezcla de sustancias a separar se pasa a través de una columna llena de una fase estacionaria en un flujo de eluyente que se mueve bajo presión o bajo la acción de la gravedad. En la cromatografía de capa fina, el eluyente se mueve bajo la acción de fuerzas capilares a lo largo de una capa absorbente plana aplicada a una placa de vidrio o lámina metálica, a lo largo de una película de polímero poroso o a lo largo de una tira de papel cromatográfico especial. También se ha desarrollado un método de cromatografía líquida de capa fina bajo presión, cuando el eluyente se bombea a través de una capa absorbente intercalada entre las placas.

Existen tipos de cromatografía líquida como analítico(para el análisis de mezclas de sustancias) y preparativo(aislar componentes puros).

Distinguir cromatografía líquida (LC) en su versión clásica, realizada en presión atmosférica, y alta velocidad) llevado a cabo en Alta presión sanguínea... La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utiliza columnas de hasta 5 mm de diámetro, empaquetadas con un sorbente con partículas pequeñas (3-10 micrones). Para bombear el eluyente a través de la columna, aplique una presión de hasta 3,107 Pa. Este tipo de cromatografía se llama cromatografía de alta presión... El paso del eluyente a través de la columna a alta presión permite aumentar drásticamente la velocidad de análisis y aumentar significativamente la eficiencia de separación debido al uso de un sorbente finamente disperso.

Opciones de HPLC están cromatografía en microcolumna en columnas de pequeño diámetro llenas de sorbente y cromatografia capilar en columnas capilares huecas y llenas de absorbente. Actualmente, el método HPLC permite aislar, analizar cuantitativa y cualitativamente mezclas complejas de compuestos orgánicos.

La cromatografía líquida es el método de investigación fisicoquímica más importante en química, biología, bioquímica, medicina y biotecnología. Se utiliza para:

· Estudio de procesos metabólicos en organismos vivos de fármacos;

· Diagnóstico en medicina;

· Análisis de productos de síntesis química y petroquímica, intermedios, tintes, combustibles, lubricantes, aceite, aguas residuales;

· Estudio de isotermas de sorción de solución, cinética y selectividad de procesos químicos;

Descarga

· Análisis y separación de mezclas, su purificación y aislamiento de muchas sustancias biológicas a partir de ellas, como aminoácidos, proteínas, enzimas, virus, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, hormonas.

En la química de compuestos macromoleculares y en la producción de polímeros se analiza la calidad de los monómeros mediante cromatografía líquida, se estudia la distribución del peso molecular y la distribución por tipos de funcionalidad de oligómeros y polímeros, necesaria para el control del producto.

La cromatografía líquida también se utiliza en perfumería, industria alimentaria, para el análisis de la contaminación ambiental, en ciencia forense.

El método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se desarrolló e introdujo a mediados de los años 70 del siglo XX. Entonces aparecieron los primeros cromatógrafos de líquidos.

La cromatografía líquida es el método óptimo para el análisis de moléculas química y térmicamente inestables, sustancias de alto peso molecular con volatilidad reducida. Esto se puede explicar por el papel especial de la fase móvil en la CL, en contraste con la cromatografía de gases: el eluyente no solo realiza una función de transporte.

2. Conceptos básicos y clasificación de los métodos de cromatografía líquida.

Por el mecanismo de retención de las sustancias separadas por la fase estacionaria LC distinguir entre:

cromatografía de sedimentos

· cromatografía de adsorción , en el que la separación se lleva a cabo como resultado de la interacción de la sustancia a separar con adsorbente como óxido de aluminio o gel de sílice, tener en la superficie centros polares activos. Solvente(eluyente) - líquido no polar.

Arroz. Esquema de separación de una mezcla de sustancias por cromatografía de adsorción.

http: // www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

El mecanismo de sorción consiste en una interacción específica entre la superficie polar del sorbente y las regiones polares (o capaces de polarizar) de las moléculas del componente analizado (Fig.). La interacción se produce debido a la interacción donante-aceptor o la formación de enlaces de hidrógeno.

Arroz. Diagrama de cromatografía líquida de adsorción.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "ancho =" 219 "alto =" 200 ">

Arroz. ... Cromatografía de partición en fase injertada (variante de fase normal).

http: // www. chemnet. ru / rus / enseñanza / aceite / spezprakt-chr. html

A fase normal En la variante de cromatografía líquida de partición, se utilizan alquilclorosilanos sustituidos que contienen grupos polares, como nitrilo, grupos amino, etc., como modificadores de la superficie del gel de sílice (fases injertadas) (Fig.). El uso de fases injertadas permite controlar con precisión las propiedades de sorción de la superficie de la fase estacionaria y lograr una alta eficiencia de separación.

Fase invertida La cromatografía líquida se basa en la distribución de los componentes de la mezcla entre el eluyente polar y los grupos no polares (cadenas de alquilo largas) injertados en la superficie del sorbente (Fig.). Con menos frecuencia, se utiliza una variante de cromatografía líquida con fases soportadas, cuando se aplica una fase líquida estacionaria a un soporte estacionario.

Arroz. ... Cromatografía de partición en fase injertada (versión de fase inversa). http: // www. chemnet. ru / rus / enseñanza / aceite / spezprakt-chr. html

La cromatografía líquida de partición incluye líquido de extracción cromatografia, en la que la fase estacionaria es un extractante orgánico depositado sobre un portador sólido, y la fase móvil es una solución acuosa de los compuestos a separar. Como extractantes se utilizan, por ejemplo, fenoles, fosfatos de trialquilo, aminas, bases de amonio cuaternario, así como compuestos organofosforados que contienen azufre. La cromatografía líquida de extracción se utiliza para separar y concentrar compuestos inorgánicos, por ejemplo, iones de metales alcalinos, actínidos y otros elementos con propiedades similares, en el procesamiento de combustible nuclear gastado.

cromatografía de intercambio de iones,

intercambiadores de iones.

intercambiadores de cationes

anionitos.

intercambiadores de iones anfóteros

anfolitos

Ionita

Intercambiador de cationes

Anionitos

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (intercambio catiónico)

R-OH + Na + + Сl - → R-Сl + Na + + OH - (intercambio aniónico)

Los intercambiadores de iones deben cumplir los siguientes requisitos: ser químicamente estables en diversos entornos, mecánicamente fuertes en estado seco y especialmente hinchado, tener una alta capacidad de absorción y la capacidad de regenerarse bien.

En la cromatografía de intercambio iónico (iónico), los aniones (cationes) separados se detectan como ácidos (bases correspondientes) con un detector conductimétrico de alta sensibilidad, donde las columnas de alto rendimiento se llenan con un intercambiador de iones tensioactivo de pequeña capacidad.

cromatografía de pares iónicos

cromatografía de intercambio de ligando

diferente capacidad de los compuestos separados para formar complejos con cationes de metales de transición

cromatografía de exclusión por tamaño

diferencias en el tamaño molecular

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" right "width =" 429 "height =" 319 ">

Arroz. Esquema de cromatografía de permeación en gel

cromatografía de afinidad

Arroz. Esquema de cromatografía de afinidad

http: // www. chemnet. ru / rus / enseñanza / aceite / spezprakt-chr. html

Luego se elimina del polímero pasando una solución de un compuesto con una afinidad aún mayor por la macromolécula. Dicha cromatografía es especialmente eficaz en biotecnología y biomedicina para el aislamiento de enzimas, proteínas, hormonas.

Dependiendo de en la forma en que se transporta la sustancia se distinguen las siguientes opciones de cromatografía líquida: expresivo, frontal y desplazamiento.
Usado con más frecuencia expresivo una variante en la que una parte de la mezcla a separar se introduce en la columna en el flujo del eluyente. El rendimiento de los componentes de la mezcla de la columna se registra en el cromatograma como picos. (arroz.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "ancho =" 291 "alto =" 165 ">

Arroz. Esquema de la variante en desarrollo de la cromatografía.

Altura o área de pico caracteriza concentración de componentes, a retenida volúmenes – composición cualitativa de la mezcla... Los componentes suelen identificarse por la coincidencia de los tiempos de retención con las sustancias estándar; también se utilizan métodos químicos o fisicoquímicos.

A frontal En la variante (Fig.), Una mezcla de las sustancias a separar se pasa continuamente a través de la columna, que desempeña el papel de fase móvil. Como resultado, solo la sustancia que se absorbe menos en la columna se puede obtener en forma pura.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "ancho =" 279 "alto =" 145 ">

Arroz. Esquema de cromatografía frontal

El cromatograma en este caso representa pasos, cuyas alturas son proporcionales a las concentraciones de los componentes; los volúmenes de retención están determinados por el tiempo de retención de los componentes. Al diferenciar dicho cromatograma, se obtiene una imagen similar a la obtenida en la versión de revelado.

V desplazamiento Como variante, los componentes de la mezcla introducidos en la columna son desplazados por el eluyente, que se adsorbe con más fuerza que cualquier componente. Como resultado, se obtienen fracciones contiguas de las sustancias a separar El orden de liberación de los componentes está determinado por la fuerza de su interacción con la superficie absorbente (Fig.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "ancho =" 320 "alto =" 175 ">

Arroz. Esquema de cromatografía de desplazamiento

3. Cantidades cromatográficas básicas y su determinación.

Cuando se separan sustancias mediante cromatografía líquida, se pueden utilizar las variantes de revelado, frontal y de desplazamiento, como se indicó anteriormente. Muy a menudo, se usa una versión de revelado, en la que una porción de la mezcla a separar se introduce en la columna en el flujo del eluyente. El rendimiento de los componentes de la mezcla de la columna se registra en el cromatograma como picos. A partir del cromatograma (Fig.) Determine:

tiempos de retención de componentes separados no absorbibles (t0) (tR1, tR2, tR3, etc.); el ancho de la base de los picos (tw1, tw2, etc.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "ancho =" 61 "alto =" 24 src = ">;

B) volumen de retención de componente corregido ,

dónde t "R - tiempo de retención de componentes corregido;

C) relación de capacidad de la columna a un componente dado ;

D) eficiencia de la columna caracterizado por número de platos teóricos equivalentes

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "ancho =" 129 "alto =" 51 src = ">;

F) permiso https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "ancho =" 203 alto = 51 "alto =" 51 ">

Factor de capacitancia k " tiene un efecto significativo en el valor R S: en cambio k"de 0 a 10 (límites óptimos) R S aumenta enormemente. Sentido k " está determinada por la superficie duplicada del sorbente y su cantidad en la columna, así como por la constante de equilibrio de adsorción (constante de Henry).

Coeficiente de selectividad α se determina por la diferencia en las constantes de equilibrio de adsorción de los dos componentes separados. Con α creciente (de 1 a ~ 5) R S aumenta bruscamente, con un aumento adicional en α - cambia poco. La selectividad de la columna depende de factores como la estructura química de la superficie del sorbente, la composición del eluyente, la temperatura de la columna y la estructura de los compuestos que se van a separar. Dado que la sorción de sustancias cromatografiadas en cromatografía líquida está determinada por la interacción por pares de los tres componentes principales del sistema: el sorbente, las sustancias a separar y el eluyente, cambiar la composición del eluyente es una forma conveniente de optimizar el proceso de separación.

Eficiencia de la columna depende del tamaño de partícula y la estructura de los poros del adsorbente, de la uniformidad del relleno de la columna, de la viscosidad del eluyente y de la velocidad de transferencia de masa. El alargamiento de la columna no siempre conduce a una mejor separación, ya que la resistencia de la columna aumenta, la presión del eluyente en la entrada y el tiempo del experimento aumentan, y la sensibilidad y precisión del análisis disminuye debido al ensanchamiento del pico del componente analizado. . Si, entonces los picos de las dos sustancias en el cromatograma están casi completamente separados. Con crecimiento R S aumenta el tiempo de separación. A R S < 1 - la separación no es satisfactoria. En la cromatografía preparativa, en relación con la introducción de cantidades relativamente grandes de sustancias separadas, la columna se opera con sobrecarga. Esto disminuye la relación de capacitancia, aumenta la altura equivalente al plato teórico, lo que conduce a una disminución de la resolución.

4. Adsorbentes

La separación cromatográfica de la mezcla será eficaz si el adsorbente y el disolvente (eluyente) se seleccionan correctamente.

El adsorbente no debe interactuar químicamente con los componentes separados, exhibir un efecto catalítico sobre el solvente. También es necesario que el adsorbente sea selectivo con respecto a los componentes de la mezcla. Un desecante correctamente seleccionado debe tener la máxima absorbencia.

Distinguir polar (hidrofílico) y adsorbentes no polares (hidrofóbicos)... Debe recordarse que la afinidad de adsorción de las sustancias polares por los absorbentes polares es mucho mayor que la de las no polares.

Como adsorbentes se utilizan óxido de aluminio, carbones activados, gel de sílice, zeolitas, celulosa y algunos minerales.

Óxido de aluminioAl2O3 – adsorbente anfótero. (fig.) Sobre él las mezclas se pueden separar sustancias en polar y en disolventes no polares... La alúmina neutra se usa generalmente para cromatografía a partir de soluciones no acuosas de hidrocarburos saturados, aldehídos, alcoholes, fenoles, cetonas y éteres.

Arroz. Óxido de aluminio para cromatografía

http: // imágenes. /542857_w200_h200_product5.jpg

La actividad del Al2O3 depende de su contenido de humedad. El óxido de aluminio anhidro tiene la mayor actividad. Se toma convencionalmente como una unidad. Si es necesario, puede preparar alúmina con diferente contenido de humedad mezclando alúmina recién preparada con agua (escala de Brockmann).

Dependencia de la actividad del óxido de aluminio del contenido de humedad.

Por ejemplo, Al2O3 con una actividad de 1,5-2 se utiliza para separar hidrocarburos; para la separación de alcoholes y cetonas - 2-3,5.

Superficie específica de óxido de aluminio 230-380 m2 / g.

Gel de sílice(hidroxilado o químicamente modificado) es un dióxido de silicio gelatinoso seco, que se obtiene a partir de soluciones sobresaturadas de ácidos silícicos ( norte SiO2 metro H2O) a pH> 5-6. (Fig.) Absorbente hidrófilo sólido.

Arroz. Gel de sílice

http: // www. gel de sílice. /

http: // silikagel. ru / images / askg. gif

El tamaño de partícula del gel de sílice en columnas analíticas es de 3 a 10 micrones, en columnas preparativas, de 20 a 70 micrones. El pequeño tamaño de partícula aumenta la tasa de transferencia de masa y mejora la eficiencia de la columna. Las columnas analíticas modernas miden entre 10 y 25 cm de largo. Están llenos de gel de sílice con un tamaño de partícula de 5 micrones y permiten la separación de mezclas complejas de 20-30 componentes. A medida que el tamaño de partícula disminuye a 3-5 micrones, aumenta la eficiencia de la columna, pero también aumenta su resistencia. Entonces, para lograr un caudal de eluyente de 0.5-2.0 ml / min, se requiere una presión de (1-3) · 107Pa. El gel de sílice puede soportar tal caída de presión, mientras que los gránulos absorbentes de polímero son más elásticos y deformables. Recientemente, se han desarrollado sorbentes poliméricos mecánicamente fuertes con una estructura macroporosa con una red densa, que están cerca de los geles de sílice en su eficacia. La forma de las partículas sorbentes con un tamaño de 10 μm o más no tiene un gran efecto en la eficiencia de la columna, sin embargo, se prefieren los sorbentes esféricos, que proporcionan un empaque más permeable (Fig.)

Arroz. Gel de sílice esférico

http: // imágenes. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

La estructura interna de una partícula de gel de sílice es un sistema de canales de comunicación. Los absorbentes con un diámetro de poro de 6-25 nm se utilizan para cromatografía líquida. La separación de la cromatografía líquida se lleva a cabo principalmente sobre geles de sílice modificados por reacción de alquil y arilclorosilanos o alquil etoxisilanos con grupos superficiales de silanol. Con la ayuda de tales reacciones, se injertan grupos C8H17-, C18H37- o C6H5- (para obtener sorbentes con una superficie hidrofobizada), nitrilo, grupos hidroxilo, etc. (Fig.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "ancho =" 166 "alto =" 116 src = ">

Arroz. Estructura de gel de sílice modificada

Geles de sílice utilizado en cromatografía para la separación de mezclas de productos petrolíferos, mayor ácidos grasos, sus ésteres, aminas aromáticas, derivados nitrados compuestos orgánicos. Gel de sílice – sorbente hidrofílico, se moja fácilmente con agua. Por lo tanto, no se puede utilizar para la sorción de soluciones acuosas. La actividad del gel de sílice depende de su contenido de agua: cuanta menos agua contiene, más actividad (escala de Brockmann).

Dependencia de la actividad del gel de sílice del contenido de humedad.

La superficie específica de los geles de sílice es de 500 a 600 m2 / g.

Carbones activados son una forma de carbono que se vuelve extremadamente porosa durante el procesamiento y adquiere una superficie muy grande para la adsorción o reacciones químicas. (Fig.) Tienen una superficie específica de 1300-1700 m2 / g.

Arroz. Carbón activado

http: // catálogo electrónico. rusbiz. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

El principal efecto sobre la estructura de los poros de los carbones activados lo ejercen los materiales de partida para su producción. Los carbones activados basados en cáscaras de coco se caracterizan por una mayor proporción de microporos (hasta 2 nm), basados en carbón, una mayor proporción de mesoporos (2-50 nm). Una gran proporción de macroporos es característica de los carbones activados a base de madera (más de 50 nm). Los microporos son particularmente adecuados para la adsorción de moléculas pequeñas y los mesoporos son particularmente adecuados para la adsorción de moléculas orgánicas más grandes.

Zeolitas (tamices moleculares)- aluminosilicatos cristalinos porosos de metales alcalinos y alcalinotérreos de origen natural y sintético. (arroz.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "ancho =" 211 alto = 211 "alto =" 211 ">

Arroz. Zeolitas

http: // www. zeolita. spb. ru / _img / _36mm. jpg

http: // kntgroup. ru / thumb. php? file = / uploads / produkts / 6.jpg & x_width = 250

Hay cuatro tipos de zeolitas (A, X, Y, M) con diferentes estructuras cristalinas. Dependiendo del catión, las zeolitas se denominan como sigue: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Característica de las zeolitas es eso Los poros de los cristales tienen tamaños del orden de 0,4-1 nm, proporcionales al tamaño de las moléculas. muchas sustancias líquidas o gaseosas. Si las moléculas de una sustancia pueden penetrar en estos poros, entonces se produce la adsorción en los poros de los cristales de zeolita. Las moléculas más grandes de una sustancia no se adsorben. Al seleccionar zeolitas con diferentes tamaños de poros, es posible separar claramente mezclas de diferentes sustancias.

La superficie específica de las zeolitas es de 750 a 800 m2 / g.

Al elegir un adsorbente, es necesario tener en cuenta la estructura de las sustancias y su solubilidad. Por ejemplo, los hidrocarburos saturados se adsorben mal, mientras que los insaturados (tienen dobles enlaces) se adsorben mejor. Los grupos funcionales mejoran la capacidad de adsorción de una sustancia.

5. Eluyentes

Al elegir un disolvente (eluyente), es necesario tener en cuenta la naturaleza del adsorbente y las propiedades de las sustancias en la mezcla a separar. Los eluyentes deben disolver bien todos los componentes de la mezcla cromatografiada, tener una viscosidad baja, proporcionar el nivel requerido de selectividad, ser baratos, no tóxicos, inertes y compatibles con los métodos de detección (por ejemplo, el benceno no se puede usar como eluyente con un Detector UV).

La cromatografía en fase normal suele utilizar hidrocarburos (hexano, heptano, isooctano, ciclohexano) con la adición de pequeñas cantidades de cloroformo CHCl3, isopropanol iso-C3H7OH, éter diisopropílico; en cromatografía de fase inversa: una mezcla de agua con acetonitrilo CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida. Para aislar los componentes individuales de la mezcla, separados durante la cromatografía, a menudo se lavan (eluyen) secuencialmente. Para ello se utilizan disolventes con diferentes capacidades de desorción. Los disolventes están dispuestos en orden decreciente de capacidad de desorción en adsorbentes polares: serie eluotrópica Trappe... Si los componentes de la mezcla a separar tienen valores cercanos k "( relación de capacidad de la columna con respecto a un componente dado), luego cromatográfica con un eluyente. Si los componentes individuales de la mezcla son retenidos fuertemente por el sorbente, se usa una serie de eluyentes de fuerza creciente.

Gama de disolventes eluotrópicos

6. Equipo para cromatografía líquida

En la cromatografía líquida moderna, se utilizan dispositivos de diversos grados de complejidad, desde los sistemas más simples hasta los cromatógrafos de primera clase.
Un cromatógrafo de líquidos moderno incluye: recipientes para eluyentes, bombas de alta presión, un dispensador, una columna cromatográfica, un detector, un dispositivo de registro, un sistema de control y procesamiento matemático de resultados.

En la Fig. presenta un diagrama de bloques de un cromatógrafo de líquidos que contiene el conjunto mínimo requerido de componentes, de una forma u otra, presentes en cualquier sistema cromatográfico.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "ancho =" 361 "alto =" 254 src = ">

Arroz. Esquema de un cromatógrafo de líquidos: 1- depósito para la fase móvil, 2- bomba, 3- inyector, 4- columna, 5- termostato, 6- detectores, 7- sistema de registro, 8- computadora.

Tanque de almacenamiento para la fase móvil, debe tener suficiente capacidad de análisis y dispositivo de desgasificación de disolvente para excluir la formación de burbujas de gases disueltos en el eluyente en la columna y detector.

Bomba destinado a para crear un flujo constante de disolvente... Su diseño está determinado principalmente por la presión de funcionamiento en el sistema. Para el funcionamiento en el rango de 10-500 MPa, se utilizan bombas de tipo émbolo (jeringa). Su desventaja es la necesidad de paradas periódicas para llenar con eluyente. Para sistemas simples con presiones de funcionamiento bajas de 1-5 MPa, se utilizan bombas peristálticas económicas. Los eluyentes ingresan a la bomba a través de un filtro que retiene las partículas de polvo (más de 0,2 micrones). A veces, se pasa una pequeña corriente de helio a través de los eluyentes para eliminar el aire disuelto y evitar la formación de burbujas en el detector (especialmente en el caso de eluyentes acuosos y polares). En los cromatógrafos analíticos, se utilizan bombas de pistón con un sistema de retroalimentación para suministrar el eluyente a la columna, lo que permite suavizar la pulsación del flujo en un 1–2% y proporcionar velocidades volumétricas de 0,1 a 25 ml / min a presiones de hasta ~ 3,107 Pa. En la cromatografía en microcolumna, los caudales volumétricos del eluyente son mucho más bajos: 10-1000 μl / min. En el caso de la elución en gradiente, se utilizan varias bombas, que son controladas por un programador y suministran 2-3 componentes del eluyente a la cámara de mezcla, dejando constante el caudal total. Para inyectar una muestra en una columna a alta presión, sin detener el flujo, use grifos especiales de microdosificación conectados a un circuito de un volumen conocido para la muestra de solución bajo investigación. Se han desarrollado sistemas de dosificación con muestreo automático e inyección de muestra mediante válvulas microdosificadoras o jeringas.

Inyector proporciona inyección de muestra de mezcla componentes a separar en una columna con una reproducibilidad suficientemente alta. Los sistemas de muestreo de flujo de parada simples requieren una parada de la bomba y, por lo tanto, son menos convenientes que los dispensadores de bucle Reodyne.

Altavoces para HPLC suelen estar hechos de tubos de acero inoxidable pulido de 10 a 25 cm de longitud y de 3 a 5 mm de diámetro interior.

Arroz. Columnas de cromatografía para cromatografía líquida

También use columnas de vidrio colocado en una carcasa de metal; en cromatografía en microcolumna - columnas de metal impresas con un diámetro interior de 1,0-1,5 mm, microcolumnas de vidrio impresas con un diámetro de 70-150 micrones y columnas capilares huecas con un diámetro de 10-100 micrones; en cromatografía preparativa: columnas con un diámetro de 2 a 10 cm y más. Para un llenado uniforme y denso de columnas con sorbente, se utiliza un método de empaque en suspensión. La suspensión se prepara a partir de un sorbente y un líquido orgánico adecuado, que se suministra a la columna a una presión de hasta 5 x 107 Pa. Para determinar los componentes separados que salen de la columna. usar detectores. Constancia de temperatura previsto termostato.

Detectores para la cromatografía líquida tienen una celda de flujo en la que hay una medición continua de cualquier propiedad del eluyente que fluye. Deben ser muy sensibles. Para aumentar la sensibilidad del detector, a veces se usa la derivatización de los componentes de la mezcla después de la columna. Para ello, con el flujo de eluyente, se introducen reactivos que, al interactuar con las sustancias separadas, forman derivados con propiedades más pronunciadas, por ejemplo, absorben más fuertemente en la región UV o visible del espectro o tienen una mayor fluorescencia. capacidad. A veces, la derivatización se lleva a cabo antes del análisis cromatográfico y los derivados se separan en lugar de los materiales de partida. Tipos más populares detectores propósito general son refractómetros medición índice de refracción, y detectores espectrofotométricos definiendo densidad óptica del solvente a una longitud de onda fija (generalmente en la región ultravioleta). PARA ventajas de los refractómetros(y desventajas de los espectrofotómetros) debe atribuirse baja sensibilidad al tipo de conexiones, que puede contener o no grupos cromóforos. Por otro lado, el uso de refractómetros se limita a sistemas isocráticos (con una composición de eluyente constante), por lo que en este caso no es posible el uso de un gradiente de disolvente.

Diferencial "href =" / texto / categoría / differentcial / "rel =" bookmark "> amplificador y grabador diferencial. integrador, que le permite calcular las áreas relativas de los picos resultantes. Uso de sistemas cromatográficos complejos unidad de interfaz conectar el cromatógrafo con computadora personal, que lleva a cabo no solo la recopilación y procesamiento de información, sino que también controla el dispositivo, calcula las características cuantitativas y, en algunos casos, la composición cualitativa de las mezclas. Microprocesador proporciona inyección automática de muestra, cambio por un programa dado de composición de eluyentes con elución en gradiente, mantener temperatura de la columna.

Bruker ". Arroz. Cromatógrafo de líquidos Jasco

Preguntas de autoevaluación

¿Qué es la cromatografía líquida? Nombra sus tipos, áreas de aplicación. Lista sobre Las principales cantidades cromatográficas y su determinación ¿Qué tipos de cromatografía líquida existen en función del mecanismo de retención de las sustancias separadas por la fase estacionaria de LC? ¿Qué tipos de cromatografía existen según la forma en que se transporta la sustancia? ¿Qué sustancias se utilizan como adsorbentes? ¿Cuál es la diferencia? ¿Qué sirve como fase móvil líquida, un eluyente? Requisitos para disolventes. ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía de partición y la cromatografía de adsorción? Enumere las partes principales del circuito del cromatógrafo de líquidos, su propósito.

Lista de literatura usada

1 "Cromatografía líquida en medicina"

Http: // diario. issep. rssi. ru / articles / pdf / 0011_035.pdf

2 "Introducción a los métodos de cromatografía líquida de alta resolución"

Http: // www. chemnet. ru / rus / enseñanza / aceite / spezprakt-chr. html

3 "Cromatografía líquida"

Http: // e-ciencia. ru / index /? id = 1540

4 "Cromatografía"

Http: // belchem. narod. ru / chromatography1.html

En HPLC, los disolventes puros o sus mezclas se utilizan habitualmente como fases móviles.

Para crear una corriente de disolvente puro (o mezclas de disolventes), llamado eluyente en cromatografía líquida, se utilizan bombas en el sistema hidráulico del cromatógrafo.

resistencia mecánica insuficiente, que no permite el envasado y uso a presiones elevadas típicas de HPLC;

el gel de sílice, en comparación con el óxido de aluminio, tiene un rango más amplio de porosidad, área superficial y diámetro de poro; una actividad catalítica significativamente mayor del óxido de aluminio conduce a la distorsión de los resultados del análisis debido a la descomposición de los componentes de la muestra o su quimisorción irreversible.

Detectores de HPLC

Detectores:

Detector fluorescente. La gran popularidad de los detectores fluorescentes se debe a la muy alta selectividad y sensibilidad, y al hecho de que muchos contaminantes ambientales emiten fluorescencia (por ejemplo, hidrocarburos poliaromáticos).

Detector electroquímico se utilizan para detectar sustancias que se oxidan o reducen fácilmente: fenoles, mercaptanos, aminas, derivados nitro y halógenos aromáticos, aldehídos cetónicos, bencidinas.

Detectores El registro de la salida de la columna de un componente separado se realiza mediante un detector. Para el registro, puede utilizar un cambio en cualquier señal analítica proveniente de la fase móvil y asociada con la naturaleza y cantidad del componente de la mezcla. En cromatografía líquida se utilizan señales analíticas como absorción de luz o emisión de luz de la solución de salida (detectores fotométricos y fluorométricos), índice de refracción (detectores refractométricos), conductividad potencial y eléctrica (detectores electroquímicos), etc.

Introducción.

El rápido desarrollo de la cromatografía líquida en los últimos 10 años se debe principalmente al desarrollo intensivo de los fundamentos teóricos y el uso práctico de su versión altamente eficiente, así como a la creación y producción industrial de los sorbentes y equipos necesarios.

Una característica distintiva de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es el uso de sorbentes con un tamaño de grano de 3 a 10 micrones, que proporciona una transferencia de masa rápida con una eficiencia de separación muy alta.

En la actualidad, la HPLC se ha destacado en términos de tasas de desarrollo entre los métodos instrumentales, superando incluso a la cromatografía de gases. La ventaja más importante de la HPLC sobre la cromatografía de gases es la capacidad de estudiar casi cualquier objeto sin restricciones en sus propiedades fisicoquímicas, por ejemplo, en los puntos de ebullición o el peso molecular.

Hoy en día, la HPLC es un método instrumental bien definido que se utiliza ampliamente en varios campos de la ciencia y la tecnología. Es especialmente importante en áreas tan críticas como la bioquímica, la biología molecular, el control de la contaminación ambiental, así como en las industrias química, petroquímica, alimentaria y farmacéutica.

ya que es necesario tener en cuenta una serie de requisitos muy específicos debido a las siguientes características de la técnica.

una. Las columnas de HPLC están empaquetadas con medios con un diámetro de partícula muy pequeño. Como resultado, se genera alta presión en la columna a las velocidades volumétricas del solvente, que son necesarias para la rápida separación de la muestra.

B. Los detectores de HPLC son sensibles a las fluctuaciones en el flujo y la presión del eluyente (ruido). Además, cuando se utilizan detectores de concentración, se requiere una estabilidad aún mayor de la velocidad volumétrica del eluyente.

v. El proceso de separación cromatográfica va acompañado de una serie de efectos antagónicos, por ejemplo, la dispersión de la muestra en la fase móvil conduce a la mezcla de los componentes separados y reduce la concentración máxima de la sustancia en el pico eluido (en el detector). Se observa dispersión en todas las partes del sistema desde el punto de inyección hasta el detector.

d) Los disolventes que actúan como fase móvil suelen ser corrosivos para el equipo. Esto se aplica principalmente a los disolventes utilizados en la cromatografía de fase inversa, que se prefiere en las aplicaciones de HPLC bioquímica.

La especificidad de la HPLC como técnica instrumental debe tenerse en cuenta en el desarrollo, creación y operación de estos sistemas. Para crear muestras comerciales de sistemas cromatográficos y sus componentes, que sean lo suficientemente fiables, sencillos y seguros para trabajar con una relación aceptable entre precio y características técnicas, se necesitaron más de diez años de búsqueda e investigación. Las tendencias recientes hacia una disminución de las columnas (tanto en longitud como en diámetro) están obligando a nuevos requisitos para los instrumentos.

1.1. EFICIENCIAYSELECTIVIDAD

La cromatografía es un método para separar los componentes de una mezcla basado en la diferencia en su distribución de equilibrio entre dos "fases inmiscibles, una de las cuales es estacionaria y la otra es móvil. Los componentes de la muestra se mueven a lo largo de la columna cuando están en la fase móvil y permanecen en su lugar cuando están Cuanto mayor es la afinidad del componente por la fase estacionaria y menor por la fase móvil, más lento se mueve a lo largo de la columna y más tiempo permanece en ella. de la mezcla a la estacionaria y el período de tiempo aceptable de la mezcla en bandas separadas (picos) de los componentes a medida que se mueven a través de la columna con la fase móvil.

A partir de estos conceptos generales, queda claro que la separación cromatográfica solo es posible si los componentes de la muestra que ingresan a la columna durante la inyección de la muestra, en primer lugar, se disolverán en la fase móvil y, en segundo lugar, interactuarán (retendrán) con la fase estacionaria ... . Si durante la inyección de la muestra algunos componentes no están en forma de solución, serán filtrados y no participarán en el proceso cromatográfico. Asimismo, los componentes que no interactúen con la fase estacionaria pasarán por la columna con la fase móvil sin separarse en componentes.

Aceptemos la condición de que algunos dos componentes sean solubles en la fase móvil e interactúen con la fase estacionaria, es decir, el proceso crioatográfico puede desarrollarse sin perturbaciones. En este caso, después de pasar la mezcla por la columna, se pueden obtener cromatogramas de la forma a, b o v(figura 1.1). Estos cromatogramas ilustran separaciones cromatográficas que difieren en eficiencia. (a yb) con igual selectividad y selectividad (B y v) con igual eficiencia.

Cuanto más eficiente es la columna, más estrecho se obtiene el pico con el mismo tiempo de retención. La eficiencia de la columna se mide por el número de platos teóricos (PTT) norte: cuanto mayor sea el efecto

Arroz. 1.2. Parámetros del pico cromatográfico y cálculo del número de platos teóricos:

t R - el tiempo de retención del pico; h - altura del pico; Wj / j - ancho de pico a media altura

Arroz. 1.1. Tipo de cromatograma en función de la eficiencia y selectividad de la columna:

a- selectividad convencional, eficiencia reducida (menos platos teóricos); b - selectividad y eficiencia convencionales; v - eficiencia convencional, mayor selectividad (mayor proporción de tiempos de retención de los componentes)

eficiencia, cuanto mayor es el FTT, menor es la expansión del pico de la banda inicialmente estrecha a medida que pasa a través de la columna, más estrecho es el pico a la salida de la columna. PTT caracteriza el número de etapas para establecer el equilibrio entre las fases móvil y estacionaria.

Conocer el número de platos teóricos por columna y la longitud de la columna. L (μm), así como el diámetro medio de grano del sorbente d c (μm), es fácil obtener los valores de la altura equivalente al plato teórico (VETT), así como la altura reducida equivalente al plato teórico (PVETT):

HETT = L/ norte

PVETT = B3TT / d c.

Teniendo los valores de PTT, HETT y PVETT, se puede comparar fácilmente la eficiencia de columnas de diferentes tipos, diferentes longitudes, llenas de absorbentes de diferente naturaleza y tamaño de grano. Al comparar el CTT de dos columnas de la misma longitud, se compara el rendimiento. Al comparar HETT, se comparan columnas con absorbentes del mismo tamaño de grano y diferentes longitudes. Finalmente, el valor PVETT hace posible que dos columnas cualesquiera evalúen la calidad del sorbente, en primer lugar, y la calidad del llenado de las columnas, y en segundo lugar, independientemente de la longitud de las columnas, la granulación del sorbente por su naturaleza.

La selectividad de la columna juega un papel importante en el logro de la separación cromatográfica.

La selectividad de una columna depende de muchos factores, y la habilidad del experimentador está determinada en gran medida por la capacidad de influir en la selectividad de la separación. Para ello, el cromatógrafo tiene tres factores muy importantes: la elección de la naturaleza química del sorbente, la elección de la composición del disolvente y sus modificadores, y la consideración de la estructura química y propiedades de los componentes separados. A veces, un cambio en la temperatura de la columna tiene un efecto notable sobre la selectividad, que cambia los coeficientes de distribución de sustancias entre las fases móvil y estacionaria.

Al considerar la separación de dos componentes en un cromatograma y evaluarlo, la resolución es un parámetro importante. R s, que conecta los tiempos de salida y los anchos de pico de ambos componentes separados

La resolución, como parámetro que caracteriza la separación de picos, aumenta con un aumento de la selectividad, reflejado por un aumento del numerador, y un aumento de la eficiencia, reflejado en una disminución del denominador debido a una disminución del ancho de los picos. Por lo tanto, el rápido progreso de la cromatografía líquida llevó a un cambio en el concepto de "cromatografía líquida de alta presión": fue reemplazado por "cromatografía líquida de alta resolución" (mientras que la forma abreviada del término en inglés permaneció HPLC como el más correcto que caracteriza la dirección de desarrollo de la cromatografía líquida moderna).

Por lo tanto, se reduce la mancha en la columna y se aumenta la eficiencia cuando se usa un sorbente más fino, más uniforme en composición (fracción estrecha), empaquetada más densa y uniformemente en la columna, usando capas más delgadas de la fase injertada, solventes menos viscosos y flujo óptimo. tarifas.

Sin embargo, junto con el difuminado de la banda de la zona cromatográfica durante el proceso de separación en la columna, también se puede difuminar en el dispositivo de introducción de la muestra, en los capilares de conexión inyector - columna y columna - detector, en la celda detectora y en algunos dispositivos auxiliares (microfiltros para capturar partículas mecánicas de muestras instaladas después del inyector, columnas de protección, reactores de bobina, etc.) - Cuanto mayor sea el volumen extra de la columna en comparación con el volumen del pico de retención, mayor será la mancha. También importa dónde se encuentra el volumen muerto: cuanto más estrecha sea la llamada cromatográfica, mayor será el desenfoque que dará el volumen muerto. Por lo tanto, se debe prestar especial atención al diseño de la parte del cromatógrafo donde la zona cromatográfica es más estrecha (inyector y dispositivos desde el inyector hasta la columna); aquí, la erosión extracolumna es la más peligrosa y tiene el efecto más fuerte. Si bien se cree que en cromatógrafos bien diseñados se deben minimizar las fuentes de dilución adicional extracolumna, sin embargo, cada nuevo dispositivo, cada alteración del cromatógrafo debe necesariamente terminar con la prueba en la columna y la comparación del cromatograma obtenido con el pasaporte. Si se observa una distorsión máxima, una fuerte disminución en la eficiencia, los capilares recién introducidos y otros dispositivos deben inspeccionarse cuidadosamente.

El lavado fuera de la columna y los errores de cálculo pueden conducir a una pérdida significativa (más del 50%) de eficiencia, especialmente en los casos en los que se intenta utilizar cromatógrafos a largo plazo para HPLC de alta velocidad, HPLC en microcolumna y otras opciones modernas de HPLC que requieren microinyectores. , capilares de interconexión con diámetro interno 0.05-0.15 mm de longitud mínima, columnas con una capacidad de 10-1000 μl, detectores con microcubetas con una capacidad de 0.03-1 μl y con registradores e integradores de alta velocidad.

1.2. RETENCIÓN Y RESISTENCIA DEL DISOLVENTE

Para que los analitos se separen en la columna, como se mencionó anteriormente, el factor de capacidad k" debe ser mayor que 0, es decir, las sustancias deben ser retenidas por la fase estacionaria, el sorbente. Sin embargo, el factor de capacitancia no debe ser demasiado alto para obtener un tiempo de elución aceptable. Si se elige una fase estacionaria para una determinada mezcla de sustancias, que las retiene, entonces el trabajo adicional en el desarrollo de un método analítico consiste en elegir un solvente que proporcione, en el caso ideal, diferente para todos los componentes, pero aceptablemente no muy grande k". Esto se logra cambiando la fuerza de elución del solvente.

En el caso de la cromatografía de adsorción en gel de sílice o alúmina, por regla general, la concentración del disolvente de dos componentes (por ejemplo, hexano con la adición de isopropanol) aumenta aumentando el contenido del componente polar (isopropanol), o disminuyó al disminuir el contenido de isopropanol. Si el componente polar que lo contiene se vuelve demasiado pequeño (menos del 0,1%), debe reemplazarse por uno más débil en la fuerza de elución. Se hace lo mismo, reemplazando el componente polar o apolar por otros, y en el caso de que el sistema dado no proporcione la selectividad deseada con respecto a los componentes de la mezcla de interés. A la hora de seleccionar los sistemas de disolventes se tiene en cuenta tanto la solubilidad de los componentes de la mezcla como la serie eluotrópica de disolventes recopilada por diferentes autores.

Aproximadamente de la misma manera, la concentración del disolvente se selecciona en el caso de utilizar fases polares injertadas (nitrilo, amino, diol, nitro, etc.), teniendo en cuenta las posibles reacciones químicas y excluyendo los disolventes peligrosos para la fase (por ejemplo , cetonas para la fase amino).

En el caso de la cromatografía de fase inversa, la concentración del disolvente aumenta aumentando el contenido del componente orgánico (metanol, acetonitrilo o THF) en el eluyente y se reduce añadiendo más agua. Si no es posible lograr la selectividad deseada, utilice un componente orgánico diferente o intente cambiarlo utilizando diferentes aditivos (ácidos, reactivos de par iónico, etc.).

En las separaciones por cromatografía de intercambio iónico, la concentración del disolvente se cambia aumentando o disminuyendo la concentración de la solución tampón o cambiando el pH; en algunos casos, se utiliza la modificación con sustancias orgánicas.

Sin embargo, especialmente en el caso de mezclas complejas naturales y biológicas, a menudo no es posible seleccionar la concentración del disolvente de tal manera que todos los componentes de la muestra se eluyan en un tiempo razonable. Entonces es necesario recurrir a la elución en gradiente, es decir, utilizar un disolvente, cuya fuerza de elución cambia durante el análisis para que aumente constantemente de acuerdo con un programa predeterminado. Esta técnica permite lograr la elución de todos los componentes de mezclas complejas en un período de tiempo relativamente corto y su separación en componentes en forma de picos estrechos.

1.3. TAMAÑO DE LAS PARTÍCULAS SORBENTES, PERMEABILIDAD Y EFICIENCIA

Al considerar la extensión de la columna, indicamos que la eficiencia de la columna (HETP) depende del tamaño de partícula del sorbente. En gran medida, el rápido desarrollo de la HPLC durante los últimos 10-12 años se debió, en primer lugar, al desarrollo de métodos para obtener sorbentes con un tamaño de partícula de 3 a 10 μm y con una composición fraccional estrecha, proporcionando alta eficiencia con buena permeabilidad y, en segundo lugar, mediante el desarrollo de métodos de llenado de columnas con estos sorbentes; y, en tercer lugar, el desarrollo y producción en serie de cromatógrafos de líquidos con bombas de alta presión, inyectores y detectores con cubetas de pequeño volumen capaces de registrar pequeños picos de volumen.

Para columnas de lechada bien empaquetadas, la altura equivalente del plato teórico (PVETT) puede ser 2 independientemente de si se utilizan partículas de 3, 5, 10 o 20 µm para el empaquetamiento. En este caso, obtendremos, respectivamente, columnas (con una longitud estándar de 250 mm) con una eficiencia de 41670, 25000, 12500 y 6250 tt. Parece natural elegir la columna más eficiente empaquetada con partículas de 3 µm. Sin embargo, esta eficiencia se obtendrá a expensas de presiones muy altas y velocidades de separación relativamente bajas, ya que es probable que una bomba existente pueda bombear disolvente a través de dicha columna a una alta velocidad espacial. Aquí simplemente nos enfrentamos a la cuestión de la relación entre el tamaño de las partículas absorbentes, la eficiencia y la permeabilidad de las columnas.

Si expresamos a partir de esto el factor de resistencia de la columna, una cantidad adimensional, obtenemos la siguiente ecuación:

El factor de resistencia para columnas empaquetadas con micropartículas del mismo tipo utilizando el mismo método cambia de manera insignificante y asciende a los siguientes valores:

Tipo de partícula ".... Esférico irregular

formulario formulario

Envasado seco. ... ... ... ... 1000-2000 800-1200

Embalaje de suspensión. ... ... 700-1500 500-700

La presión de entrada de la columna es proporcional al caudal lineal, el factor de resistencia de la columna, la viscosidad del disolvente y la longitud de la columna, y es inversamente proporcional al cuadrado del diámetro de las partículas.

Aplicando esta dependencia para las columnas anteriores con partículas con un diámetro de 3, 5, 10 y 20 μm y asumiendo una tasa de flujo lineal constante, factor de resistencia de la columna y viscosidad del solvente, obtenemos para columnas de igual longitud la relación de presión de entrada 44:16: 4: 1. Por lo tanto, si se trata de un sorbente de fase inversa con un tamaño de partícula de 10 micrones cuando se utilizan sistemas de disolventes metanol -. agua (70:30), generalmente en una columna estándar a un caudal de disolvente de 1 ml / min, la presión en la entrada de la columna es de 5 MPa, luego para partículas de 5 μm - 20 MPa y para partículas de 3 μm - 55 MPa . Cuando se utiliza gel de sílice y un sistema disolvente menos viscoso hexano-isopropanol (100: 2), los valores serán significativamente más bajos: 1, 4 y 11 MPa, respectivamente. Si, en el caso de un sorbente de fase inversa, el uso de partículas con un tamaño de 3 μm es muy problemático, y 5 μm es posible, pero no en todos los dispositivos, entonces para un sorbente de fase normal no hay problemas con presión. Cabe señalar que la HPLC de alta velocidad moderna se caracteriza por el uso de un mayor consumo de disolventes que en el ejemplo anterior, por lo tanto, los requisitos de presión aumentan aún más.

Sin embargo, en los casos en los que la separación requiere un cierto número de platos teóricos y es deseable realizar un análisis de alta velocidad, la imagen cambia algo. Dado que las longitudes de las columnas con absorbentes con un tamaño de grano de 3, 5, 10 micrones con igual eficiencia serán respectivamente de 7,5; 12,5 y 25 cm, entonces la relación de presión en la entrada a las columnas cambiará a 3: 2: 1. En consecuencia, la duración del análisis en tales columnas de igual eficiencia se correlacionará como 0.3: 0.5: 1, es decir, cuando se pasa de 10 a 5 y 3 μm, la duración del análisis se reducirá en 2 y 3.3 veces. Esta aceleración del análisis tiene el costo de una presión de entrada de columna proporcionalmente más alta.

Los datos presentados son válidos para aquellos casos en los que sorbentes de diferente tamaño de grano tienen las mismas curvas de distribución de tamaño de partícula, las columnas están empaquetadas de la misma manera y tienen el mismo factor de resistencia de columna. Debe tenerse en cuenta que la dificultad de obtener fracciones estrechas del sorbente aumenta con la disminución del tamaño de partícula y eso. las fracciones de diferentes fabricantes tienen una composición fraccionaria diferente. Por lo tanto, el factor de resistencia de la columna variará según el tamaño de grano, el tipo de sorbente, el método de empaque de la columna, etc.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE HPLC POR MECANISMO DE SEPARACIÓN

La mayoría de las separaciones realizadas por el método HPLC se basan en un mecanismo mixto de interacción de sustancias con un sorbente, lo que proporciona una mayor o menor retención de componentes en la columna. Los mecanismos de separación en forma más o menos pura son bastante raros en la práctica, por ejemplo, los mecanismos de adsorción cuando se usa gel de sílice absolutamente anhidro y hexano anhidro para separar hidrocarburos aromáticos.

Con un mecanismo de retención mixto para sustancias de diferentes estructuras y pesos moleculares, es posible estimar la contribución a la retención de adsorción, distribución, exclusión y otros mecanismos. Sin embargo, para una mejor comprensión y comprensión de los mecanismos de separación en HPLC, es aconsejable considerar las separaciones con predominio de uno u otro mecanismo como pertenecientes a un determinado tipo de cromatografía, por ejemplo, a la cromatografía de intercambio iónico.

2.1.1 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

La separación por cromatografía de adsorción se realiza como resultado de la interacción de una sustancia con adsorbentes, como el gel de sílice o la alúmina, que tienen centros activos en la superficie. La diferencia en la capacidad de interactuar con los centros de adsorción de diferentes moléculas de muestra conduce a su división en zonas durante el movimiento con la fase móvil a lo largo de la columna. La separación de las zonas de los componentes conseguida en este caso depende de la interacción tanto con el disolvente como con el adsorbente.

La sorción en la superficie de un adsorbente con grupos hidroxilo se basa en una interacción específica entre la superficie polar del adsorbente y los grupos o regiones de moléculas polares (o polarizables). Estas interacciones incluyen la interacción dipolo-dipolo entre dipolos permanentes o inducidos, la formación de un enlace de hidrógeno hasta la formación de n-complejos o complejos de transferencia de carga. Un trabajo posible y bastante frecuente en la práctica es la manifestación de quimioabsorción, que puede conducir a un aumento significativo en el tiempo de retención, una fuerte disminución de la eficiencia, la aparición de productos de descomposición o la absorción irreversible de la sustancia.

Las isotermas de adsorción de sustancias tienen una forma lineal, convexa o cóncava. Con una isoterma de adsorción lineal, el pico de la sustancia es simétrico y el tiempo de retención no depende del tamaño de la muestra. Muy a menudo, las isotermas de adsorción de sustancias no son lineales y tienen una forma convexa, lo que conduce a cierta asimetría del pico con la formación de una cola.

Los adsorbentes de gel de sílice con diferentes volúmenes de poros, superficies y diámetros de poros son los más utilizados en HPLC. La alúmina se utiliza con mucha menos frecuencia y, muy raramente, otros adsorbentes ampliamente utilizados en la cromatografía clásica en columna y en capa fina. La razón principal de esto es la resistencia mecánica insuficiente de la mayoría de los demás adsorbentes, lo que no les permite ser empaquetados y utilizados a presiones elevadas típicas de los productos químicos de alta presión.

Los grupos polares responsables de la adsorción y ubicados en la superficie del gel de sílice y el óxido de aluminio tienen propiedades similares. Por tanto, el orden de elución de las mezclas de sustancias y la gama eluotrópica de los disolventes suelen ser los mismos para ellos. Sin embargo, la diferencia en la estructura química del gel de sílice y la alúmina a veces conduce a la aparición de diferencias en la selectividad, en este caso se da preferencia a uno u otro adsorbente, que es más adecuado para una determinada tarea específica. Por ejemplo, la alúmina proporciona una mayor selectividad en la separación de ciertos hidrocarburos aromáticos polinucleares.

La preferencia que se suele dar al gel de sílice sobre la alúmina se explica por una selección más amplia de geles de sílice en términos de porosidad, superficie y diámetro de poro, así como una actividad catalítica significativamente mayor de la alúmina, que a menudo conduce a la distorsión de los resultados del análisis debido a la descomposición de los componentes de la muestra o su quimisorción irreversible. ...

2.1.2 Desventajas de la cromatografía de adsorción que limitan su uso

La popularidad de la cromatografía de adsorción disminuyó gradualmente con el desarrollo del método HPLC, fue reemplazado cada vez más y continúa siendo reemplazado por otras opciones, como HPLC en fase reversa y en fase normal en sorbentes con fase injertada. ¿Cuáles son las desventajas de la cromatografía de adsorción que llevaron a esto?

En primer lugar, esta es la larga duración de los procesos de equilibrado de adsorbentes con disolventes que contienen agua en cantidades traza, la dificultad de preparar dichos disolventes con un contenido de humedad determinado y reproducible. Esto da como resultado una mala reproducibilidad de los parámetros de retención, resolución y selectividad. Por la misma razón, es imposible usar la elución de gradiente: el retorno al estado inicial es tan largo que supera significativamente la ganancia en el tiempo debido al uso de un gradiente.

Las desventajas significativas de los adsorbentes, especialmente el óxido de aluminio, asociadas con las frecuentes transposiciones de compuestos sensibles a la catálisis, su descomposición, sorción irreversible, también son bien conocidas y se han señalado repetidamente en la bibliografía. Las sustancias absorbidas irreversiblemente, que se acumulan en la sección inicial de la columna, cambian la naturaleza del absorbente, pueden conducir a un aumento en la resistencia de la columna o incluso a su taponamiento completo. El último inconveniente se puede eliminar mediante el uso de una columna de protección, que sobre- A medida que aumenta la resistencia y se produce la obstrucción, se reemplaza por uno nuevo * o se vuelve a llenar con un nuevo sorbente. Sin embargo, la sorción irreversible, que también se produce en este caso, conduce a un cromatograma en el que los componentes de la muestra sensibles a la sorción o la descomposición catalítica están total o parcialmente ausentes.

2.2. CROMATOGRAFÍA DE DISTRIBUCIÓN

La cromatografía de partición es una variante de HPLC, en la que la separación de una mezcla en componentes se lleva a cabo debido a la diferencia en sus coeficientes de distribución entre dos fases inmiscibles: un solvente (fase móvil) y una fase sobre un sorbente (fase estacionaria). Históricamente, los primeros fueron sorbentes de este tipo, que se obtenían por deposición de fases líquidas (oxidipropionitrilo, aceite de parafina, etc.) sobre portadores porosos, de forma similar a como se preparaban y preparaban los sorbentes para cromatografía gas-líquido (GLC). Sin embargo, los inconvenientes de tales sorbentes se descubrieron inmediatamente, el principal de los cuales era el lavado relativamente rápido de la fase del vehículo. Debido a esto, la cantidad de fase en la columna disminuyó gradualmente, los tiempos de retención también disminuyeron y los centros de adsorción no cubiertos por la fase aparecieron en la sección inicial de la columna, lo que provocó la formación de colas de picos. Este inconveniente se combatió saturando el disolvente con la fase depositada incluso antes de que entrara en la columna. El arrastre también disminuyó cuando se usaron fases poliméricas más viscosas y menos solubles, sin embargo, en este caso, debido a la difusión de películas poliméricas gruesas, la eficiencia de las columnas se redujo notablemente.

Resultó lógico injertar la fase líquida al portador mediante enlaces químicos de tal manera que su arrastre se vuelva físicamente imposible, es decir, para transformar el portador y la fase en un todo, en la llamada fase de injerto. sorbente

En el futuro, los esfuerzos de los investigadores se dirigieron a la búsqueda de reactivos, cuyo injerto se realizaría de manera bastante rápida y completa, y los enlaces formados eran lo más estables posible. Los alquilclorosilanos y sus derivados se convirtieron en tales reactivos, que permitieron obtener sorbentes en fase de injerto de diferentes tipos y con diferentes grupos tanto polares como apolares en la superficie utilizando una tecnología similar.

El uso exitoso de este último tipo de sorbentes para HPLC promovió el crecimiento de su producción por parte de una variedad de fabricantes. Cada empresa producía tales sorbentes, por regla general, sobre la base de su propio tipo de gel de sílice y de acuerdo con su propia tecnología, que generalmente constituye el "know-how" de producción. Como resultado, un gran número de sorbentes que se denominan químicamente exactamente igual (por ejemplo, gel de sílice con octadecilsilano injertado) tienen características cromatográficas muy diferentes. Esto se debe al hecho de que el gel de sílice puede tener poros más anchos o más estrechos, diferente superficie, porosidad, su superficie antes del injerto puede ser hidroxilada o no, pueden injertarse mono, diclorosilanos o triclorosilanos, las condiciones de injerto pueden dar lugar a monómeros, polímeros o capa de fase mixta, se utilizan diferentes métodos para eliminar los reactivos residuales, se puede utilizar o no la desactivación adicional de silanol y otros grupos activos.

La complejidad de la tecnología de los reactivos de injerto y la preparación de materias primas y materiales, su naturaleza multietapa lleva al hecho de que incluso los lotes de sorbentes obtenidos con la misma tecnología de la misma empresa de fabricación pueden tener características cromatográficas ligeramente diferentes. Esto es especialmente cierto cuando dichos sorbentes se utilizan para el análisis de mezclas multicomponente que contienen sustancias que difieren notablemente en el número y la posición de los grupos funcionales, en términos de funcionalidad.

Teniendo en cuenta lo anterior, siempre debe esforzarse por * que cuando utilice el método de análisis descrito en la literatura, utilice exactamente el mismo sorbente y las mismas condiciones de funcionamiento. En este caso, la probabilidad de que la obra no pueda reproducirse es mínima. Si esto no es posible, pero se toma un sorbente de otra empresa con una fase de injerto similar, debe estar preparado para el hecho de que llevará mucho tiempo modificar la técnica. Al mismo tiempo, existe la posibilidad (y debe tenerse en cuenta) de que no se logre la separación requerida en este sorbente incluso después del desarrollo a largo plazo. La presencia en la literatura de muchas técnicas de separación descritas en absorbentes antiguos producidos durante mucho tiempo estimula su producción y uso posteriores por esta razón. Sin embargo, en aquellos casos en los que sea necesario pasar al desarrollo de métodos originales, especialmente en relación con sustancias propensas a la descomposición, quimisorción, reordenamientos, es aconsejable comenzar a trabajar en sorbentes que hayan sido recientemente desarrollados y producidos utilizando nuevos, opciones tecnológicas mejoradas. Los nuevos sorbentes tienen una composición fraccionada más uniforme, una cobertura más uniforme y completa de la superficie con la fase injertada y etapas finales más perfectas de procesamiento del sorbente.

2.3. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO DE IONES

En la cromatografía de intercambio iónico, la separación de los componentes de la mezcla se logra debido a la interacción reversible de sustancias ionizables con los grupos iónicos del sorbente. La retención de la electroneutralidad del sorbente está asegurada por la presencia de contraiones capaces de intercambio iónico, ubicados en las inmediaciones de la superficie. El ión de la muestra introducida, interactuando con una carga fija del sorbente, se intercambia con un contraión. Las sustancias con diferente afinidad por las cargas fijas se separan en anionitos o cationitos. Los anionitos tienen grupos cargados positivamente en la superficie y los aniones sorb de la fase móvil. Los cationitos, respectivamente, contienen grupos con carga negativa que interactúan con los cationes.

Como fase móvil se utilizan soluciones acuosas de sales de ácidos, bases y disolventes como el amoniaco líquido, es decir, sistemas disolventes con una constante dieléctrica elevada e y una gran tendencia a ionizar compuestos. Suelen trabajar con soluciones tampón que Permitir ajustar el valor de pH.

En la separación cromatográfica, los iones del analito compiten con los iones contenidos en el eluyente, esforzándose por interactuar con los grupos cargados opuestamente del sorbente. De ello se deduce que la cromatografía de intercambio iónico se puede utilizar para separar cualquier compuesto que pueda ionizarse de cualquier forma. Es posible analizar incluso moléculas de azúcar neutras en forma de sus complejos con un ion borato:

Azúcar + VO 3 2 - = Azúcar -VO 3 2 -.

La cromatografía de intercambio iónico es indispensable para la separación de sustancias altamente polares, que no pueden ser analizadas por GLC sin conversión en derivados. Dichos compuestos incluyen aminoácidos, péptidos, azúcares.

La cromatografía de intercambio iónico se usa ampliamente en medicina, biología, bioquímica, para el control ambiental, en el análisis del contenido de medicamentos y sus metabolitos en sangre y orina, pesticidas en materias primas alimentarias, así como para la separación de compuestos inorgánicos, incluidos radioisótopos, lantánidos, actínidos, etc. El análisis de biopolímeros (proteínas, ácidos nucleicos, etc.), que suele tardar horas o días, mediante cromatografía de intercambio iónico se realiza en 20-40 minutos con mejor separación. El uso de la cromatografía de intercambio iónico en biología ha permitido observar muestras directamente en medios biológicos, reduciendo la posibilidad de reordenamiento o isomerización, lo que puede llevar a una mala interpretación del resultado final. Es interesante utilizar este método para controlar los cambios en los fluidos biológicos. El uso de intercambiadores de aniones débiles porosos a base de gel de sílice permitió separar los péptidos. V

El mecanismo de intercambio iónico se puede representar en forma de las siguientes ecuaciones:

para intercambio de aniones

X- + R + Y- h ->■ Y- + R + X-.

para el intercambio catiónico |

X + + R-Y + h = * Y ++ R-X +.

En el primer caso, el ion de la muestra X ~ compite con el ion de la fase móvil Y ~ por los centros iónicos R + del intercambiador de iones, y en el segundo, los cationes de la muestra X + entran en competencia con el iones de la fase móvil Y + para los centros iónicos de R ~.

Naturalmente, los iones de la muestra, que interactúan débilmente con el intercambiador de iones, con esta competencia serán retenidos débilmente en la columna y son los primeros en ser eliminados de ella, y, a la inversa, los iones más fuertemente retenidos serán los últimos en desaparecer. eluir de la columna. Por lo general, las interacciones BTqpH4Hbie de naturaleza no iónica surgen debido a la adsorción o los enlaces de hidrógeno de la muestra con la parte no iónica de la matriz o debido a la solubilidad limitada de la muestra en la fase móvil. Es difícil aislar la cromatografía de intercambio iónico "clásica" en una forma "pura" y, por lo tanto, algunos cromatógrafos parten de principios empíricos más que teóricos en la cromatografía de intercambio iónico.

La separación de sustancias específicas depende principalmente de la elección del sorbente y la fase móvil más adecuados. Como fases estacionarias en la cromatografía de intercambio iónico, se utilizan resinas de intercambio iónico y geles de sílice con grupos ionógenos injertados.

2.4. CROMATOGRAFÍA EXCLUSIVA

La cromatografía de exclusión es una opción. Cromatografía líquida, en la que la separación se produce debido a la distribución de moléculas entre el disolvente dentro de los poros del sorbente y el disolvente que fluye. " entre sus partículas.

A diferencia de otras opciones de HPLC, donde la separación va Debido a las diferentes interacciones de los componentes con la superficie del sorbente, el papel del relleno sólido en la cromatografía de exclusión por tamaño es solo en la formación de poros de cierto tamaño, y la fase estacionaria es el solvente que llena estos poros. Por tanto, la aplicación del término "sorbente" a estas cargas es hasta cierto punto arbitraria.

Una característica fundamental del método es la capacidad de separar moléculas por su tamaño en solución en el rango de prácticamente cualquier peso molecular, de 10 2 a 10 8, lo que lo hace indispensable para el estudio de biopolímeros sintéticos y.

Tradicionalmente, el proceso que se lleva a cabo en disolventes orgánicos todavía se denomina cromatografía de permeación en gel y, en sistemas acuosos, cromatografía de filtración en gel. En este libro, se adopta un solo término para ambas opciones, que proviene del inglés "Size Exclusion", una excepción por tamaño, y refleja en su mayor parte el mecanismo del proceso.

En las monografías se lleva a cabo un análisis detallado de las ideas existentes sobre una teoría muy compleja del proceso de cromatografía de exclusión por tamaño.

Volumen total de disolvente en la columna Vermont (esto a menudo se conoce como el volumen total de la columna porque Enfermedad venérea no participa en el proceso cromatográfico) es la suma de los volúmenes de las fases móvil y estacionaria.

La retención de moléculas en la columna de exclusión está determinada por la probabilidad de su difusión en los poros y depende de la proporción de tamaños de moléculas y poros, que se muestra esquemáticamente en la Fig. 2.15. Coeficiente de distribución Ka, como en otras variantes de cromatografía, es la relación de las concentraciones de una sustancia en las fases estacionaria y móvil.

Dado que las fases móvil y estacionaria tienen la misma composición, entonces Kd una sustancia para la que ambas fases son igualmente accesibles es igual a una. Esta situación se da para las moléculas de C más pequeñas (incluidas las moléculas de disolvente), que penetran en todos los poros (véase la figura 2.15) y, por lo tanto, se mueven más lentamente a través de la columna. Su volumen de retención es igual al volumen total del solvente. Vermont-

Arroz. 2.15. Modelo para la separación de moléculas por medida en cromatografía de exclusión por tamaño

Todas las moléculas, cuyo tamaño es mayor que el tamaño de los poros del sorbente, no pueden entrar en ellas (exclusión completa) y pasar a través de los canales entre las partículas. Eluyen de la columna con el mismo volumen de retención igual al volumen de la fase móvil V 0 - El coeficiente de reparto para estas moléculas es cero.

Las moléculas de tamaño intermedio, capaces de penetrar sólo una parte de los poros, se retienen en la columna de acuerdo con su tamaño. El coeficiente de distribución de estas moléculas varía de cero a uno y caracteriza la fracción de volumen de poro disponible para moléculas de un tamaño dado, su volumen de retención está determinado por la suma de Y aproximadamente y la porción disponible del volumen de poro.

ANALISIS CUALITATIVO

Un cromatógrafo que se inicie en la cromatografía líquida de alta resolución debe estar familiarizado con los conceptos básicos del análisis cualitativo. El análisis cualitativo se utiliza para identificar un producto conocido obtenido de una manera nueva o en una mezcla con otros productos. "Es necesario para el aislamiento de varios componentes de mezclas biológicas y químicas complejas, lo cual es especialmente importante en medicina, ciencia forense, ecología , para controlar la ubicación de algunos productos químicos medicinales y sus metabolitos en biomateriales .. „. La familiaridad con los conceptos básicos del análisis cualitativo ayudará a evitar errores típicos, por ejemplo / para distinguir las impurezas en una muestra de las impurezas en un solvente o para comprobar la pureza de una sustancia en más de un espectrofotómetro de longitud de onda, y en diferentes, etc.

Antes de continuar con el análisis, es necesario establecer si toda la muestra es eluida de la columna por este sistema de solventes o no. Para estar seguro de una elución completa, es necesario recolectar todo el líquido que fluye de la columna, evaporar el solvente, pesar el residuo y encontrar el grado de recuperación de la muestra.

La identificación de componentes en HPLC se puede realizar de tres formas: 1) utilizar información de retención; 2) examinar las zonas obtenidas durante la separación en una columna de cromatógrafo de líquidos utilizando métodos de análisis espectral o químico; 3) conecte directamente el analizador de espectro a la columna.

El volumen de retención se usa para registrar picos en cromatografía. V R o tiempo de retención t R. Ambas cantidades son características de una sustancia en un sistema cromatográfico dado. Dado que el tiempo de retención de la sustancia a separar consiste en el tiempo de interacción en la columna y el tiempo de tránsito de las secciones vacías del tubo, varía de un dispositivo a otro. Es conveniente disponer de una sustancia que no sea retenida por una determinada columna, tomándola como patrón, cuyo tiempo de retención y volumen t 0 , V o. La cromatografía de la sustancia y el patrón debe realizarse en las mismas condiciones (presión y caudal). Cuando se identifican mediante datos de retención, las sustancias individuales conocidas que pueden estar presentes en las muestras se separan en el mismo sistema cromatográfico y se obtienen valores para ellas. t R. Comparando estos valores t R con el tiempo de retención del pico desconocido, uno puede encontrar que coinciden, y entonces es probable que los picos correspondan a la misma sustancia, o t R sustancia conocida no coincide t R zona desconocida. Entonces todavía es posible una estimación aproximada de los valores t R sustancias que no están disponibles para la medición directa del grado de retención. Consideremos ambas opciones.

En el primer caso, obviamente es necesario un estudio preliminar de la muestra para postular la presencia de sustancias específicas en ella. Cuando se trabaja con mezclas simples, es fácil determinar si el grado de retención de las zonas de muestra y las sustancias conocidas coincide o no, es decir, los valores t B son iguales o diferentes. En el caso de mezclas complejas, varias sustancias a la vez pueden eluir con valores similares. t R, y las zonas realmente obtenidas por separación cromatográfica se superponen. Como resultado, obtener valores precisos t R para diferentes zonas se vuelve imposible. La confiabilidad de la identificación aumenta con un aumento en la resolución, un control más cuidadoso de las condiciones de separación y medición múltiple de valores. t R y promediando los valores encontrados. En este caso, debe alternarse la separación cromatográfica de sustancias conocidas y desconocidas. Al separar mezclas complejas, el valor t R Las sustancias pueden cambiar bajo la influencia de la matriz de la propia muestra. Este efecto es posible al comienzo del cromatograma y con picos superpuestos; también es posible ajustar las zonas, que ya se ha mencionado.

En tales casos, agregue el estándar a la muestra en una proporción de 1: 1. Si las sustancias son idénticas, el valor t R el material de partida no cambia y solo se obtiene un pico en el cromatograma. Si hay un instrumento con un sistema de cromatografía cíclica, entonces, para la confiabilidad de la identificación, es deseable pasar la mezcla a través de la columna varias veces.

La información de retención también se puede encontrar en la literatura, pero el valor de esta información es limitado. Dado que las columnas de un solo lote dan poca reproducibilidad, los valores literarios no siempre corresponden al valor real. t R en esta columna. Para la cromatografía de adsorción, sin embargo, es posible predecir t R basado en datos de la literatura. Otra dificultad asociada con el uso de significados literarios t R, - la complejidad de su búsqueda en la literatura especializada, aunque las revisiones bibliográficas publicadas en el Jornal de cromatografía tienen un índice actualizado de los tipos de sustancias.

En el segundo caso, cuando los tiempos de retención de los compuestos conocidos y las zonas de muestra no coinciden, es posible predecir el tiempo de retención del componente desconocido. Las predicciones de retención relativa son bastante fiables según los datos de estructura de la cromatografía de exclusión espacial. Son menos precisos en cromatografía de adsorción, distribución y especialmente cuando se trabaja en una fase unida químicamente. Para cromatografía iónica y de pares iónicos de sustancias con p conocido Ka solo son posibles valores aproximados tR. Siempre es más fácil predecir la retención relativa o el valor * x que los valores absolutos k". Valores relativos t R más fácil de evaluar para compuestos relacionados o derivados tales como ácidos alquilcarboxílicos sustituidos o derivados de benceno.

Con la separación isocrática de homólogos u oligómeros, a veces se observa el siguiente patrón:

\ G k" = A + Bn,

dónde A y V- constantes para varias muestras seleccionadas y para un sistema cromatográfico dado (en la misma columna, con las mismas fases móvil y estacionaria); NS- el número de unidades estructurales idénticas en la molécula de muestra.

La introducción del grupo funcional / en la molécula de muestra conducirá a un cambio. k" en la primera ecuación por algún coeficiente constante a / en un sistema cromatográfico dado. Es posible obtener constantes de grupo a / para varios grupos sustituyentes /, cuyos valores aumentarán al aumentar la polaridad de los grupos funcionales en todos los tipos de cromatografía, excepto en la cromatografía de fase inversa, donde los valores de las constantes disminuirá al aumentar la polaridad.

Algunas constantes de grupo a / para varios grupos sustituyentes / se dan en la tabla. 9.1.

En cromatografía de adsorción, la primera ecuación no siempre es aplicable, ya que es válida siempre que todos los isómeros tengan el mismo significado. k", que no siempre se observa. Sin embargo, es posible graficar la dependencia lgfe de "los mismos compuestos en una columna frente al lgfe" de los mismos compuestos, pero en una columna diferente o frente a las características correspondientes en cromatografía en capa fina, por ejemplo, lg [(l - Rf) IRf].

Al comparar los datos sobre retención de sustancias, se pueden utilizar los valores del factor de capacidad. k", ya que en él, a diferencia de t R la velocidad de la fase móvil y las características geométricas de la columna no se ven afectadas.

La separación en una fase unida químicamente es similar a la separación por cromatografía de partición con fases similares y, por lo tanto, los datos de extracción en equilibrio pueden usarse para predecir los tiempos de retención.

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención está influenciada por tres factores: el grado de ionización de ácidos y bases, la carga de la molécula ionizada y la capacidad de una sustancia de la fase móvil acuosa utilizada en la cromatografía de intercambio iónico para migrar a la fase orgánica. . Este último depende del peso molecular del compuesto y su hidrofobicidad. Por lo tanto, los ácidos o bases más fuertes se retienen con más fuerza en la separación de intercambio aniónico o catiónico. Al disminuir pK a de un ácido individual incluido en la muestra, la retención aumenta con la separación de varios ácidos debido al intercambio aniónico, y con un aumento en p / C o, la retención de bases aumenta durante su separación debido al intercambio catiónico.

Así, la coincidencia de los tiempos de retención de la sustancia conocida con la observada permite asumir su identidad. La fiabilidad de la identificación aumenta si se comparan los cromatogramas de una sustancia conocida y un componente desconocido en diferentes condiciones. Si las sustancias en adsorción y fase inversa o intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño se comportan de la misma manera, aumenta la fiabilidad de la identificación. Si la confiabilidad de la identificación con igual retención relativa es del 90%, entonces cuando se estudia el comportamiento de las mismas sustancias en condiciones significativamente diferentes, la confiabilidad de la identificación ya es del 99%.

Una característica valiosa de una sustancia utilizada en la identificación es la proporción de señales obtenidas para una sustancia determinada en dos detectores diferentes. El analito después de salir de la columna pasa primero por el primer detector, luego por el segundo, y las señales provenientes de los detectores se registran simultáneamente usando un registrador de varias plumas o dos registradores. Por lo general, se utiliza una conexión en serie de un detector ultravioleta (más sensible, pero selectivo) con un refractómetro, o un detector ultravioleta con un detector de fluorescencia, o dos detectores ultravioleta que operan a diferentes longitudes de onda. La respuesta relativa, es decir, la relación entre la señal del refractómetro y la señal del fotómetro, es una característica de una sustancia, siempre que ambos detectores operen en su rango lineal; esto se verifica mediante la introducción de diferentes cantidades de la misma sustancia. Se puede obtener información cualitativa operando detectores fotométricos equipados con un dispositivo de detención de flujo que registra el espectro del pico que emerge "de la columna mientras está en la celda de flujo, comparándolo con el espectro de un compuesto conocido".

Los espectrofotómetros de matriz de diodos modernos, aún costosos, son de considerable interés en la identificación.

Una sustancia completamente desconocida no se puede identificar solo con la cromatografía líquida de alta resolución y se necesitan otros métodos.

ANÁLISIS CUANTITATIVO

La cromatografía líquida cuantitativa es un método analítico bien desarrollado que no es inferior en precisión a la cromatografía cuantitativa de gases y supera significativamente la precisión de TLC o electroforesis, por lo que para obtener resultados cuantitativos, el instrumento debe estar calibrado.

El análisis cuantitativo consta de las siguientes etapas: 1) separación cromatográfica; 2) medir las áreas o alturas del pico; 3) cálculo de la composición cuantitativa de la mezcla en base a datos cromatográficos; 4) interpretación de los resultados obtenidos, es decir, procesamiento estadístico. Consideremos todas estas etapas.

4.1. SEPARACIÓN CHMATOGRÁFICA

El muestreo puede ser propenso a errores. Es especialmente importante evitar errores y obtener una muestra representativa adecuada de muestras sólidas no homogéneas, sustancias volátiles o inestables, así como productos agrícolas y biomateriales. Las muestras no homogéneas, como los productos alimenticios, se mezclan y se cortan completamente. Realizando esta operación muchas veces se consigue la homogeneidad de la muestra.

Se pueden admitir errores y pérdidas de sustancias en la etapa de extracción, aislamiento, depuración, etc.

Las muestras deben estar completamente disueltas y sus soluciones preparadas con una precisión de ± 0,1%. Es deseable disolver la muestra en la fase móvil, lo que excluye la posibilidad de precipitación después de su introducción en el cromatógrafo. Si la disolución en la fase móvil es imposible, se debe utilizar un disolvente miscible con él y se deben introducir volúmenes de muestra (menos de 25 μl) en el cromatógrafo.

Pueden ocurrir inexactitudes significativas durante la inyección de la muestra debido a su fraccionamiento, fugas y manchas de pico. El desenfoque de los picos provoca la formación de colas, lo que conduce a una superposición parcial de los picos y, como consecuencia, a errores en la detección. Para la inyección cuantitativa, se prefieren los dispositivos de válvula de bucle a las jeringas debido a la mayor precisión y menor dependencia del operador.

En la separación cromatográfica de sustancias también pueden surgir complicaciones que conduzcan a la distorsión de los datos: análisis cuantitativo. Es posible la descomposición o transformación de la muestra durante el proceso cromatográfico o la adsorción irreversible de la sustancia en esta columna. Es importante asegurarse de que estos fenómenos indeseables estén ausentes y, si es necesario, regenerar o reemplazar la columna. La superposición de picos y las colas también se pueden reducir cambiando las condiciones cromatográficas.

No se pueden utilizar picos espurios o difusos en el análisis cuantitativo, así como picos cuyo tiempo de liberación es cercano a para, ya que puede haber una separación insuficiente. Por lo general, se utilizan picos con un valor de ^ 0.5. La mayor eficiencia de la columna se logra con la introducción de 10 ~ 5 -10 ~ 6 g de soluto por gramo de sorbente. Cuando se inyectan grandes cantidades de muestra, la dependencia de la altura del pico en la carga puede ser no lineal y se requiere cuantificación por áreas de pico.

Los errores asociados con la detección o amplificación provocan una distorsión significativa de los resultados de la separación cromatográfica. Cada detector se caracteriza por su especificidad, linealidad y sensibilidad. La prueba de selectividad es especialmente importante cuando se analizan trazas de impurezas. La respuesta de los detectores de UV puede cambiar a sustancias con grupos funcionales similares en un factor de 10 4. Es necesario calibrar la respuesta del detector para cada analito. Naturalmente, las sustancias que no se absorben en la región UV no darán una señal al registrador cuando se utilice un fotómetro como detector. Pueden ocurrir picos negativos cuando se usa un refractómetro. Además, este detector debe estar termostatizado, lo que no es necesario para un detector UV.

La linealidad del detector determina el tamaño de la muestra inyectada. Debe recordarse que la velocidad de flujo de la columna, la temperatura de la columna y del detector y el diseño afectarán la precisión de la cuantificación. Pueden ocurrir errores en la transmisión de una señal eléctrica a un dispositivo de salida (registrador), integrador o a una computadora debido a la captación de ruido, falta de conexión a tierra, fluctuaciones de voltaje en la red, etc.

4.2. MEDICIÓN DEL ÁREA O PICO DE ALTURA

Altura pico h (Fig. 10.1) la distancia desde la parte superior del pico hasta la línea de base se llama, se mide linealmente o se cuenta el número de divisiones en el registrador. Algunos integradores electrónicos y computadoras proporcionan información sobre las alturas de los picos. La posición de la línea de base de los picos desplazados se encuentra interpolando los valores de ordenadas correspondientes al principio y al final del pico (pico 1 y 3 ver fig. 10.1). Para mejorar la precisión, debe tener una línea de base suave y estable. En el caso de picos no separados, la línea de base se traza entre el principio y el final del pico, en lugar de ser reemplazada por una línea cero. Dado que la altura del pico depende menos de la influencia de los picos superpuestos adyacentes, la estimación de la altura del pico es más precisa y casi siempre se utiliza para el análisis de trazas.

El área del pico se puede determinar de varias formas. Echemos un vistazo a algunos de ellos.

1. El método planimétrico consiste en que el pico está rodeado por un planímetro de mano, que es un dispositivo que determina mecánicamente el área del pico. El método es preciso, pero laborioso y poco reproducible. Este método es indeseable.

2. Método de siluetas de papel: el pico se corta y se pesa. El método es bien reproducible, pero laborioso, y el cromatograma está destruido. Su aplicabilidad depende de la uniformidad de la cinta de gráficos. El método tampoco puede recomendarse ampliamente.

4. El método de triangulación consiste en construir un triángulo trazando líneas tangentes a los lados del pico. El vértice del triángulo es más alto que el vértice del pico. El aumento en el área formada por este vértice extendido será constante en todo el cromatograma y no afectará demasiado la precisión. Además, se compensará parte del área perdida al dibujar tangentes. La base del triángulo está determinada por la intersección de las tangentes con la línea base, y el área está determinada por el producto de 7 g de la base y la altura. Este método es el mejor para determinar las áreas de picos asimétricos. Sin embargo, la reproducibilidad en la construcción de tangentes por diferentes operadores es diferente y, por lo tanto; bajo.

5. El método del integrador de disco se basa en un dispositivo electromecánico conectado a una grabadora. El bolígrafo adjunto al integrador se mueve a lo largo de la tira en la parte inferior de la cinta a una velocidad proporcional al movimiento del bolígrafo registrador.

Al igual que con la medición manual, el pico debe permanecer en la escala del registrador; sin embargo, los ajustes para compensar la desviación de la línea de base y la separación incompleta de los picos adyacentes reducen la confiabilidad y aumentan el tiempo de análisis.

El método es más preciso que los métodos de medición manual, especialmente con picos asimétricos, y ofrece una ventaja de velocidad. Además, proporciona un registro cuantitativo continuo del análisis.

6. Los métodos que utilizan integradores electrónicos para determinar las áreas de los picos e imprimir información sobre esa área y los tiempos de retención pueden incluir corregir el sesgo de la línea de base y determinar el área de picos separados solo parcialmente. Las principales ventajas son la precisión, la velocidad, la independencia de la acción del trabajo del registrador. Los integradores tienen memoria y se pueden programar para un análisis específico mediante un programa preprogramado. Las ventajas del integrador incluyen su capacidad para utilizar factores de corrección para la respuesta del detector al volver a calcular los datos iniciales en las áreas de picos, compensando la diferencia en la sensibilidad del detector a diferentes sustancias. Estos sistemas ahorran tiempo, mejoran la precisión analítica y son útiles para análisis analíticos de rutina.

7. En cromatografía líquida, las computadoras se utilizan ampliamente para medir áreas de picos. Imprimen un mensaje completo que incluye el nombre de las sustancias, las áreas de pico, los tiempos de retención, los factores de corrección para la respuesta del detector y el contenido (en% en peso) de los distintos componentes de la muestra.