Рідкісна хроматографія принцип методу. Високоефективна рідинна хроматографія забруднювачів природних та стічних вод

Вступ

Глава 1. Основні поняття та класифікація методів рідинної хроматографії

1.1 Апаратура для рідинної хроматографії

Глава 2. Сутність ВЕРХ

2.1 Застосування

Глава 3. Приклади використання ВЕРХ в аналізі об'єктів довкілля

Глава 4. Апаратура для ВЕРХ

Література

додаток

Вступ

Хроматографічні методичасто виявляються незамінними для ідентифікації та кількісного визначення органічних речовин зі схожою структурою. При цьому найбільш широко використовуються для рутинних аналізів забруднювачів навколишнього середовища є газова та високоефективна рідинна хроматографія. Газохроматографічний аналіз органічних забруднювачів у питній та стічних водах спочатку ґрунтувався на використанні насадочних колонок, пізніше поширення набули і кварцові капілярні колонки. Внутрішній діаметр капілярних колонок зазвичай становить 0,20-0,75 мм, довжина - 30-105 м. Оптимальні результати при аналізі забруднювачів у воді досягаються найчастіше при використанні капілярних колонок з різною товщиною плівки з метилфенілсиліконів з вмістом фенільних груп 5 і 50% . Вразливим місцем хроматографічних методик із використанням капілярних колонок часто стає система введення проби. Системи введення проби можна поділити на дві групи: універсальні та селективні. До універсальних відносяться системи введення з розподілом і без поділу потоку, "холодне" введення в колонку та випаровування при програмуванні температури. При селективному введенні використовують продування з проміжним уловлюванням у пастці, парофазний аналіз тощо. При використанні універсальних систем введення колонку надходить вся проба повністю, при селективної інжекції вводиться лише певна фракція. Результати, одержувані при селективному введенні, є істотно більш точними, оскільки фракція, що потрапила в колонку, містить тільки леткі речовини, і техніка при цьому може бути повністю автоматизована.

Газохроматографічні детектори, що використовуються в моніторингу забруднювачів, часто поділяють на універсальні, що відгукуються на кожен компонент рухомої фази, і селективні, що реагують на присутність в рухомій фазі певної групи речовин зі подібними хімічними характеристиками. До універсальних відносяться полум'яно-іонізаційний, атомно-емісійний, мас-спектрометричний детектори та інфрачервона спектрометрія. Селективними детекторами, що використовуються в аналізі води, є електронно-захоплювальний (селективний до речовин, що містить атоми галогенів), термоіонний (селективний до азот- і фосфоровмісних сполук), фотоіонізаційний (селективний до ароматичних вуглеводнів), детектор з електролітичної провідності містить атоми галогенів, сірки та азоту). Мінімально детектується кількість речовин - від нанограмів до пікограмів в секунду.

Високоефективна рідинна хроматографія(ВЕРХ) є ідеальним методом для визначення великої кількості термічно нестійких сполук, які не можуть бути проаналізовані газовою хроматографією. Об'єктами аналізу методом рідинної хроматографії в даний час часто стають сучасні агрохімікати, до яких входять метилкарбонати та фосфорорганічні інсектициди, інші нелеткі речовини. Високоефективна рідинна хроматографія набуває все більшого поширення серед інших методів, що застосовуються в моніторингу навколишнього середовища, ще й тому, що має блискучі перспективи щодо автоматизації пробопідготовки.

ГЛАВА 1. ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ ТА КЛАСИФІКАЦІЯ МЕТОДІВ РІДИНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ

Рідинну хроматографію поділяють кілька класів залежно від типу носія нерухомої фази. Просте апаратурне оформлення паперової та тонкошарової хроматографій зумовили широке використання цих методів у аналітичній практиці. Однак великі можливості колонкової рідинної хроматографії стимулювали вдосконалення обладнання для цього класичного методу і призвели до швидкого впровадження ВЕРХ. Пропускання елюентів через колонку під високим тиском дозволило різко збільшити швидкість аналізу та суттєво підвищити ефективність поділу за рахунок використання дрібнодисперсного сорбенту. Метод ВЕРХ в даний час дозволяє виділяти, кількісно та якісно аналізувати складні суміші органічних сполук.

За механізмом взаємодії речовини, що розділяється (елюату) з нерухомою фазою розрізняють адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, екслюзійну, іон-парну, лігандообмінну і афінну хроматографії.

Адсорбційна хроматографія. Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини, що розділяється з адсорбентом, таким як оксид алюмінію або силікагель, що мають на поверхні активні полярні центри. Розчинник (елюенти) - неполярна рідина. Механізм сорбції полягає в специфічній взаємодії між полярною поверхнею сорбенту та полярними (або здатними поляризуватися) ділянками молекул аналізованого компонента (рис. 1).

Мал. 1. Адсорбційна рідинна хроматографія.

Розподільча хроматографія. При розподільчому варіанті рідинної хроматографії поділ суміші речовин здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються, - елюентом (рухомою фазою) і фазою, що знаходиться на сорбенті (нерухома фаза).

При нормально-фазовимваріанті розподільчої рідинної хроматографії використовуються неполярний елюенти та полярні групи, щеплені до поверхні сорбенту (найчастіше силікагелю). Як модифікатори поверхні силікагелю (щеплених фаз) використовуються заміщені алкілхлорсилани, що містять полярні групи, такі як нітрильна, аміногрупа і т. д. (рис. 2). Застосування щеплених фаз дозволяє тонко керувати сорбційними властивостями поверхні нерухомої фази і досягати високої ефективності поділу.

Мал. 2. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (нормально-фазний варіант).

Обернено-фазоварідинна хроматографія заснована на розподілі компонентів суміші між полярним елюентом та неполярними групами (довгими алкільними ланцюжками), щепленими до поверхні сорбенту (рис. 3).

Мал. 3. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (навернено-фазний варіант).

Менш широко використовують варіант рідинної хроматографії з нанесеними фазами, коли рідка нерухома фаза наноситься на нерухомий носій.

Ексклюзивна (гельпроникна)хроматографія є варіант рідинної хроматографії, в якому поділ речовин відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходиться в порах сорбенту і розчинником, що протікає між його частинками.

Афіннахроматографія заснована на специфічних взаємодіях білків (антитіл), що розділяються, з щепленими на поверхні сорбенту (синтетичної смоли) речовинами (антигенів), вибірково утворюючими з білками комплекси (коньюгати).

Іонообмінна, іон-парна, лігандообмінна хроматографії застосовуються в основному в неорганічному аналізі.

Основні параметри хроматографічного поділу.

Основними параметрами хроматографічного поділу є об'єм, що утримується, і час утримування компонента суміші (рис. 4).

Час утримування tR - це час, що минув від моменту введення проби в колонку до виходу максимуму піку. Помноживши час утримання на об'ємну швидкість елюентів F , отримаємо об'єм VR, що утримується:

Виправлений час утримання - час, що минув з моменту появи максимуму піку несорбируемого компонента до піку відповідної сполуки:

tR" = tR - t0;

Наведений або виправлений об'єм утримування - це об'єм утримування з поправкою на мертвий об'єм колонки V0, тобто на об'єм утримування компонента, що не сорбується:

VR" = VR - V0;

Характеристикою утримування є також коефіцієнт ємності k", який визначається як відношення маси речовини в нерухомій фазі до маси речовини в рухомій фазі: k" = mн / mп;

Величину k" легко визначити за хроматограмою:

Найважливішими параметрами хроматографічного поділу є його ефективність та селективність.

Ефективність колонки, що вимірюється висотою теоретичних тарілок (ВЕТТ) і обернено пропорційна їх числу (N) тим вище, ніж пік речовини, що виходить при тому ж часу утримування. Значення ефективності може бути обчислено за хроматограмою за такою формулою:

N = 5.54 . (tR/1/2) 2 ,

де tR- час утримування,

w 1/2 - Ширина піка на половині висоти

Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, довжину колонки L і середній діаметр зерна сорбенту dc, легко отримати значення висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ВЕТТ) та наведеної висоти (ПВЕТ):

ВЕТТ = L/N ПВЕТТ = ВЕТТ/d c

Ці характеристики дозволяють порівнювати ефективність колонок різних типів, оцінювати якість сорбенту і якість заповнення колонок.

Селективність поділу двох речовин визначається за рівнянням:

При розгляді поділу суміші двох компонентів важливим параметром є також ступінь поділу RS:

;

Піки вважаються дозволеними, якщо величина RS більша або дорівнює 1.5.

Основні хроматографічні параметри пов'язують наступне рівняння для вирішення:

;

Чинниками, що визначають селективність поділу, є:

1) хімічна природа сорбенту;

2) склад розчинника та його модифікаторів;

3) хімічна структура і властивості компонентів суміші, що розділяється;

4) температура колонки

1.1 Апаратура для рідинної хроматографії

У сучасній рідинній хроматографії використовують прилади різного ступеня складності - від найпростіших систем до хроматографів високого класу, забезпечених різними додатковими пристроями.

На рис. 4. представлена ​​блок-схема рідинного хроматографа, що містить мінімально необхідний набір складових частин, у тому чи іншому вигляді, присутніх у будь-якій хроматографічній системі.

Мал. 4. Блок-схема рідинного хроматографа.

Насос (2) призначений створення постійного потоку розчинника. Його конструкція визначається, перш за все, робочим тиском у системі. Для роботи в діапазоні 10-500 МПа використовуються насоси плунжерного (шприцевого) або пістонного типів. Недоліком перших є необхідність періодичних зупинок для заповнення елюентом, а других – велика складність конструкції та, як наслідок, висока ціна. Для простих систем з невисокими робочими тисками 1-5 МПа з успіхом застосовують недорогі перистальтичні насоси, але так як при цьому важко досягти сталості тиску та швидкості потоку, їх використання обмежене препаративними завданнями.

Інжектор (3) забезпечує введення проби суміші компонентів, що розділяються в колонку з досить високою відтворюваністю. Прості системи введення проби - "stop-flow" вимагають зупинки насоса і тому менш зручні, ніж петлеві дозатори, розроблені фірмою Reodyne.

Колонки (4) для ВЕРХ є товстостінні трубки з нержавіючої сталі, здатні витримати високий тиск. Велику роль відіграє щільність та рівномірність набивання колонки сорбентом. Для рідинної хроматографії низького тиску успішно використовують товстостінні скляні колонки. Постійність температури забезпечується термостатом (5).

Детектори (6) для рідинної хроматографії мають проточну кювету, в якій відбувається безперервний вимір будь-якої властивості елюенту, що протікає. Найбільш популярними типами детекторів загального призначення є рефрактометри, що вимірюють показник заломлення, та спектрофотометричні детектори, що визначають оптичну щільність розчинника на фіксованій довжині хвилі (як правило, в ультрафіолетовій області). До переваг рефрактометрів (і недоліків спектрофотометрів) слід віднести низьку чутливість до типу з'єднання, що визначається, яке може і не містити хромофорних груп. З іншого боку, застосування рефрактометрів обмежено ізократичними системами (з постійним складом елюентів), так що використання градієнта розчинників у цьому випадку неможливе.

Колонки для ВЕРХ, які найчастіше використовують у аналізах забруднювачів довкілля, мають довжину 25 див і внутрішній діаметр 4,6 мм, заповнюються вони сферичними частками силікагелю розміром 5-10 мкм з щепленими октадецильными групами. Останніми роками з'явилися колонки із меншим внутрішнім діаметром, заповненими частинками меншого розміру. Використання таких колонок призводить до зменшення витрати розчинників та тривалості аналізу, збільшення чутливості та ефективності поділу, а також полегшує проблему підключення колонок до спектральних детекторів. Колонки з внутрішнім діаметром 3,1 мм забезпечують запобіжним картриджем (форколонкою) для збільшення терміну служби та покращення відтворюваності аналізів.

Як детектори в сучасних приладах для ВЕРХ використовуються зазвичай УФ-детектор на діодній матриці, флуоресцентний та електрохімічний.

Слід пам'ятати, що у практичній роботі поділ часто протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно. Так, екслюзійний поділ буває ускладнений адсорбційними ефектами, адсорбційний - розподільчими, і навпаки. При цьому чим більша відмінність речовин у пробі за ступенем іонізації, основності або кислотності, за молекулярною масою, поляризацією та іншими параметрами, тим більша ймовірність прояву іншого механізму поділу для таких речовин.

На практиці, найбільшого поширення набула «наверненофазова» (розподільна) хроматографія, в якій нерухома фаза не полярна, а рухлива полярна (тобто зворотна «прямофазної» хроматографії).

У більшості лабораторій світу групу із 16 пріоритетних ПАУ аналізують методами ВЕРХ чи ХМС.

ГЛАВА 2. СУТНІСТЬ ВЕРХ

У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) характер процесів, що відбуваються в хроматографічній колонці, загалом ідентичний з процесами в газовій хроматографії. Відмінність полягає лише у застосуванні як нерухомої фази рідини. У зв'язку з високою щільністю рідких рухомих фаз і великим опором колонок газова та рідинна хроматографія сильно розрізняються за апаратурним оформленням.

У ВЕРХ як рухомі фази зазвичай використовують чисті розчинники або їх суміші.

Для створення потоку чистого розчинника (або сумішей розчинників), званого рідинної хроматографії елюентом, використовуються насоси, що входять в гідравлічну систему хроматографа.

Адсорбційна хроматографія здійснюється внаслідок взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Різниця у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досяжний при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом, поверхнею та діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію та інші адсорбенти. Основна причина цього:

недостатня механічна міцність, що не дозволяє упаковувати та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ;

силікагель порівняно з оксидом алюмінію має ширший діапазон пористості, поверхні та діаметру пор; Значно більша каталітична активність оксиду алюмінію призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби чи його незворотній хемосорбції.

Детектори для ВЕРХ

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) використовується для детектування полярних нелетких речовин, які з будь-яких причин не можуть бути переведені у зручну форму для газової хроматографії, навіть у вигляді похідних. До таких речовин, зокрема, відносять сульфонові кислоти, водорозчинні барвники та деякі пестициди, наприклад, похідні феніл - сечовини.

Детектори:

УФ – детектор на діодній матриці. «Матриця» фотодіодів (їх більше двохсот) постійно реєструє сигнали в УФ і видимій області спектру, забезпечуючи таким чином запис УФ-В-спектрів в режимі сканування. Це дозволяє безперервно знімати при високій чутливості неспотворені спектри компонентів, що швидко проходять через спеціальну комірку.

У порівнянні з детектуванням на одній довжині хвилі, яке не дає інформації про «чистоту» піку, можливості порівняння повних спектрів діодної матриці забезпечують отримання результату ідентифікації з більшим ступенем достовірності.

Флуоресцентний детектор. Велика популярність флуоресцентних детекторів пояснюється дуже високою селективністю та чутливістю, і тим фактором, що багато забруднювачів довкілля флуоресціюють (наприклад, поліароматичні вуглеводні).

Електрохімічний детектор використовуються для детектування речовин, які легко окислюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- та галогенпохідні, кетони альдегіди, бензидини.

Хроматографічне поділ суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)

Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинній колонковій хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так з великою молекулярною масою.

Залежно від типу сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).

При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖГ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.

детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.

Безперервно детектований сигнал реєструється самописцем. Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хроматограмі використовують для ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.

2.1 Застосування

Найбільш широке застосування ВЕРХ знаходить у наступних областях хімічного аналізу (виділено об'єкти аналізу, де ВЕРХ практично не має конкуренції):

Контроль якості продуктів харчування - тонізуючі та смакові добавки, альдегіди, кетони, вітаміни, цукру, барвники, консерванти, гормональні препарати, антибіотики, тріазинові, карбаматні та ін пестициди, мікотоксини, нітрозоаміни, поліциклічні ароматичні вуглеводні тощо.

Охорона навколишнього середовища - феноли, органічні нітросполуки, моно- та поліциклічні ароматичні вуглеводні, ряд пестицидів, головні аніони та катіони.

Криміналістика – наркотики, органічні вибухові речовини та барвники, сильнодіючі фармацевтичні препарати.

Фармацевтична промисловість – стероїдні гормони, практично всі продукти органічного синтезу, антибіотики, полімерні препарати, вітаміни, білкові препарати.

Медицина - перелічені біохімічні та лікарські речовини та їх метаболіти у біологічних рідинах (амінокислоти, пурини та піримідини, стероїдні гормони, ліпіди) при діагностиці захворювань, визначенні швидкості виведення лікарських препаратів з організму з метою їх індивідуального дозування.

Сільське господарство - визначення нітрату та фосфату у ґрунтах для визначення необхідної кількості внесених добрив, визначення поживної цінності кормів (амінокислоти та вітаміни), аналіз пестицидів у ґрунті, воді та сільгосппродукції.

Біохімія, біоорганічна хімія, генна інженерія, біотехнологія - цукру, ліпіди, стероїди, білки, амінокислоти, нуклеозиди та їх похідні, вітаміни, пептиди, олігонуклеотиди, порфірини та ін.

Органічна хімія – всі стійкі продукти органічного синтезу, барвники, термолабільні сполуки, нелеткі сполуки; неорганічна хімія (практично всі розчинні сполуки у вигляді іонів та комплексних сполук).

контроль якості та безпеки продуктів харчування, алкогольних та безалкогольних напоїв, питної води, засобів побутової хімії, парфумерії на всіх стадіях їх виробництва;

визначення характеру забруднень дома техногенної катастрофи чи надзвичайної події;

виявлення та аналіз наркотичних, сильнодіючих, отруйних та вибухових речовин;

визначення наявності шкідливих речовин (поліциклічні та інші ароматичні вуглеводні, феноли, пестициди, органічні барвники, іони важких, лужних та лужноземельних металів) у рідких стоках, повітряних викидах та твердих відходах підприємств та в живих організмах;

моніторинг процесів органічного синтезу, нафто- та вуглепереробки, біохімічних та мікробіологічних виробництв;

аналіз якості ґрунтів для внесення добрив, наявності пестицидів та гербіцидів у ґрунті, воді та в продукції, а також поживній цінності кормів; складні дослідні аналітичні завдання; одержання мікрокількості надчистої речовини.

ГЛАВА 3. ПРИКЛАДИ ВИКОРИСТАННЯ ВЕРХ В АНАЛІЗІ ОБ'ЄКТІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА

ВЕРХ – метод моніторингу ПАУ в об'єктах навколишнього середовища

Для поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ), екотоксикантів 1-го класу небезпеки, встановлені вкрай низькі рівні гранично допустимих концентрацій (ГДК) у природних об'єктах. Визначення ПАУ на рівні ГДК і нижче відноситься до дуже складних аналітичних завдань і для їх вирішення застосовуються високотехнологічні методи аналізу (ГХ-МС, ГХ, ВЕРХ). При виборі способу для моніторингу до основним аналізованим параметрам – чутливість і селективність, додаються експресність і економічність, т.к. моніторинг передбачає проведення серійного аналізу. Варіант ВЕРХ на коротких колонках малого діаметра значною мірою відповідає вказаним вимогам. Із застосуванням даного методу авторами розроблено та атестовано методики контролю бенз[a]пірена у трьох природних середовищах: аерозолі, сніговому покриві та поверхневих водах. Для методик характерні: проста уніфікована підготовка проби, що включає екстракцію ПАУ органічними розчинниками та концентрування екстракту, пряме введення сконцентрованого екстракту в хроматографічну колонку, застосування багатохвильового фотометричного детектування в УФ області спектру, ідентифікація піків ПАУ на хроматограмах . Сумарна похибка не перевищує 10 % при визначенні бенз[a]пірена в аерозолі в діапазоні концентрацій від 0.3 до 450 нг/м 3 у поверхневих водах в діапазоні концентрацій від 10 до 1000 нг/л, у сніговому покриві в діапазоні поверхневої щільності. до 50 мкг/м2. Для випадку одночасного визначення пріоритетних ПАУ (до 12 сполук) та реєстрації негомогенних піків аналітів запропоновано повторний поділ екстракту зі зміною селективності рухомої фази, довжини хвилі детектування та температури колонки з урахуванням індивідуальних властивостей ПАУ, що визначається.

1 . Якість навколишнього повітря. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2000.

2 . Якість поверхневих та очищених стічних вод. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2001.

3 . Якість снігового покриву. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №02-2001.

Видалення аніліну з водних розчинів із використанням відходів алюмотермічного відновлення прокатної мідної окалини

Проблема видалення вуглеводнів зі стічних вод є актуальним завданням. У багатьох хімічних, нафтохімічних та інших виробництвах утворюються анілін та його похідні, які є токсичними речовинами. Анілін - сильноотруйна речовина, ГДК - 0,1 мг/м 3 . Анілін та його похідні розчиняються у воді, тому не можуть бути видалені гравітаційним осадженням.

Одним з кращих методів очищення стічних вод від органічних забруднювачів є застосування неорганічних та органічних адсорбентів, здатних регенеруватися (алюмосилікати, модифіковані глини, деревина, волокна і т. д.) і нездатних до регенерації (активоване вугілля, макропористі полімерні матеріали і т.д. ).

Адсорбенти, що регенеруються, можуть видалити з води органічні речовини різної полярності. Пошук ефективних адсорбентів є актуальним завданням.

У цьому повідомленні представлені результати дослідження в галузі застосування прокатної мідної окалини Єреванського кабельного заводу (ОПМОЄрКЗ) як сорбентів аніліну.

Хроматографічні дослідження проводили на хроматографі ВЕРХ / високоефективна рідинна хроматографія / системи (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), на колонці 250 х 4 мм наповненими досліджуваними нами сорбентами 1 є досліджувані нами розчинники, детектор - UV-254. УФ-спектроскопічний аналіз проведено на спектрофотометрі Specord-50, спектри отримані за допомогою комп'ютерної програми ASPECT PLUS.

Точно зважені порції сорбентів вносили певні обсяги аніліну у воді, початкові концентрації яких варіювали. Суміш ретельно збовтували протягом 6 год. Далі пробу залишали для відстою. Адсорбція завершується практично протягом 48 годин. Кількість осадженого аніліну визначена УФ-спектрофотометричним, а також рефрактометричним аналізом.

Спочатку були досліджені адсорбційні властивості ОПМОЕРКЗ при видаленні аніліну з розчину в тетрахлорметані. Виявилося, що анілін найкраще поглинає сорбент 3 (таблиця).

Проведено також вимірювання для водних розчинів аніліну в концентраціях 0,01-0,0001 моль/л. У таблиці наведено дані по 0,01 М розчину.

Поглинання аніліну різними сорбентами 0,01 М водного розчину аніліну при 20°С

Раніше було встановлено, що адсорбція у зазначених межах концентрацій зростає та лінійно залежить від коефіцієнта заломлення. Кількість аніліну було визначено з графічної залежності «коефіцієнт заломлення – молярна концентрація» та скориговано даними як рідинної хроматографії, так і УФ-спектрального аналізу.

Найбільш активним для водних розчинів є сорбент 3. Кількість адсорбованого забруднювача розраховувалося як різниця між загальною кількістю забруднювача, доданого в початковий розчин, та його залишком у кінцевому розчині.

Методи визначення ПАУ в об'єктах довкілля

Як правило для визначення ПАУ використовуються методи газової хроматографії (ГХ) та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). поділ основних 16 ПАУ, достатній для кількісного аналізу, досягається застосуванням або капілярних колонок у газовій хроматографії, або високоефективних колонок, що застосовуються в ВЕРХ. Необхідно пам'ятати, що колонка, яка добре розділяє калібрувальні суміші шістнадцяти ПАУ не гарантує, що вони також добре розділятимуться на тлі супутніх органічних сполук у досліджуваних пробах.

З метою спрощення аналізу, а також для досягнення високої якості результатів, більшість аналітичних процедур містить етап попереднього виділення (сепарації) ПАУ серед інших груп супутніх сполук у пробах. Найчастіше в цих цілях використовуються методи рідинної хроматографії низького тиску в системі рідина-тверде тіло або рідина-рідина з використанням механізмів адсорбції, наприклад з використанням силікагелю або окису алюмінію, іноді використовуються змішані механізми, наприклад, адсорбції та винятки із застосуванням сефадексів.

Використання попереднього очищення проб дозволяє при визначенні ПАВ уникнути впливу:

Повністю неполярних сполук, таких як аліфатичні вуглеводні;

Помірно та сильно полярних сполук, наприклад, фталанів, фенолів, багатоатомних спиртів, кислот;

Високомолекулярних сполук, таких, як, наприклад, смоли.

У високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) використовуються переважно два типи детекторів: флуориметричний детектор або спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою. Межа виявлення ПАУ при флуориметричному детектуванні дуже низька, що робить цей метод особливо придатним для визначення слідових кількостей поліароматичних сполук. Однак класичні флуориметричні детектори практично не дають інформації про будову досліджуваного з'єднання. Сучасні конструкції уможливлюють реєстрацію спектрів флуоресценції, які характерні для індивідуальних сполук, але вони поки не набули широкого поширення в практиці рутинних вимірювань. Спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою (ФДЛ) дає можливість реєстрації спектрів поглинання в УФ і видимому спектральному діапазоні, ці спектри можуть використовуватися для ідентифікації. Аналогічна інформація може бути отримана з використанням детекторів, що швидко сканують.

При виборі аналітичної техніки, призначеної для поділу, ідентифікації та кількісного аналізу згаданих ПАВ необхідно враховувати такі умови:

Рівень визначених змістів у досліджуваних пробах;

Кількість супутніх субстанцій;

Застосовувана аналітична процедура (методика виконання вимірів);

Можливість серійної апаратури.

Розробка методики визначення лужноземельних елементів та магнію методом іонної високоефективної рідинної хроматографії.

Розробка та вдосконалення методів, що дозволяють вирішувати завдання аналізу вод - важлива проблема аналітичної хімії. Розвиток високоефективної рідинної хроматографії високого тиску стимулював розвиток нового напрямку в іонообмінній хроматографії - так званої іонної хроматографії. Синтез сорбентів для іонної хроматографії утруднений, оскільки до них пред'являється чимало вимог. У зв'язку з відсутністю комерційно доступних високоефективних катіонітів, була використана динамічно модифікована обернена фаза, для чого був синтезований модифікатор: N-гексадецил-N-деканоїл-параміно-беноілсульфокислоти етил-діізопропіламоній (ДГДАСК), де гідрофобний амін, що містить групу здатний до катіонного обміну. Після пропускання розчину модифікатора поглинання при l = 260 нм досягало 64 одиниць оптичної щільності (° Е) з виходом на плато. Розрахована іонообмінна ємність становить 1565 мкмоль. Так як катіони лужноземельних елементів і магнію не поглинають в УФ області спектру, використовувалася непряма УФ детекція із застосуванням синтезованого УФ поглинаючого елюенту 1,4 дипиридинийбутана броміду (ДПБ бромід). Так як галоген-іони руйнують сталеві частини колонки, то бромід-іон 1,4-дипіридінійбутану замінили на ацетат-іон. При промиванні колонки елюентом відбувається заміна протиіону модифікатора-етилдіізопропіламонію на УФ-поглинаючий іон 1,4-дипіридинійбутан. Поділ катіонів здійснювали за оптимальної довжини хвилі l = 260 нм на шкалі 0,4 А в режимі “складання шкали”; полярність самописця змінювали на зворотний. Поділ усіх катіонів, що вивчаються, досягнуто при веденні комплексоутворюючої добавки-щавлевої кислоти. Межі виявлення Mg 2+ Ca 2+ Sr 2+ Ba 2+ становлять 8 мкг/л; 16 мкг/л; 34 мкг/л; 72 мкг/л відповідно. В обраних умовах проаналізовано водопровідну воду, вміст Ca 2+ в якій становить 10,6 +1,9 мг-іон/л, Mg 2+ -2,5 + мг-іон/л. Помилка відтворюваності не перевищує Ca 2+ -2,2%, для Mg 2+ – 1,4%.

Аналіз комплексів кадмію у навколишньому середовищі

Для вивчення механізмів міграції важких металів у біосфері необхідні дані про хімічні форми існування металів у природі. Складнощі при аналізі сполук одного з найтоксичніших металів – кадмію – пов'язані з тим, що він утворює неміцні комплекси, і при спробі їх виділити спотворюються природні рівноваги. У даній роботі сполуки кадмію в ґрунті та рослинах досліджені за допомогою методики, що базується на хроматографічному поділі екстрактів з подальшою ідентифікацією компонентів методами хімічного аналізу. Такий підхід дозволив як ідентифікувати хімічні форми кадмію, а й простежувати їх трансформації в об'єктах довкілля.

З кадмієм в об'єктах біосфери координуються ОН-групи вуглеводів та поліфенолів (включаючи флавоноїди), С=О, фосфати, NH 2 , NO 2 , SH-групи. Для цілей цього дослідження було складено набір модельних лігандів, які представляють ці класи сполук. Взаємодія модельних лігандів з водорозчинними солями кадмію була досліджена методами СФ спектроскопії та ВЕРХ.

Для виділення сполук кадмію використовували екстракцію спеціально підібраними розчинниками (не утворюють комплексів з Cd). Так вдається відокремити кадмій від усіх важких металів, крім його хімічного аналога – цинку. Кадмій- та цинк, що містять піки на хроматограмах отриманих екстрактів, виявляли за допомогою зв'язування металів у вигляді їх дитизонатів. Для відокремлення від цинку використовували відмінність у стійкості комплексів Cd та Zn при рН 6-8. Виділені сполуки Cd ідентифікували методом ВЕРХ із зміною рН у процесі елюювання. Був виконаний аналіз сполук кадмію з компонентами ґрунтів та тканин рослин, а також ідентифіковані речовини, що виробляються рослинами у відповідь на збільшення надходження кадмію із ґрунту. Показано, що у злаків захисними агентами є флавоноїди, зокрема трицин, у бобових – алкоксипохідні цистеїну, у хрестоцвітих – як поліфеноли, так і тіоли.

ГЛАВА 4. АПАРАТУРА ДЛЯ ВЕРХ

СЕРІЯ ACCELA

Новий надвисокоефективний рідинний хроматограф ACCELA здатний працювати в найширшому діапазоні сокростей потоків і тисків, забезпечуючи як типове для ВЕРХ поділ на звичайних колонках, так і надшвидке та ефективне поділ на колонках з розміром частинок сорбенту менше 2 мкм при сверхвы.

Система включає квотернарний градієнтний інетрний насос, здатний створювати тиск понад 1000 атм та з об'ємом затримки всього 65 мкл, що забезпечує високошвидкісний хроматографічний поділ. Автосамплер ACCELAздатний працювати в циклі інжекції зразка 30 секунд і забезпечує високу відтворюваність введення. Діодно-матричний детектор Accela PDAз мінімізованим обсягом проточного осередку (2 мкл) оптимізований для роботи в режимі високошвидкісної хроматографії, використовує патентовану технологію LightPipe і забезпечує збереження симетричної форми піків, що дає використання бездоганних хроматографічної системи та колонок.

Система ідеально з'єднується з мас-спектрометрами для створення найпотужніших та найкращих з доступних у світі систем ВЕРХ/МС.

Колонки для роботи в режимі надвисокоефективної хроматографії з розміром зерна 1.9 мкм доступні від Thermo Electron для будь-яких застосувань.

СЕРІЯ TSP

Модульний принцип побудови приладів ВЕРХ дозволяє замовнику гнучко комплектувати обладнання для вирішення будь-яких аналітичних завдань, а при їх зміні оперативно та економічно його модифікувати. Широкий вибір модулів включає насоси - від ізократичного до чотирикомпонентного градієнтного, від мікроколонного до напівпрепаративного, всі доступні детектори, системи введення зразка - від ручних інжекторів до автосамплерів з можливістю будь-яких маніпуляцій із зразками, потужне програмне забезпечення для обробки результатів. Всі модулі сертифіковані за CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, вони компактні, мають сучасний дизайн, прості в управлінні, оснащені вбудованим дисплеєм та системою самодіагностики, дозволяють створювати та зберігати в пам'яті методи завдання параметрів. Вони відповідають критеріям "Зразкової Лабораторної Практики" (GLP) та занесені до Реєстру Вимірювальних засобів РФ. Протоколи вимірювань видаються відповідно до Фармакопеїв Англії, США, Німеччини та Франції.

Модульні системи TSP відрізняються високою надійністю та стійкістю в експлуатації.

Поєднання модулів забезпечує аналітика всіма перевагами інтегральної системи, з одного боку, та гнучкістю модульної системи з іншого. В якій би галузі застосувань Високоефективної рідкої хроматографії (ВЕРХ) -фармакологія, біотехнологія, аналіз об'єктів навколишнього середовища, клінічний аналіз,

Повітря всередині приміщень: методи контролю та очищення. Контролює джерело шкідливих речовин та навколишнього середовища. Газоаналізатори: застосування та їх сучасні види для контролю складу газової суміші - універсальні фотометричні рідинні та стрічкові.

Моніторинг як система спостереження та контролю зброї. Методи контролю забруднюючих речовин у об'єктах довкілля.

Поділ аніонів методом одноколонкової іонної хроматографії. Зображення структури частки іонообмінної смоли. Приклади використання іонообмінної хроматографії для аналізу об'єктів навколишнього середовища. Особливості аналізу пива методом іонної хроматографії.

Загальна характеристика хлорорганічних сполук, їх основні фізико-хімічні властивості та сфери застосування, негативний вплив на довкілля, організм тварин, риб та людини. Хлорорганічні пестициди у продуктах харчування та методи їх визначення.

Основи планарної (тонкошарової) хроматографії: стан та перспективи використання сучасних інструментальних методів аналізу пестицидів, хлорорганічних пестицидів у воді, продуктах харчування, кормах та тютюнових виробах хроматографією у тонкому шарі.

Методи доступні для відбору проб повітря в приміщенні для аналізу. Принцип дії колориметричних трубок. Зміна кольору певного реагенту при вступі в контакт із тим чи іншим забруднювачем. Виявлення летких органічних сполук.

Теоретичні основи флуометрії (люмінісценції), галузі її застосування в аналізі об'єктів навколишнього середовища та сучасне обладнання для досліджень. Надзвичайна чутливість та швидкість люмінісцентного аналізу. Проблеми підведення енергії збудження.

Розвиток хіміко-аналітичної апаратури не тільки не знімає проблему якості вимірів, що виконуються, але, навпаки, пред'являє все більш високі вимоги у всіх аспектах проведення вимірювань.

Загальні відомості про промисловий об'єкт. Кліматичні умови району. Технологічний ланцюжок. Джерела забруднення та порушення природного середовища. Забруднення природних вод. Пункти спостереження за якістю поверхневих вод. Відбір проб води та методи аналізу.

Широкий спектр органічних сполук, що вводяться в навколишнє середовище в процесі господарської діяльності людини, призводить до того, що ці речовини стали основними поллютантами, що визначають характер техногенного забруднення гідросфери.

Характеристика спектроскопічних методів аналізу Сутність екстракційно-фотометричних методів. Приклади використання методу визначення важких металів у природних водах. Методика виявлення бромід-іонів, нітрат-іонів. Сучасне обладнання.

Поняття та призначення газової хроматографії, параметри її утримання. Час утримування та утримуваний об'єм. Рівняння у газовій хроматографії. Додаткові пристрої газової хроматографії. Контроль забрудненості повітря у надзвичайних ситуаціях.

Поняття та характеристика методу мас-спектрометрії. Мас-спектрометри з подвійним фокусуванням у мас-спектрометрії з індуктивно-зв'язаною плазмою. Використання хромато-мас-спектрометрії в ідентифікації забруднювачів природних середовищ, обладнання.

Методи оцінки забруднення газових потоків. Основні вимоги до відбору проб газу та його аналізу та методи вимірювань. Методи оцінки параметричних забруднень. Методи оцінки забруднення водного середовища, ґрунтів, ґрунтів та рослинності. Ідентифікація змін.

Визначення тисячних часток відсотка вмісту речовини у чистих металах оптичними методами аналізу за допомогою адсорбційних методів спектрофотомерією, фотоколориметрією та колориметрією. Продаж хіміко-аналітичного обладнання через веб-сайти.

Призначення та основні засади реалізації кондуктометричних методів аналізу. Різновиди використовуваних методів та особливості їх застосування. Приклади використання кондуктометрії в аналізі об'єктів навколишнього середовища та необхідне для цього обладнання.

Стосовно природних вод розглянуті проблеми кількісного визначення та поділу на антропогенну та природну складові вуглеводнів (СН).

Сорбційні методи очищення води в даний час знаходять все ширше застосування, і одним з найчастіше застосовуваним сорбентом є активне вугілля.

Основні види хроматографії. Застосування хроматографічних методів у екологічному моніторингу. Застосування хроматографії в аналізі об'єктів довкілля. Сучасне апаратурне оздоблення. Методи прояву хроматограм та робота хроматографа.

Моніторинг природних вод фізико-хімічними методами: планарна (тонкошарова хроматографія) та її застосування для налізу вод. Поділ суміші речовин у плоскому шарі сорбенту та розчиннику. Інтенсивність люмінесценції нафтопродуктів на флюориметрі.

(ОФС 42-0096-09)

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомий фазою (ПФ) служить жид-

кістка, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену непід-

вижною фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають

ють «рідинною хроматографією високого тиску».

Залежно від механізму поділу речовин розрізняють таку-

щі варіанти ВЕРХ: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну,

ексклюзивну, хіральну та ін.

В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбуватися з по-

верхності адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад силікагелю.

У розподільчій ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою

(як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія) та

рухомий фазами.

За полярністю ПФ і НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову та об-

ращенно-фазову.

Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, в якому вико-

користуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з при-

крученими NH2 - або CN-групами) і неполярна ПФ (наприклад, гексан з раз-

особистими добавками). У звернено-фазовому варіанті хроматографії вико-

використовують неполярні хімічно модифіковані сорбенти (наприклад,

неполярний алкільний радикал C18 ) і полярні рухомі фази (наприклад,

метанол, ацетонітрил).

В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, дисоці-

що вали в розчині на катіони та аніони, поділяються при русі через

сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними

ми групами сорбенту.

В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної)

хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їхньої різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з ко-

лонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази,

а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

Часто поділ протікає не по одному, а по кількох механізмах одночасно.

Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких нега-

подібних аналізованих речовин. Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основ-

ні вузли:

– вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємно-

сти з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фа-

зи) та систему дегазації ПФ;

– насосна система;

– змішувач рухомої фази (за потреби);

– система введення проби (інжектор);

– хроматографічна колонка (може бути встановлена ​​в термостаті);

– детектор;

– система збору та обробки даних.

Насосна система

Насоси забезпечують подачу ПФ у колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомої фази може бути постійним або змінюва-

ним під час аналізу. У першому випадку процес називають ізократичним,

а у другому – градієнтним. Перед насосною системою інколи встановлюють

фільтри з діаметром пір 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасні-

Насосна система рідинного хроматографа складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє міняти зі-

ставши ПФ за певною програмою при градієнтному елююванні. Смі-

шення компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску.

ління (до насосів), так і при високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ і при ізократичному елююванні,

проте більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому

ном змішуванні компонентів ПФ для ізократичного процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Доцільно, однак, щоб це значення не перевищувало

шало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демп-

ферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі на-

сосів виготовляються з корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі ПФ агресивні компоненти.

Змішувачі

За своєю конструкцією змішувачі можуть бути статичними або динамічними.

ними.

У змішувачі відбувається утворення єдиної рухомої фази з від-

дільних розчинників, що подаються насосами, якщо необхідна суміш не була приготовлена ​​заздалегідь. Змішування розчинників зазвичай відбувається мимовільно, але іноді застосовуються системи з примусовим сумішшю.

шивання.

Інжектори

Інжектори можуть бути універсальними для введення проб від

1 мкл до 2 мл або дискретними для введення проби тільки певного об'єму.

ема. Обидва типи інжекторів можуть бути автоматичними (автоінжектори або автосемплери). Інжектор для введення проби (розчину) розташований не-

посередньо перед хроматографічною колонкою. Конструкція інжектора дозволяє змінювати напрямок потоку ПФ та здійснювати попереднє введення проби у петлю певного об'єму (зазвичай від 10 до 100 мкл).

Цей обсяг вказано на маркуванні петлі. Конструкція інжектора дає змогу здійснювати заміну петлі. Для введення аналізованого розчину в неав-

томатичний інжектор використовується ручний мікрошприц з об'ємом,

тельно перевершує обсяг петлі. Надлишок введеного розчину, не по-

що розміщується в петлі, скидається, і в колонку вводиться точний і завжди однаковий обсяг проби. Ручне неповне заповнення петлі знижує точ-

ність і відтворюваність дозування і, отже, погіршує точ-

ність та відтворюваність хроматографічного аналізу.

Хроматографічна колонка

Хроматографічні колонки зазвичай являють собою трубки з нержавіючої сталі, скла або пластику, заповнені сорбентом і закри-

ті з обох боків фільтрами з діаметром пор 2-5 мкм. Довжина аналітично-

ської колонки в залежності від механізму хроматографічного поділу може перебувати в діапазоні від 5 до 60 см і більше (зазвичай вона становить

10-25 см), внутрішній діаметр - від 2 до 10 мм (зазвичай 46 мм). Колонки з внутрішнім діаметром менше 2 мм використовуються в мікроколонкової хрому.

тографії. Використовуються також капілярні колонки з внутрішнім діамет-

ром близько 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративної хроматографії мають внутрішній діаметр 50 мм і більше.

Перед аналітичною колонкою можуть встановлюватися короткі ко-

лонки (предколонки) виконують різні допоміжні функції

(Чаще - захист аналітичної колонки). Зазвичай аналіз проводять при ком-

натній температурі, однак для підвищення ефективності поділу і со-

покращення тривалості аналізу може бути використане термоста-

вання колонок при температурах не вище 60 С. При більш високих температурах можлива деструкція сорбенту та зміна складу ПФ.

Нерухома фаза (сорбент)

Як сорбенти зазвичай застосовуються:

1. Силікагель, оксид алюмінію, пористий графіт використовуються в нор-

мально-фазової хроматографії. Механізм утримування в даному слу-

чаї - зазвичай адсорбція;

2. Смоли або полімери з кислотними чи основними групами. Область застосування – іонообмінна хроматографія;

3. Пористий силікагель або полімери (ексклюзивна хроматографія);

4. Хімічно модифіковані сорбенти (сорбенти з щепленими фа-

зами), приготовані найчастіше на основі силікагелю. Механізм утримування в більшості випадків - розподіл між рухомих-

ної та нерухомої фазами;

5. Хімічно модифіковані хіральні сорбенти, наприклад вироб-

водні целюлози та амілози, протеїни та пептиди, циклодекстрини,

використовуються для поділу енантіомерів (хіральна хроматогра-

Сорбенти з щепленими фазами можуть мати різний ступінь хімі-

чеської модифікації. Частинки сорбенту можуть мати сферичну або не-

правильну форму та різноманітну пористість.

Як щеплені фази найчастіше застосовуються:

– октильні групи(сорбент октилсилан або С8);

– октадецільні групи(Сорбент октадецилсилан

(ODS) або С18);

– фенільні групи(Сорбент фенілсилан);

– ціанопропільні групи(Сорбент CN);

– амінопропильні групи(сорбент NH2);

- Діольні групи (сорбент діол).

Найчастіше аналіз виконують на неполярних щеплених фазах

звернено-фазовому режимі із застосуванням сорбенту С18 .

У деяких випадках доцільніше застосовувати нормально-

фазову хроматографію При цьому використовують силікагель або полярні щеплені фази (CN, NH2, діол) в поєднанні з неполярними розчинами.

Сорбенти з щепленими фазами хімічно стійкі при значеннях pH від 2,0 до 8,0, якщо інше не обумовлюється виробником.

Частинки сорбенту можуть мати сферичну або неправильну форму та різноманітну пористість. Розмір частинок сорбенту в аналітичній ВЕРХ зазвичай становить 3-10 мкм, препаративної ВЕРХ - до 50 мкм і більше.

Використовуються також монолітні сорбенти.

Висока ефективність поділу забезпечується високою площею поверхні частинок сорбенту (яка є наслідком їх мікроскопії).

чних розмірів та наявності пір), а також рівномірністю складу сорбенту і щільною та рівномірною його упаковкою.

Детектори

Використовуються різні способи детектування. У загальному випадку ПФ з розчиненими в ній компонентами після хроматографічної колон-

ки потрапляє в комірку детектора, де безперервно вимірюється та чи інша її властивість (поглинання в УФ або видимій області спектру, флуоресценція,

показник заломлення, електропровідність та ін.). Отримана при цьому хроматограма являє собою графік залежності деякого фізичного характеру.

ського чи фізико-хімічного параметра ПФ від часу.

Найбільш поширеними є спектрофотометричні де-

тектори (включаючи діодно-матричні), що реєструють зміну опти-

ської щільності в ультрафіолетовій, видимій і часто в ближній інфрачервоній

ній областях спектру від 190 до 800 або 900 нм. Хроматограма в цьому слу-

чає є залежність оптичної щільності ПФ від часу.

Традиційно використовуваний спектрофотометричний детектор

ляє проводити детектування при будь-якій довжині хвилі в його робочому діапі-

зоні. Застосовуються також мультихвильові детектори, що дозволяють прово-

діти детектування за кількох довжинах хвиль одночасно.

За допомогою діодно-матричного детектора можна не тільки проводити детектування відразу по кількох довжинах хвиль, а й практично миттєво

венно (без сканування) отримувати оптичний спектр ПФ в будь-який момент часу, що значно спрощує якісний аналіз ком-

понентів.

Чутливість флуоресцентних детекторів приблизно в 1000 разів вища за чутливість спектрофотометричних. При цьому використовується або власна флуоресценція, або флуоресценція відповідних похідних, якщо сама речовина не флуоресціює. Сучасні-

менні флуоресцентні детектори дозволяють не тільки отримувати хромато-

грами, але й реєструвати спектри збудження та флуоресценції аналі-

зованих сполук.

Для аналізу зразків, що не поглинають в УФ та видимих ​​областях спектру (наприклад, вуглеводів), використовують рефрактометричні детектори

(Рефрактометри). Недоліки цих детекторів – їх низька (порівняно зі спектрофотометричними детекторами) чутливість та значна температурна залежність інтенсивності сигналу (детектор необхідно термостатувати).

Використовуються також електрохімічні детектори (кондуктометричні

ські, амперометричні та ін), мас-спектрометричні та Фур'є-ІК-

детектори, детектори світлорозсіювання, радіоактивності та деякі інші

Рухома фаза

У Як ПФ можуть застосовуватися різноманітні розчинники - як індивідуальні, так і їх суміші.

У нормально-фазовийхроматографії зазвичай застосовуються рідкі уг-

лівороди (гексан, циклогексан, гептан) та інші відносно неполярні

розчинники з невеликими добавками полярних органічних сполук,

які регулюють елюювальну силу ПФ.

У звернено-фазовій хроматографії до складу ПФ входять полярні ор-

ганічні розчинники (зазвичай ацетонітрил та метанол) та вода. Для опти-

мізації поділу часто використовують водні розчини з певним зна-

ченням рН, зокрема буферні розчини. Застосовують добавки неоргані-

тичних та органічних кислот, основ і солей та інші сполуки (на-

приклад, хіральні модифікатори для поділу енантіомерів на ахіраль-

ном сорбенті).

Контроль значення рН необхідно здійснювати окремо для водного компоненту, а не для його суміші з органічним розчинником.

ПФ може складатися з одного розчинника, часто з двох, при необхо-

димості – із трьох і більше. Склад ПФ вказують як об'ємне співвідношення розчинників, що входять до неї. В окремих випадках може вказуватися мас-

сове співвідношення, що має бути спеціально обумовлено.

При використанні ультрафіолетового спектрофотометричного детектора ПФ не повинна мати вираженого поглинання при вибраній для детектування довжині хвилі. Межа прозорості або оптична щільність при визна-

ної довжині хвилі розчинника конкретного виробника часто вказують

ється на упаковці.

На хроматографічний аналіз великий вплив надає ступінь чистоти ПФ, тому переважно застосовувати розчинники, випущені

ні спеціально для рідинної хроматографії (включаючи воду).

ПФ і аналізовані розчини не повинні містити нерозчинних-

ся частинок та бульбашок газу. Воду, одержану в лабораторних умовах,

водні розчини, попередньо змішані з водою органічні розчини.

рітелі, а також аналізовані розчини необхідно піддавати тонкій фільтрації та дегазації. Для цих цілей зазвичай застосовують фільтрування

під вакуумом через інертний по відношенню до цього розчинника або розчину мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм.

Система збору та обробки даних

Сучасна система обробки даних являє собою сполуч-

дружинний з хроматографом персональний комп'ютер із встановленим про-

грамним забезпеченням, що дозволяє реєструвати та обробляти хро-

матограму, а також керувати роботою хроматографа і стежити за основною

ними параметрами хроматографічної системи.

Перелік умов хроматографування, що підлягають вказівці

У приватній фармакопейній статті мають бути наведені розміри ко-

лонки, тип сорбенту із зазначенням розміру частинок, температура колонки (якщо необхідно термостатування), обсяг проби, що вводиться (об'єм петлі), со-

ставши ПФ і спосіб її приготування, швидкість подачі ПФ, детектор і умови детектування, опис градієнтного режиму (якщо використовується), час хроматографування.

ІОНООБМІННА ТА ІОННА ВЕРХ

Іонообмінна хроматографія використовується для аналізу як органічно-

ських (гетероциклічні основи, амінокислоти, білки та ін), так і неор-

ганічних (різні катіони та аніони) сполук. Поділ компо-

нентов аналізованої суміші в іонообмінній хроматографії засновано на оборотній взаємодії іонів аналізованих речовин з іонними групами.

пами сорбенту. Як сорбенти використовуються аніоніти або катіоні-

ти. Ці сорбенти є, в основному, або полімерні іоно-

обмінні смоли (зазвичай кополімери стиролу та дивінілбензолу з приві-

іонними групами), або силікагелі з щепленими іонообмінними групами. Сорбенти із групами -(СН2 )3 N+ Х– використовуються поділу аніонів, а сорбенти із групами -(СН2 )SО3 – Н+ – для поділу катіонів.

Зазвичай для поділу аніонів застосовують полімерні смоли, а для розд -

лення катіонів - модифіковані силікагелі.

Як ПФ в іонообмінній хроматографії застосовують водні розчини кислот, основ та солей. Зазвичай використовуються буферні рас-

твори, що дозволяють підтримувати певні значення рН. Можливе також використання невеликих добавок, що змішуються з водою органічно.

ських розчинників - ацетонітрилу, метанолу, етанолу, тетрагідрофурану.

Іонна хроматографія- варіант іонообмінної хроматографії,

якому для визначення концентрації іонів аналізованої речовини ви-

користується кондуктометричний детектор. Для високочутливого оп-

редіння змін електропровідності проходить через детектор ПФ фонова електропровідність ПФ повинна бути низькою.

Існують два основні варіанти іонної хроматографії.

Перший з них заснований на придушенні електропровідності електролі-

та ПФ за допомогою другої іонообмінної колонки, що знаходиться між ана-

літичною колонкою та детектором. У цій колонці відбувається нейтраліз-

ція ПФ і аналізовані сполуки потрапляють в комірку детектора в деіоні-

ній воді. Детектовані іони є єдиними іонами,

що забезпечують провідність ПФ. Недолік переважної колонки – необхідність її регенерації через досить короткі проміжки часу.

Мені. Переважна колонка може бути замінена безперервно дію-

щим мембранним подавлювачем, в якому склад мембрани безперервно про-

новлюється потоком регенеруючого розчину, що рухається в напрямку,

протилежному напрямку потоку ПФ.

Другий варіант іонної хроматографії - одноколоночна іонна хроматографія.

матографія. У цьому варіанті використовується ПФ з дуже низькою електропро-

водністю. В якості електролітів широко застосовують слабкі органічні

ські кислоти - бензойну, саліцилову або ізофталеву.

ЕКСКЛЮЗІЙНА ВЕРХ

Ексклюзивна хроматографія (гель-хроматографія) - особливий варіант ВЕРХ, заснований на розподілі молекул за їх розмірами. Розподіл

молекул між нерухомою та рухомою фазами засновано на розмірах мо-

лекул та частково на їх формі та полярності. Для поділу використовують по-

ристі сорбенти – полімери, силікагель, пористі стекла та полісахариди.

Розмір частинок сорбентів 5-10 мкм.

Перевагами пористого скла та силікагелю є швидка дифузія ПФ та молекул аналізованої речовини в пори, стійкість у різних умовах (навіть за високих температур). Полімерні сорбен-

ти є сополімерами стиролу і дивінілбензолу (це гідро-

фобні сорбенти, що використовуються з неполярними рухомими фазами) та

гідрофільні гелі, одержувані із сульфованого дивінілбензолу або поліакриламідних смол.

Можливі два граничні типи взаємодії молекул з пористою нерухомою фазою. Молекули, розмір яких більший за середній діаметр а пор, взагалі не проникають в сорбент і елююються разом з рухомою фа-

зою першими. Молекули з діаметром значно менше розміру пор сміття.

бента вільно проникають у нього, залишаються у нерухомій фазі найбільший час і елююються останніми. Молекули середніх розмірів проникають у пори сорбенту в залежності від розміру та частково в залежності від своєї форми. Вони елююються з різними часами утримування між са-

ними великими і найдрібнішими молекулами. Поділ компонентів хроматографованого зразка відбувається в результаті повторюваних ак-

тов дифузії компонентів зразка в пори сорбенту, і назад.

В екслюзійній хроматографії для характеристики утримування ви-

користується обсяг утримування, що дорівнює добутку швидкості потоку ПФ на час утримування.

Рухлива фаза. Вибір ПФ залежить від типу сорбенту. Ексклюзив-

ная хроматографія в цілому ділиться на гель-фільтраційну та гель-

проникаючу хроматографію.

Метод гель-фільтраційної хроматографії використовують для розділу

ня водорозчинних сполук на гідрофільних сорбентах. Рухливі фази є водні буферні розчини із заданим значенням рН.

У гель-проникаючій хроматографії застосовуються гідрофобні сор-

бенти та неполярні органічні розчинники (толуол, дихлорметан, тет-

рагідрофуран). Цей метод використовують для аналізу сполук, малорос-

римих у воді.

детектори. Як детектори в екслюзійній хроматографії використовуються диференціальні рефрактометричні детектори, а також спектрофотометричні детектори (у тому числі в ІЧ-області спектру).

Застосовуються також віскозиметричний та проточний лазерний детектори.

Ці детектори в комбінації з рефрактометром або іншим концентра-

ним детектором дозволяють безперервно визначати молекулярну масу по-

лімеру в ПФ.

УЛЬТРАЕФЕКТИВНА РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Ультраефективна рідинна хроматографія являє собою варіант рідинної хроматографії, що відрізняється більшою ефективно-

ністю порівняно з класичною ВЕРХ.

Особливістю ультраефективної рідинної хроматографії є

ся використання сорбентів з розміром частинок від 1,5 до 2 мкм. Розміри хро-

матографічних колонок зазвичай складають від 50 до 150 мм у довжину та від 1

до 4 мм у діаметрі. Об'єм проби, що вводиться, може становити від 1 до 50 мкл.

Хроматографічне обладнання, що використовується в класичному ва-

ріанте ВЕРХ, зазвичай спеціально адаптовано для цього виду хроматогра-

Устаткування, призначене для ультраефективної рідинної хроматографії, може використовуватися і в класичному варіанті ВЕРХ.

Рідина хроматографія

Рідина хроматографія- це вид хроматографії, у якому рухомою фазою, званої елюентом, є рідина. Нерухливою фазоюможе бути твердий сорбент, твердий носій із нанесеною на його поверхню рідиноюабо гель.

Розрізняють колонковуі тонкошароварідинну хроматографію. У колонковому варіанті через колонку, заповнену нерухомою фазою, пропускають порцію суміші речовин, що розділяється, в потоці елюенту, який рухається під тиском або під дією сили тяжіння. У тонкошарової хроматографії елюенти переміщається під дією капілярних сил по плоскому шару сорбенту, нанесеного на скляну пластинку або металеву фольгу, вздовж пористої полімерної плівки або по смужці спеціального хроматографічного паперу. Розроблено також метод тонкошарової рідинної хроматографії під тиском, коли елюенти прокачують через шар сорбенту, затиснутого між пластинами.

Існують такі види рідинної хроматографії, як аналітична(для аналізу сумішей речовин) та препаративна(Для виділення чистих компонентів).

Розрізняють рідинну хроматографію (ЖХ)в її класичному варіанті, що проводиться при атмосферному тиску, і високошвидкісну), що здійснюється при підвищеному тиску. У високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) використовують колонки діаметром до 5 мм, щільно запаковані сорбентом з частинками малого розміру (3-10 мкм). Для прокачування елюентів через колонку застосовують тиск до 3.107 Па. Такий вид хроматографії називають хроматографією високого тиску. Пропускання елюентів через колонку під високим тиском дозволяє різко збільшити швидкість аналізу та істотно підвищити ефективність поділу за рахунок використання дрібнодисперсного сорбенту.

Варіантами ВЕРХє мікроколоночна хроматографіяна наповнених сорбентом колонках малого діаметра та капілярна хроматографіяна порожнистих та наповнених сорбентом капілярних колонках. Метод ВЕРХ в даний час дозволяє виділяти, кількісно та якісно аналізувати складні суміші органічних сполук.

Рідина хроматографія - це найважливіший фізико-хімічний метод дослідження в хімії, біології, біохімії, медицині, біотехнології. Її використовують для:

· Вивчення процесів метаболізму в живих організмах лікарських препаратів;

· Діагностики в медицині;

· Аналізу продуктів хімічного та нафтохімічного синтезу, напівпродуктів, барвників, палив, мастил, нафти, стічних вод;

· Вивчення ізотерм сорбції з розчину, кінетики та селективності хімічних процесів;

· Виділення

· аналізу та поділу сумішей, їх очищення та виділення з них багатьох біологічних речовин, таких як амінокислоти, білки, ферменти, віруси, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, ліпіди, гормони.

У хімії високомолекулярних сполук та у виробництві полімерів за допомогою рідинної хроматографії аналізують якість мономерів, вивчають молекулярно-масовий розподіл та розподіл за типами функціональності олігомерів та полімерів, що необхідно для контролю продукції.

Рідинну хроматографію використовують також у парфумерії, харчовій промисловості, для аналізу забруднень навколишнього середовища, у криміналістиці.

Метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) був розроблений та впроваджений у середині 70-х років XX століття. Тоді з'явилися перші рідинні хроматографи.

Рідина хроматографія є оптимальним методом аналізу хімічно та термічно нестійких молекул, високомолекулярних речовин із зниженою летючістю. Це можна пояснити особливою роллю рухомий фази в РХ на відміну газової хроматографії: елюент виконує як транспортну функцію.

2. Основні поняття та класифікація методів рідинної хроматографії.

за механізму утримання речовин, що розділяються нерухомою фазою ЖХрозрізняють:

осадову хроматографію, засновану на різній розчинності опадів, які утворюються при взаємодії компонентів аналізованої суміші з осадником. Перевагою методу є те, що зони, що виходять уздовж сорбенту, мають різкі межі, містять опади тільки однієї речовини і часто розділені зонами чистого сорбенту. Однак цей метод поки що не знайшов широкого поширення.

· адсорбційну хроматографію , в якій поділ здійснюється в результаті взаємодії речовини, що розділяється з адсорбентом, таким як, оксид алюмінію або силікагель, які мають на поверхні активні полярні центри. Розчинник(елюент) - неполярна рідина.

Мал. Схема поділу суміші речовин методом адсорбційної хроматографії.

http://www. xumuk. ru/biologhim/bio/img014.jpg

Механізм сорбції полягає в специфічній взаємодії між полярною поверхнею сорбенту та полярними (або здатними поляризуватися) ділянками молекул аналізованого компонента (рис.). Взаємодія відбувається з допомогою донорно-акцепторного взаємодії чи утворення водневих зв'язків.

Мал. Схема адсорбційної рідинної хроматографії

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg" width="219" height="200">

Мал. . Розподільна хроматографія з щепленою фазою (нормально-фазний варіант).

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

При нормально-фазномуваріанті розподільної рідинної хроматографії як модифікатори поверхні силікагелю (щеплених фаз) використовують заміщені алкілхлорсилани, що містять полярні групи, такі як нітрильна, аміногрупа і т. д. (рис.). Застосування щеплених фаз дозволяє тонко керувати сорбційними властивостями поверхні нерухомої фази і досягати високої ефективності поділу.

Повернено-фазоварідинна хроматографія заснована на розподілі компонентів суміші між полярним елюентом та неполярними групами (довгими алкільними ланцюжками), щепленими до поверхні сорбенту (рис.). Рідше використовують варіант рідинної хроматографії із нанесеними фазами, коли рідка нерухома фаза наноситься на нерухомий носій.

Мал. . Розподільна хроматографія з щепленою фазою (навернено-фазний варіант). http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

До розподільної рідинної хроматографії відноситься і екстракційна рідинна хроматографія, в якій нерухомою фазою служить органічний екстрагент, нанесений на твердий носій, а рухомий - водний розчин сполук, що розділяються. Як екстрагенти використовують, наприклад, феноли, триалкілфосфати, аміни, четвертинні амонієві основи, а також сірковмісні фосфорорганічні сполуки. Екстракційна рідинна хроматографія застосовується для поділу та концентрування неорганічних сполук, наприклад, іонів лужних металів, актиноїдів та ін. близьких за властивостями елементів у процесах переробки відпрацьованого ядерного пального.

іонообмінну хроматографію,яка заснована на оборотному стехіометричному обміні іонів, що містяться в аналізованому розчині, на рухливі іони, що входять до складу іонітів.Залежно від знака заряду іонізуючих груп іоніти поділяють на катіонітиі аніоніти.Існують також амфотерні іоніти –амфоліти, які можуть одночасно обмінювати як катіони, так і аніони. Іонообмінна хроматографія застосовується лише для поділу заряджених частинок. В основі поділу лежить здатність іонообмінної смоли утримувати різні іони з різною силою. Іонітскладається з полімерної матриці та пов'язаних з нею активних груп, які здатні до обміну іонів. Катіонітмає кислі або слабокислі властивості, так як до його складу входять групи: - SO3H, -CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 та інші, в яких рухливими є іони водню. Аніонітиволодіють основними або слабоосновними властивостями і містять групи: = NH2 - NH2 -NR3 + -OH та інші. Поділ іонів регулюють підбором оптимальних значень рН елюентів та його іонної сили. Схематично іонний обмін можна подати реакціями:

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (катіонний обмін)

R-OH + Na + + Cl - → R-Cl + Na + + OH - (аніонний обмін)

Іоніти повинні задовольняти наступним вимогам: бути хімічно стійкими в різних середовищах, механічно міцними в сухому і особливо в набряклому стані, мати велику поглинальну здатність і здатність добре регенеруватися.

В іонообмінній (іонній) хроматографії розділені аніони (катіони) детектують у вигляді кислот (відповідних основ) високочутливим кондуктометричним детектором, де високоефективні колонки наповнені поверхнево-активним іонітом з невеликою ємністю.

іон-парну хроматографію, яку можна розглядати як комбінацію адсорбційної та іонообмінної хроматографії В основу методу покладено екстракцію іонних речовин – перенесення їх з водної фази до органічної фази у вигляді іонних пар. Для цього до рухомої фази додають протиіон, який здатний вибірково реагувати з аналізованими компонентами, перетворюючи їх на комплексні сполуки з утворенням іонної пари. Основні переваги такого варіанту полягають у тому, що одночасно можуть бути проаналізовані речовини кислотного, основного та нейтрального характеру.

лігандообмінну хроматографію, засновану на різної здатності поділюваних сполук утворювати комплекси з катіонами перехідних металів– Cu+2, Ni+2, Zn+2, Cd+2, Co+2 та ін. - та фіксуючими групами (лігандами) нерухомої фази. Частина координаційної сфери іонів металу зайнята молекулами води або іншими слабкими лігандами, які можуть витіснятися молекулами сполук, що розділяються. Такий вид хроматографії використовують для поділу оптичних ізомерів.

ексклюзивну хроматографію(ситову, гель-проникаючу, гель-фільтраційну), в якій поділ заснований на відмінностях у розмірах молекул.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg" align="right" width="429" height="319">

Мал. Схема проведення гель-проникаючої хроматографії

афінну хроматографію(біоспецифічну), засновану на тому, що багато біологічно активних макромолекул, наприклад, ферменти можуть специфічно зв'язуватися з певним реагентом. Реагент закріплюється на носії (часто агарозі), потім промивається сумішшю, що аналізується. На полімері затримується лише необхідна макромолекула (рис.).

Мал. Схема афінної хроматографії

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

Потім її видаляють з полімеру, пропусканням розчину сполуки, що володіє ще більшою спорідненістю до макромолекули. Особливо ефективна така хроматографія в біотехнології та біомедиці для виділення ферментів, білків, гормонів.

В залежності від способу переміщення речовинирозрізняють такі варіанти рідинної хроматографії: проявний, фронтальнийі витіснювальний.
Найчастіше використовують проявнийваріант, при якому в колонку в потоці елюенти вводять порцію суміші, що розділяється. Вихід компонентів суміші із колонки реєструється на хроматограмі у вигляді піків. (Мал.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg" width="291" height="165">

Мал. Схема проявного варіанта хроматографії

Висотаабо площа піківхарактеризує концентрацію компонентів, а утримувані обсяги – якісний склад суміші. Ідентифікацію компонентів зазвичай проводять за збігом часів утримання зі стандартними речовинами, також використовують хімічні або фізико-хімічні методи.

При фронтальномуваріанті (рис.) через колонку безперервно пропускають суміш речовин, що розділяється, яка грає роль рухомої фази. У результаті можна одержати у чистому вигляді лише речовину, яка найменше сорбується в колонці.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg" width="279" height="145">

Мал. Схема фронтального варіанта хроматографії

Хроматограма в цьому випадку є ступенями, висоти яких пропорційні концентраціям компонентів; утримувані обсяги визначають за часом утримання компонентів. При диференціюванні такої хроматограми одержують картину, аналогічну тій, яку одержують у проявному варіанті.

У витіснювальномуваріанті компоненти суміші, введеної в колонку, витісняються елюентом, який адсорбується сильніше за будь-який компонент. У результаті отримують примикають одна до одної фракції поділюваних речовин Порядок виходу компонентів визначається силою взаємодії їх з поверхнею сорбенту (рис.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg" width="320" height="175">

Мал. Схема витіснювального варіанта хроматографії

3. Основні хроматографічні величини та їх визначення.

При поділі речовин за допомогою рідинної хроматографії можуть бути використані, як зазначено вище, проявний, фронтальний та витіснювальний варіанти. Найчастіше використовують проявний варіант, при якому в колонку в потоці елюенти вводять порцію суміші, що розділяється. Вихід компонентів суміші із колонки реєструється на хроматограмі у вигляді піків. Із хроматограми (рис.) визначають:

часи утримування несорбується (t0), розділених компонентів (tR1, tR2, tR3 і т. д.); ширину основ піків (tw1, tw2 тощо).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif" width="61" height="24 src=">;

b) виправлений утримуваний об'єм компонента ,

де t"R -виправлений час утримання компонента;

c) коефіцієнт ємності колонки по відношенню до цього компонента ;

d) ефективність колонкихарактеризується числом еквівалентних теоретичних тарілок

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif" width="129" height="51 src=">;

f) Дозвіл https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif" width="203 height=51" height="51">

Коефіцієнт ємності k" істотно впливає на величину R S: при зміні kвід 0 до 10 (оптимальні межі) R S сильно зростає. Значення k"визначається подвоєною поверхнею сорбенту та його кількістю у колонці, а також константою адсорбційної рівноваги (константою Генрі).

Коефіцієнт селективності αвизначається різницею констант адсорбційної рівноваги двох компонентів, що розділяються. При збільшенні (від 1 до ~ 5) R S різко зростає, при подальшому збільшенні α- змінюється мало. Селективність колонки залежить від таких факторів, як хімічна структура поверхні сорбенту, склад елюентів, температура колонки і будова сполук, що розділяються. Так як сорбція хроматографованих речовин в рідинній хроматографії визначається попарною взаємодією трьох основних компонентів системи - сорбенту, речовин, що розділяються, і елюентів, то зміна складу елюентів - це зручний спосіб оптимізації процесу поділу.

Ефективність колонкизалежить від розміру частинок і структури пор адсорбенту, від рівномірності набивання колонки, в'язкості елюентів і швидкості масообміну. Подовження колонки не завжди призводить до поліпшення поділу, так як зростає опір колонки, збільшується тиск елюентів на вході і час проведення досвіду, знижується чутливість і точність аналізу через розширення піку компонента, що аналізується. Якщо піки двох речовин на хроматограмі поділяються практично повністю. Зі зростанням R S збільшується час розподілу. При R S < 1 - поділ незадовільний. У препаративній хроматографії у зв'язку з введенням порівняно великих кількостей речовин, що розділяються, колонка працює з перевантаженням. При цьому знижується коефіцієнт ємності, зростає висота, еквівалентна теоретичній тарілці, що призводить до зменшення роздільної здатності.

4. Адсорбенти

Хроматографічне поділ суміші буде ефективним, якщо правильно підібрані адсорбент та розчинник (елюенти).

Адсорбент не повинен хімічно взаємодіяти з компонентами, що розділяються, проявляти каталітичну дію на розчинник. Також необхідно, щоб адсорбент мав вибірковість по відношенню до компонентів суміші. Правильно підібраний адсорбент повинен мати максимальну поглинальну здатність.

Розрізняють полярні (гідрофільні)і неполярні (гідрофобні) адсорбенти. Слід пам'ятати про те, що адсорбційна спорідненість полярних речовин до полярних сорбентів значно вища, ніж неполярних.

Як адсорбенти застосовують оксид алюмінію, активоване вугілля, силікагель, цеоліти, целюлозу та деякі мінерали.

Оксид алюмініюAl2O3 – амфотерний адсорбент. (Мал.) На ньому можна розділяти суміші речовин у полярних, так і у неполярних розчинниках. Нейтральний оксид алюмінію використовують зазвичай для хроматографування з неводних граничних розчинів вуглеводнів, альдегідів, спиртів, фенолів, кетонів і ефірів.

Мал. Оксид алюмінію для хроматографії

http://images. /542857_w200_h200_product5.jpg

Активність Al2O3 залежить від вмісту вологи. Найвищу активність має безводний оксид алюмінію. Її умовно беруть за одиницю. При необхідності можна приготувати оксид алюмінію з різним вмістом вологи шляхом змішування оксиду алюмінію з водою (шкала Брокмана).

Залежність активності оксиду алюмінію від вмісту вологи

Наприклад, для поділу вуглеводнів застосовують Al2O3 з активністю 1,5-2; для поділу спиртів та кетонів – 2-3,5.

Питома поверхня оксиду алюмінію 230–380 м2/г.

Силікагель(гідроксилований або хімічно модифікований) – це висушений желатиноподібний діоксид кремнію, який одержують із пересичених розчинів кремнієвих кислот ( n SiO2 · m H2O) при pH >5-6. (Мал.) Твердий гідрофільний сорбент.

Мал. Силікагель

http://www. silicagel. /

http://silikagel. ru/images/askg. gif

Розмір частинок силікагелю в аналітичних колонках 3-10 мкм, препаративних - 20-70 мкм. Малий розмір часток збільшує швидкість масообміну та підвищує ефективність колонки. Сучасні аналітичні стовпчики мають довжину 10-25см. Вони заповнені силікагелем розміром частинок 5 мкм і дозволяють розділити складні суміші з 20-30 компонентів. При зменшенні розміру частинок до 3-5 мкм зростає ефективність колонки, а й зростає її опір. Так для досягнення швидкості потоку елюентів 0,5-2,0 мл/хв потрібен тиск (1-3) 107Па. Силікагель витримує такий перепад тиску, гранули полімерних сорбентів більш еластичні і деформуються. Останнім часом розроблені механічно міцні полімерні сорбенти макропористої структури із густою сіткою, які за своєю ефективністю наближаються до силікагелів. Форма частинок сорбенту розміром 10 мкм і вище не має великого впливу на ефективність колонки, проте віддають перевагу сорбентам сферичної форми, які дають більш проникну упаковку.

Мал. Силікагель сферичної форми

http://images. /6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http:///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Внутрішня структура частки силікагелю є системою сполучених каналів. Для рідинної хроматографії використовують сорбенти з діаметром пір 6-25 нм. Поділ рідинної хроматографії проводять, в основному, на силікагелях, модифікованих реакцією алкіл - і арилхлорсиланов або алкілетоксисиланів з силанольними групами поверхні. За допомогою таких реакцій прищеплюють групи С8Н17-, С18Н37- або С6Н5-(для отримання сорбентів з гідрофобізованої поверхнею), нітрильні, гідроксильні групи та ін.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg" width="166" height="116 src=">

Мал. Структура модифікованого силікагелю

Силікагелівикористовують у хроматографії для поділу сумішей нафтопродуктів, вищих жирних кислот, їх складних ефірів, ароматичних амінів, нітропохідних органічних сполук. Силікагель – гідрофільний сорбентлегко змочується водою. Тому його не можна використовувати для сорбції водних розчинів. Активність силікагелю залежить від вмісту у ньому води: що менше у ньому води, то більше активність (шкала Брокмана).

Залежність активності силікагелю від вмісту вологи

Питома поверхня силікагелів дорівнює 500-600 м2/р.

Активоване вугілляє формою вуглецю, який у процесі обробки стає надзвичайно пористим і набуває дуже великої площі поверхні, призначеної для адсорбції або хімічних реакцій. (рис.) Вони мають питому поверхню 1300-1700 м2/г.

Мал. Активоване вугілля

http://e-catalog. rusbiz. ru/user_images/ru/prod_picture/58035161249b9016f64372.jpg

Основний вплив на структуру пір активованого вугілля роблять вихідні матеріали для їх отримання. Активоване вугілля на основі шкаралупи кокосів характеризується більшою часткою мікропор (до 2 нм), на основі кам'яного вугілля - більшою часткою мезопор (2-50 нм). Велика частка макропора характерна для активованого вугілля на основі деревини (понад 50 нм). Мікропори особливо добре підходять для адсорбції молекул невеликого розміру, а мезопори – для адсорбції більших органічних молекул.

Цеоліти (молекулярні сита)– пористі кристалічні алюмосилікати лужних та лужноземельних металів природного та синтетичного походження. (Мал.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg" width="211 height=211" height="211">

Мал. Цеоліти

http://www. zeolite. spb. ru/_img/_36mm. jpg

http://kntgroup. ru/thumb. php? file=/uploads/produkts/6.jpg&x_width=250

Відомі чотири типи цеолітів (A, X, Y, M), що мають різну кристалічну структуру. Залежно від катіону цеоліти позначають так: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Особливістю цеолітівє те, що пори кристалів мають розміри порядку 0,4-1 нм, порівняні з розмірами молекулбагатьох рідких чи газоподібних речовин. Якщо молекули речовини здатні проникати в ці пори, відбувається адсорбція в порах кристалів цеолітів. Більші молекули речовини не адсорбуються. Підбираючи цеоліти з різними розмірами часу, можна чітко розділити суміші різних речовин.

Питома поверхня цеолітів 750-800 м2/р.

При виборі адсорбенту необхідно враховувати будову речовин та їхню розчинність. Наприклад, граничні вуглеводні адсорбуються погано, а ненасичені (мають подвійні зв'язки) – краще. Функціональні групи посилюють здатність речовини до адсорбції.

5. Елюенти

При виборі розчинника (елюентів) потрібно враховувати природу адсорбенту і властивості речовин у суміші, що розділяється. Елюенти повинні добре розчиняти всі компоненти хроматографованої суміші, мати низьку в'язкість, забезпечувати необхідний рівень селективності, бути дешевими, нетоксичними, інертними, сумісними з методами детектування (наприклад, з УФ детектором не можна використовувати як елюент бензол).

У нормально-фазній хроматографії зазвичай використовують вуглеводні (гексан, гептан, ізооктан, циклогексан) з додаванням невеликих кількостей хлороформу СНСl3, ізо-пропанолу з-С3Н7ОН, діізопропілового ефіру; в обернено-фазній хроматографії - суміш води з ацетонітрилом CH3CN, метанолом СН3ОН, етанолом С2Н5ОН, діоксаном, тетрагідрофуран, диметилформамід. Для виділення окремих компонентів суміші, що розділилися при хроматографуванні, часто проводять їхнє послідовне вимивання (елюювання). З цією метою застосовують розчинники з різною десорбційною здатністю. Розчинники мають в своєму розпорядженні в порядку зменшення десорбуючої здатності в полярних адсорбентах - елюотропний ряд Траппе. Якщо компоненти суміші, що розділяються, мають близькі значення k" (коефіцієнт ємності колонки по відношенню до даного компонента), то хроматографують одним елюентом. Якщо окремі компоненти суміші сильно утримуються сорбентом, використовують серію елюентів зростаючої сили.

Елюотропний ряд розчинників

6. Апаратура для рідинної хроматографії

У сучасній рідинній хроматографії використовують прилади різного ступеня складності – від найпростіших систем до хроматографів високого класу.
Сучасний рідинний хроматограф включає: ємності для елюентів, насоси високого тиску, дозатор, хроматографічну колонку, детектор, прилад, що реєструє, систему управління та математичні обробки результатів.

На рис. представлена ​​блок-схема рідинного хроматографа, що містить мінімально необхідний набір складових частин у тому чи іншому вигляді, присутніх в будь-якій хроматографічній системі.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg" width="361" height="254 src=">

Мал. Схема рідинного хроматографа: 1 - резервуар для рухомої фази, 2 - насос, 3 - інжектор, 4 - колонка, 5 - термостат, 6 - детектори, 7 - реєструюча система, 8 - комп'ютер.

Резервуардля рухомої фази, повинен мати достатню для проведення аналізу місткість та пристрій для дегазації розчинника, щоб виключити утворення в колонці та детекторі бульбашок розчинених в елюенті газів.

Насоспризначений для створення постійного потоку розчинника. Його конструкція визначається, перш за все, робочим тиском у системі. Для роботи у діапазоні 10-500 МПа використовують насоси плунжерного (шприцевого) типу. Недоліком є ​​необхідність періодичних зупинок для заповнення елюентом. Для простих систем із невисокими робочими тисками 1-5 МПа застосовують недорогі перистальтичні насоси. Елюенти надходять у насос через фільтр, що затримує пилові частинки (більше 0,2 мкм). Іноді через елюенти пропускають невеликий струм гелію для видалення розчиненого повітря та запобігання утворенню бульбашок у детекторі (особливо у разі водних та полярних елюентів). В аналітичних хроматографах для подачі елюентів у колонку використовують поршневі насоси із системою зворотного зв'язку, що дозволяють згладжувати пульсацію потоку в межах 1-2% і забезпечувати об'ємні швидкості від 0,1 до 25 мл/хв при тиску до ~ 3.107 Па. У мікроколонній хроматографії об'ємні швидкості потоку елюентів значно нижчі - 10-1000 мкл/хв. У разі градієнтного елюювання використовують кілька насосів, які управляються програматором і подають у камеру змішування 2-3 компоненти елюентів, залишаючи постійною загальну швидкість потоку. Для введення проби в колонку, що знаходиться під великим тиском, без зупинки потоку використовують спеціальні мікродозують крани, пов'язані з петлею відомого об'єму для досліджуваної проби розчину. Розроблено дозувальні системи з автоматичним відбором та введенням проби за допомогою мікродозуючих кранів або шприців.

Інжекторзабезпечує введення проби сумішікомпонентів, що розділяються в колонку з досить високою відтворюваністю. Прості системи введення проби - "stop-flow" вимагають зупинки насоса і тому менш зручні, ніж петлеві дозатори, розроблені фірмою Reodyne.

Колонкидля ВЕРХ виготовляють найчастіше з нержавіючої сталевої полірованої трубки довжиною 10-25см і внутрішнім діаметром 3-5мм.

Мал. Хроматографічні колонки для рідинної хроматографії

Використовують також скляні колонки, поміщені у металевий кожух; у мікроколонковій хроматографії - набивні металеві колонкиз внутрішнім діаметром 1,0-1,5мм, набивні скляні мікроколонкидіаметром 70-150 мкм та порожнисті капілярні колонкидіаметром 10-100 мкм; у препаративній хроматографії – колонки діаметром від 2 до 10см і більше. Для рівномірного та щільного заповнення колонок сорбентом використовують суспензійний метод набивання. Суспензію готують із сорбенту та відповідної органічної рідини, яка подається під тиском до 5·107 Па в колонку. Для визначення вихідних із колонки розділених компонентіввикористовують детектори. Постійність температуризабезпечується термостатом.

Детекторидля рідинної хроматографії мають проточну кювету, в якій відбувається безперервний вимір будь-якої властивості елюенту, що протікає. Вони мають бути дуже чутливими. Для збільшення чутливості детектора іноді застосовують дериватизацію компонентів суміші після колонки. Для цього з потоком елюентів вводять такі реагенти, які, взаємодіючи з розділеними речовинами, утворюють похідні з більш вираженими властивостями, наприклад, сильніше поглинають в УФ або видимій області спектра або мають більшу здатність флуоресціювати. Іноді дериватизацію проводять до хроматографічного аналізу та поділяють похідні, а не вихідні речовини. Найбільш популярними типами детекторівзагального призначення є рефрактометри, що вимірюють показник заломлення, і спектрофотометричні детектори, що визначають оптичну густину розчинникана фіксованій довжині хвилі (як правило, в ультрафіолетовій ділянці). До переваг рефрактометрів(і недоліків спектрофотометрів) слід віднести низьку чутливість до типу визначається з'єднання, яке може і не містити хромофорних груп З іншого боку, застосування рефрактометрів обмежено ізократичними системами (з постійним складом елюентів), так що використання градієнта розчинників у цьому випадку неможливе.

Диференціал" диференціального підсилювача і самописця. Бажана також наявність інтегратора, що дозволяє розраховувати відносні площі отримуваних піків У складних хроматографічних системах використовується блок інтерфейсу, що з'єднує хроматограф з персональним комп'ютером, який здійснює не тільки збір та обробку інформації, але й керує приладом, розраховує кількісні характеристики та, в деяких випадках, якісний склад сумішей. Мікропроцесорзабезпечує автоматичне введення проби, зміна по заданій програмі складу елюентупри градієнтному елююванні, підтримка температури колонки.

Bruker".Мал. Рідинний хроматограф Jasco

Запитання для самоперевірки

Що таке рідинна хроматографія? Назвіть її види, сфери застосування. Перерахуйте просновні хроматографічні величини та їх визначення Які види рідинної хроматографії існують залежно від механізму утримання речовин, що розділяються нерухомою фазою РХ? Які види хроматографії існують залежно від способу переміщення речовини? Які речовини використовують як адсорбенти? Чим вони відрізняються? Що служить рідкою рухомою фазою – елюентом? Вимоги до розчинників. У чому відмінність розподільчої хроматографії від адсорбційної хроматографії? Перерахуйте основні частини схеми рідинного хроматографа та їх призначення.

Список використаної литературы

1 «Рідинна хроматографія в медицині»

http://journal. issep. RSSI. ru/articles/pdf/0011_035.pdf

2 «Ознайомлення з методами високоефективної рідинної хроматографії»

http://www. chemnet. ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr. html

3 « Рідина хроматографія »

http://e-science. ru/index/?id=1540

4 «Хроматографія»

http://belchem. narod. ru/chromatography1.html

У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) характер процесів, що відбуваються в хроматографічній колонці, загалом ідентичний з процесами в газовій хроматографії. Відмінність полягає лише у застосуванні як нерухомої фази рідини. У зв'язку з високою щільністю рідких рухомих фаз і великим опором колонок газова та рідинна хроматографія сильно розрізняються за апаратурним оформленням.

У ВЕРХ як рухомі фази зазвичай використовують чисті розчинники або їх суміші.

Для створення потоку чистого розчинника (або сумішей розчинників), званого рідинної хроматографії елюентом, використовуються насоси, що входять в гідравлічну систему хроматографа.

Адсорбційна хроматографія здійснюється внаслідок взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Різниця у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досяжний при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом, поверхнею та діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію та інші адсорбенти. Основна причина цього:

недостатня механічна міцність, що не дозволяє упаковувати та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ;

силікагель порівняно з оксидом алюмінію має ширший діапазон пористості, поверхні та діаметру пор;Значно більша каталітична активність оксиду алюмінію призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби чи його незворотній хемосорбції.

Детектори для ВЕРХ

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) використовується для детектування полярних нелетких речовин, які з будь-яких причин не можуть бути переведені у зручну форму для газової хроматографії, навіть у вигляді похідних. До таких речовин, зокрема, відносять сульфонові кислоти, водорозчинні барвники та деякі пестициди, наприклад, похідні феніл - сечовини.

Детектори:

УФ – детектор на діодній матриці. «Матриця» фотодіодів (їх більше двохсот) постійно реєструє сигнали в УФ і видимій області спектру, забезпечуючи таким чином запис УФ-В-спектрів в режимі сканування. Це дозволяє безперервно знімати при високій чутливості неспотворені спектри компонентів, що швидко проходять через спеціальну комірку.

У порівнянні з детектуванням на одній довжині хвилі, яке не дає інформації про «чистоту» піку, можливості порівняння повних спектрів діодної матриці забезпечують отримання результату ідентифікації з більшим ступенем достовірності.

Флуоресцентний детектор.Велика популярність флуоресцентних детекторів пояснюється дуже високою селективністю та чутливістю, і тим фактором, що багато забруднювачів довкілля флуоресціюють (наприклад, поліароматичні вуглеводні).

Електрохімічний детекторвикористовуються для детектування речовин, які легко окислюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- та галогенпохідні, кетони альдегіди, бензидини.

Хроматографічне поділ суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)

Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинній колонковій хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так з великою молекулярною масою.

Залежно від типу сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).

При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖГ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.

детектори.Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.

Безперервно детектований сигнал реєструється самописцем. Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хроматограмі використовують для ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.

Вступ.

Бурхливий розвиток рідинної хроматографії в останні 10 років зумовлено, головним чином, інтенсивною розробкою теоретичних основ та практичним використанням її високоефективного варіанту, а також створенням та промисловим випуском необхідних сорбентів та апаратури.

Відмінною особливістю високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) є використання сорбентів з розміром зерен 3-10 мкм, що забезпечує швидке масоперенесення при дуже високій ефективності поділу.

Нині ВЕРХ за темпами розвитку вийшла перше місце серед інструментальних методів, обігнавши навіть газову хроматографію. Найважливіша перевага ВЕРХ у порівнянні з газовою хроматографією - можливість дослідження практично будь-яких об'єктів без будь-яких обмежень за їх фізико-хімічними властивостями, наприклад, температури кипіння або молекулярної маси.

Сьогодні ВЕРХ являє собою добре оформлений інструментальний метод, який широко застосовують у різних галузях науки і техніки. Особливо велике його значення у таких найважливіших галузях, як біохімія, молекулярна біологія, контроль забруднень навколишнього середовища, а також у хімічній, нафтохімічній, харчовій та фармацевтичній промисловості.

оскільки необхідно враховувати низку вельми специфічних вимог, зумовлених такими особливостями методики.

а. Колонки для ВЕРХ наповнюють носієм із дуже малим діаметром частинок. В результаті при таких об'ємних швидкостях розчинника, які необхідні швидкого поділу проби, на колонці створюється високий тиск.

б. Детектори, що застосовуються у ВЕРХ, чутливі до флуктуації потоку та тиску елюентів (шуми). Більше того, при застосуванні концентраційних детекторів потрібна ще більш висока стабільність об'ємної швидкості елюентів.

в. Процес хроматографічного поділу супроводжується рядом антагоністичних ефектів, так, наприклад, диспергування зразка в рухомій фазі веде до змішування компонентів, що розділяються, і знижує максимальну концентрацію речовини в елююваному піку (у детекторі). Диспергування спостерігається всіх ділянках системи від точки введення проби до детектора.

р. Розчинники, які виконують роль рухомої фази, часто здатні викликати корозію апаратури. Це в першу чергу відноситься до розчинників, що використовуються в обернено-фазовій хроматографії, яка переважна в біохімічних додатках ВЕРХ.

Специфіку ВЕРХ як інструментальної методики необхідно враховувати у процесі розробки, створення та експлуатації цих систем. Для створення комерційних зразків хроматографічних систем та їх компонентів, досить надійних, простих і безпечних у роботі з прийнятним співвідношенням між ціною та технічними характеристиками, знадобилося понад десять років пошуків та досліджень. тенденції до зменшення колонок (як довжини, так і діаметра), що намітилися останнім часом, змушують пред'являти нові вимоги до інструментів.

1.1. ЕФЕКТИВНІСТЬІСЕЛЕКТИВНІСТЬ

Хроматографія - це метод поділу компонентів суміші, заснований на відмінності в рівноважному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, одна з яких нерухома, а інша рухома. Компоненти зразка рухаються по колонці, коли вони знаходяться в рухомій фазі, і залишаються на місці, коли знаходяться в нерухомій фазі Чим більше спорідненість компонента до нерухомої фази і чим менше - до рухомої, тим повільніше він рухається по колонці і тим довше в ній утримується. прийнятний проміжок часу суміші на окремі смуги (піки) компонентів у міру їх просування колонкою з рухомою фазою.

З цих загальних уявлень ясно, що хроматографічне поділ можливе, тільки в тому випадку, якщо компоненти зразка, потрапляючи в колонку при введенні проби, по-перше, будуть розчинені в рухомій фазі і, по-друге, взаємодіятимуть (утримуватись) з нерухомою фазою . Якщо при введенні проби якісь компоненти знаходяться не у вигляді розчину, вони будуть відфільтровані і не братимуть участі в хроматографічному процесі. Так само компоненти, які не взаємодіють з нерухомою фазою, пройдуть через колонку з рухомою фазою, не поділяючись на компоненти.

Приймемо умову, що якісь два компоненти розчиняються в рухомій фазі і взаємодіють з нерухомою фазою, тобто хроіатографічний процес може протікати без порушень. У цьому випадку після проходження суміші через колонку можна отримати хроматограми виду а, бабо в(Рис. 1.1). Ці хроматограми ілюструють хроматографічні поділу, що відрізняються ефективністю. (аі б) при рівній селективності та селективністю (бі в)за рівної ефективності.

Ефективність колонки тим вище, що вже пік виходить при тому часі утримування. Ефективність колонки вимірюється числом теоретичних тарілок (ЧТТ) N: чим вище еф-

Мал. 1.2. Параметри хроматографічного піку та розрахунок числа теоретичних тарілок:

t R - час утримання піку; h - Висота піку; Wj/j – ширина піку на половині його висоти

Мал. 1.1. Вид хроматограми в залежності від ефективності та селективності колонки:

а- нормальна селективність, знижена ефективність (менше теоретичних тарілок); б - звичайні селективність та ефективність; в -звичайна ефективність, підвищена селективність (більше відношення часів утримання компонентів)

ефективність, тим більше ЧТТ, тим менше розширення піку спочатку вузької смуги в міру проходження її через колонку, тим пік на виході з колонки. ЧТТ характеризує число ступенів встановлення рівноваги між рухомою та нерухомою фазами.

Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, та довжину колонки L (мкм), а також середній діаметр зерна сорбенту d c (мкм), легко отримати значення висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ВЕТТ), а також наведеної висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ПВЕТ):

ВЕТ = L/ N

ПВЕТ = B3TT/d c .

Маючи значення ЧТТ, ВЕТТ та ПВЕТ, можна легко порівнювати ефективність колонок різних типів, різної довжини, заповнених різними за природою та зерненням сорбентами. Порівнюючи ЧТТ двох колонок однієї довжини, порівнюють їхню ефективність. При порівнянні ВЕТТ порівнюють колонки із сорбентами однакового зернення, що мають різну довжину. Нарешті, величина ПВЕТ дозволяє для будь-яких двох колонок оцінити якість сорбенту, по-перше, і якість заповнення колонок, по-друге, незалежно від довжини колонок, зернення сорбентами його природи.

Селективність колонки грає велику роль досягненні хроматографічного поділу.

Селективність колонки залежить від багатьох чинників, і мистецтво експериментатора великою мірою визначається вмінням впливати на селективність поділу. Для цього в руках хроматографіста знаходяться три дуже важливі фактори: вибір хімічної природи сорбенту, вибір складу розчинника та його модифікаторів та облік хімічної структури та властивостей компонентів, що розділяються. Іноді помітний вплив на селективність має зміна температури колонки, що змінює коефіцієнти розподілу речовин між рухомою та нерухомою фазами.

При розгляді поділу двох компонентів на хроматограмі та його оцінці важливим параметром є дозвіл R s, яке пов'язує часи виходу і ширину піків обох компонентів, що розділяються.

Роздільна здатність як параметр, що характеризує поділ піків, збільшується в міру зростання селективності, що відображається зростанням чисельника, і зростання ефективності, що відображається зниженням значення знаменника через зменшення ширини піків. Тому швидкий прогрес рідинної хроматографії призвів до зміни поняття "рідинна хроматографія високого тиску" - воно було замінено на "рідинну хроматографію високого дозволу" (при цьому скорочений запис терміна англійською мовою зберігся HPLC як найбільш правильно характеризує напрямок розвитку сучасної рідинної хроматографії).

Таким чином, розмивання в колонці зменшується і ефективність підвищується, коли використовують дрібніший сорбент, більш рівномірний за складом (вузька фракція), щільніше і рівномірно упакований в колонці, при використанні тонших шарів щепленої фази, менш в'язких розчинників і оптимальних швидкостей потоку.

Однак поряд з розмиванням смуги хроматографічної зони в процесі поділу в колонці може відбуватися також і розмивання її в пристрої для введення проби, в сполучних капілярах інжектор - колонка і колонка - детектор, в осередку детектора і в деяких допоміжних пристроях (мікрофільтри для уловлювання механічно проби, що встановлюються після інжектора, передколонки, реактори-змійовики та ін.)- Розмивання при цьому тим більше, чим більший позаколоночний обсяг у порівнянні з утримуваним обсягом піку. Має значення і те, де знаходиться мертвий об'єм: чим вже хроматографічна покликання, тим більше розмивання дасть мертвий об'єм. Тому особливу увагу слід приділяти конструюванню тієї частини хроматографа, де хроматографічна зона найбільш вузька (інжектор та пристрої від інжектора до колонки) - тут позаколоночне розмивання найнебезпечніше і позначається найбільш сильно. Хоча вважається, що у добре сконструйованих хроматографах джерела додаткового позаколонкового розмивання мають бути зведені до мінімуму, проте кожен новий прилад, кожна переробка хроматографа повинні обов'язково закінчуватися тестуванням на колонці та порівнянням отриманої хроматограми з паспортною. Якщо спостерігається спотворення піку, різке зниження ефективності, слід ретельно проінспектувати нововведені в систему капіляри та інші пристрої.

Розмивання поза колонкою і його неправильна оцінка можуть призвести до значної (більше 50%) втрати ефективності, особливо в тих випадках, коли відносно давно сконструйовані хроматографи намагаються використовувати для високошвидкісної ВЕРХ, мікроколонкової ВЕРХ та інших варіантів сучасної ВЕРХ, що потребують мікроінжекторів, сполучних капілярів діаметром 0,05-0,15 мм мінімальної довжини, колонок місткістю 10-1000 мкл, детекторів з мікрокюветами ємністю 0,03-1 мкл та з високою швидкодією, високошвидкісних самописців та інтеграторів.

1.2. УТРИМАННЯ І СИЛА РОЗЧИНАЧА

Для того, щоб аналізовані речовини поділялися на колонці, як уже згадувалося вище, коефіцієнт ємності k" має бути більше 0, тобто речовини повинні утримуватися нерухомою фазою, сорбентом. Однак коефіцієнт ємності не повинен бути занадто великим, щоб отримати прийнятний час елюювання. Якщо для даної суміші речовин обрано нерухому фазу, яка їх утримує, то подальша робота з розробки методики аналізу полягає у виборі такого розчинника, який забезпечив би в ідеальному випадку різні для всіх компонентів, але прийнятно не дуже великі k". Цього домагаються, змінюючи елюювальну силу розчинника.

У разі адсорбційної хроматографії на силікагелі або оксиді алюмінію, як правило, силу двокомпонентного розчинника (наприклад, гексану з добавкою ізопропанолу) збільшують, збільшуючи вміст полярного компонента (ізопропанолу), або ж зменшують, зменшуючи вміст ізопропанолу. Якщо вміст полярного компонента стає занадто малим (менше 0,1%), слід замінити його більш слабким по елююючій силі. Так само надходять, замінюючи на інші або полярну, або неполярну складову і в тому випадку, якщо дана система не забезпечує бажаної селективності по відношенню до компонентів суміші, що цікавлять. При підборі систем розчинників беруть до уваги як розчинність компонентів суміші, так і елюотропні ряди розчинників, складені різними авторами.

Приблизно так само підбирають силу розчинника у разі використання щеплених полярних фаз (нітрил, аміно, діол, нітро та ін), враховуючи можливі хімічні реакції та виключаючи небезпечні для фази розчинники (наприклад і кетони для амінофази).

У разі звернено-фазної хроматографії силу розчинника збільшують, підвищуючи вміст в елюенті органічної складової (метанолу, ацетонітрилу або ТГФ) та зменшують, додаючи більше води. Якщо не вдається досягти бажаної селективності, використовують іншу органічну складову або намагаються змінити її за допомогою різних добавок (кислот, іо-парних реагентів та ін.).

При поділах методом іонообмінної хроматографії силу розчинника змінюють, збільшуючи або зменшуючи концентрацію буферного розчину або змінюючи рН, деяких випадках використовують модифікацію органічними речовинами.

Однак, особливо у випадку складних природних і біологічних сумішей, часто не вдається підібрати силу розчинника таким чином, щоб усі компоненти проби елюювалися за прийнятний термін. Тоді доводиться вдаватися до градієнтного елюювання, тобто використовувати розчинник, элюирующая сила якого в процесі аналізу змінюється так, що вона постійно збільшується за заздалегідь заданою програмою. Таким прийомом вдається домогтися елюювання всіх складних складових сумішей за відносно короткий проміжок часу і їх поділу на компоненти у вигляді вузьких піків.

1.3. РОЗМІР ЧАСТОК СОРБЕНТУ, ПРОНИЦЬКІСТЬ І ЕФЕКТИВНІСТЬ

Розглядаючи розмивання у колонці, ми вказували, що ефективність колонки (ВЕТТ) залежить від розміру частинок сорбенту. Великою мірою бурхливий розвиток ВЕРХ за останні 10-12 років було обумовлено, по-перше, розробкою способів отримання сорбентів з розміром частинок від 3 до 10 мкм і з вузьким фракційним складом, що забезпечують високу ефективність при хорошій проникності, по-друге, розробкою способів заповнення цими сорбентами колонок і, по-третє, розробкою та серійним випуском рідинних хроматографів, що мають розраховані на високі тиски насоси, інжектори та детектори з кюветами малого обсягу, здатні реєструвати піки малого обсягу.

Для добре упакованих суспензійним способом колонок наведена висота, еквівалентна теоретичній тарілці (ПВЕТТ), може становити 2 незалежно від того, чи для упаковки використовували частинки з розміром 3, 5, 10 або 20 мкм. У цьому випадку ми отримаємо відповідно колонки (при стандартній довжині 250 мм) ефективністю 41670, 25000, 12500 і 6250 т.т. Здається природним вибрати найбільш ефективну колонку, заповнену частинками розміром 3 мкм. Однак за цю ефективність доведеться заплатити використанням при роботі дуже високого тиску і відносно невисокою швидкістю поділу, так як наявний насос, швидше за все, буде прокачувати через таку колонку розчинник з високою об'ємною швидкістю. Тут ми якраз і стикаємося з питанням зв'язку розміру частинок сорбенту, ефективності та проникності колонок.

Якщо висловити звідси фактор опору колонки - безрозмірну величину, отримаємо наступне рівняння:

Фактор опору для колонок, упакованих мікрочастинками одного виду по тому самому способу, змінюється незначно і становить наступні значення:

Вигляд часток ».... Неправильна Сферична

форма форма

Суха упаковка. . . . . 1000-2000 800-1200

Суспензійна упаковка. . . 700-1500 500-700

Тиск на вході в колонку пропорційно до лінійної швидкості потоку, фактору опору колонки, в'язкості розчинника і довжині колонки і обернено пропорційно квадрату діаметра частинок.

Застосувавши цю залежність для описаних вище колонок з частинками діаметром 3, 5, 10 і 20 мкм і припустивши постійними лінійну швидкість потоку, фактор опору колонки і в'язкість розчинника, отримаємо для колонок рівної довжини співвідношення тисків на вході 44:16:4:1. Таким чином, якщо для обернено-фазного сорбенту з розміром частинок 10 мкм при використанні систем розчинників метанол - . вода (70:30) зазвичай на стандартній колонці при витраті розчинника 1 мл/хв тиск на вході в колонку становить 5 МПа, то для частинок 5 мкм - 20 МПа та для 3 мкм - 55 МПа. При використанні силікагелю та менш в'язкої системи розчинників гексан - ізопропанол (100:2) значення будуть суттєво нижчими: відповідно 1, 4 та 11 МПа. Якщо разі звернено-фазного сорбенту застосування часток розміром Змкм дуже проблематично, а 5 мкм можливо, але не всіх приладах, то нормально-фазного проблем із тиском немає. Слід зазначити, що з сучасної швидкісної ВЕРХ характерне використання вищої витрати розчинників, ніж у вищерозглянутому прикладі, тому вимоги до тиску зростають ще більше.

Однак у тих випадках, коли для поділу потрібна певна кількість теоретичних тарілок та бажано здійснити швидкісний аналіз, картина дещо змінюється. Так як довжини колонок із сорбентами зерненням 3, 5, 10 мкм при рівній ефективності будуть відповідно 7,5; 12,5 і 25 см, то співвідношення тисків на вході в колонки зміниться доЗ,3:2:1. Відповідно тривалість аналізу на таких колонках рівної ефективності співвідноситиметься як 0,3:0,5:1, тобто при переході від 10 до 5 і 3 мкм тривалість аналізу скоротиться в 2 і 3,3 рази. За це прискорення аналізу доводиться розплачуватись пропорційно вищим тиском на вході в колонку.

Наведені дані справедливі для випадків, коли сорбенти різного зернення мають однакові криві розподілу частинок за розміром, колонки набиті однаковим способом і мають однаковий фактор опору колонки. Слід мати на увазі, що труднощі одержання вузьких фракцій сорбенту зростає в міру зменшення розміру частинок і що. фракції різних виробників мають різний фракційний склад. Тому фактор опору колонок змінюватиметься в залежності від зернення, типу сорбенту, способу упаковки колонок та ін.

КЛАСИФІКАЦІЯ МЕТОДІВ ВЕРХ З МЕХАНІЗМУ РОЗДІЛУ

Більшість поділів, що проводяться методом ВЕРХ, засновано на змішаному механізмі взаємодії речовин з сорбентом, що забезпечує більше або менше утримування компонентів в колонці. Механізми поділу в більш менш чистому вигляді на практиці зустрічаються досить рідко, наприклад, адсорбційний при використанні абсолютно безводного силікагелю і безводного гексану для поділу ароматичних вуглеводнів.

При змішаному механізмі утримування речовин різної будови і молекулярної маси можна оцінити внесок у утримання адсорбційного, розподільчого, эксклюзивного та інших механізмів. Однак для кращого розуміння та уявлення про механізми поділу у ВЕРХ доцільно розглядати поділи з переважанням того чи іншого механізму як відносяться до певного виду хроматографії, наприклад, іонообмінної хроматографії.

2.1.1 АДСОРБЦІЙНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Різниця у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Поділ зон компонентів, що досягається при цьому, залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.

В основі сорбції на поверхні адсорбенту, що має гідроксильні групи, лежить специфічна взаємодія між полярною поверхнею адсорбенту і полярними (або здатним поляризуватися) групами або ділянками молекул. До таких взаємодій відносять диполь-дипольну взаємодію між постійними або індукованими диполями, утворення водневого зв'язку аж до утворення я-комплексів або комплексів з перенесенням заряду. Можливим і досить частим у практичній роботі є прояв хемосорбції, яка може призвести до значного підвищення часу утримування, різкого зниження ефективності, появи продуктів розкладання або незворотної сорбції речовини.

Ізотерми адсорбції речовин мають лінійну, опуклу або увігнуту форму. При лінійній ізотермі адсорбції пік речовини симетричний і час утримування залежить від розміру проби. Найчастіше ізотерми адсорбції речовин нелінійні і мають опуклу форму, що призводить до деякої асиметрії піку з утворенням хвоста.

Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним обсягом пор, поверхнею, діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію і вкрай рідко-інші адсорбенти, що широко застосовуються в класичній колонковій і тонкошаровій хроматографії. Основна причина цього - недостатня механічна міцність більшості інших адсорбентів, що не дозволяє упаковувати їх я використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ.

Полярні групи, що зумовлюють адсорбцію та знаходяться на поверхні силікагелю та оксиду алюмінію, за властивостями близькі. Тому зазвичай порядок елюювання сумішей речовин та елюотропний ряд розчинників для них однакові. Однак відмінність хімічної будови силікагелю та оксиду алюмінію іноді призводить до появи відмінностей у селективності- тоді перевагу віддають тому чи іншому адсорбенту, більш придатному для даної конкретної задачі. Наприклад, оксид алюмінію забезпечує більшу вибірковість при поділі деяких багатоядерних ароматичних вуглеводнів.

Перевага, що віддається зазвичай силікагелю в порівнянні з оксидом алюмінію, пояснюється ширшим вибором си-лікагелів по пористості, поверхні і діаметру пір, а також значно більш високою каталітичною активністю оксиду алюмінію, нерідко призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби або їх не .

2.1.2 Недоліки адсорбційної хроматографії, що обмежують її використання

Популярність адсорбційної хроматографії в міру розвитку методу ВЕРХ поступово падала, вона все більше замінювалася і продовжує замінюватися на інші варіанти, такі як звернено-фазна і нормально-фазна ВЕРХ на сорбентах з щепленою фазою. Які недоліки адсорбційної хроматографії призвели до цього?

Насамперед, це велика тривалість процесів врівноваження адсорбентів з розчинниками, що містять воду в мікрокількостях, складність приготування таких розчинників з певною та відтворюваною вологістю. З цього випливає погана відтворюваність параметрів утримування, роздільної здатності, селективності. З цієї причини неможливо використовувати градієнтне елюювання - повернення до вихідного стану настільки тривалий, що значно перевищує виграш часу з допомогою використання градієнта.

Істотні недоліки адсорбентів, особливо оксиду алюмінію, пов'язані з частими випадками перегрупувань чутливих до каталізу сполук, їх розкладання, незворотної сорбції, також загальновідомі і неодноразово відзначають у літературі. Необоротно сорбирующиеся речовини, накопичуючись на початковій ділянці колонки, змінюють природу сорбенту, можуть призвести до підвищення опору колонки або навіть до її повної забивання. Останній недолік може бути усунений шляхом використання передколонки, яка по-мірою підвищення опору та забиття замінюється на нову* або перезаповнюється новим сорбентом. Однак незворотна сорбція, яка має місце і в цьому випадку, призводить до отримання хроматограми, на якій повністю або частково відсутні чутливі до сорбції або каталітичного розкладання компоненти проби.

2.2. РОЗПОДІЛЬНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Розподільна хроматографія - це варіант ВЕРХ, в якому поділ суміші на компоненти здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються: розчинником (рухома фаза) і фазою на сорбенті (нерухома фаза). Історично першими були сорбенти такого типу, які отримували нанесенням рідких фаз (оксидипропіонітрилу, парафінової олії та ін.) на пористі носії, аналогічно тому, як готували та готують сорбенти для газорідинної хроматографії (ГРХ). Однак відразу ж виявились і недоліки таких сорбентів, основним з яких було відносно швидке змивання фази носія. За рахунок цього кількість фази в колонці поступово зменшувалася, часи утримування також зменшувалися, на початковій ділянці колонки з'являлися не покриті фазою центри адсорбції, що викликали утворення хвостів піків. З цим недоліком боролися, насичуючи розчинник нанесеною фазою ще до попадання в колонку. Винесення також зменшувався, коли використовували більш в'язкі і менш розчинні полімерні фази, проте в цьому випадку через утруднення дифузії з полімерних товстих плівок ефективність колонок помітно знижувалася.

Логічним виявилося прищепити хімічними зв'язками рідку фазу до носія таким чином, щоб винесення її став фізично неможливий, тобто перетворити носій і фазу в одне ціле - так званий щеплено-фазний сорбент.

Надалі зусилля дослідників були спрямовані на пошук реагентів, щеплення яких протікало б досить швидко і повно, а зв'язки, що утворилися, були максимально стійкими. Такими реагентами стали алкілхлорсилани та їх похідні, що дозволили за подібною технологією отримувати щеплено-фазні сорбенти різного типу та з різними як полярними, так і неполярними групами на поверхні.

Успішне застосування сорбентів останнього типу для ВЕРХ сприяло зростанню їх виробництва різними виробниками. Кожна фірма виробляла такі сорбенти, як правило, на основі свого виду силікагелю та за своєю технологією, яка зазвичай становить «ноу-хау» виробництва. В результаті велика кількість сорбентів, що називаються хімічно абсолютно однаково (наприклад, силікагель з щепленим октадецилсиланом), мають хроматографічні характеристики, що дуже сильно відрізняються. Це пов'язано з тим, що силікагель може мати пори ширші або вже, різну поверхню, пористість, його поверхня до щеплення може гідроксилювати або ні, щеплюватися можуть моно-, ді-або трихлорсила-ни, умови щеплення можуть давати мономерний, полімерний або змішаний шар фази, використовуються різні методи видалення залишків реагентів, може використовуватися або не використовувати додаткова дезактивація силанольних та інших активних груп.

Складність технології щеплення реагентів і підготовки сировини і матеріалів, її багатостадійність призводять до того, що навіть отримані за однією технологією до однієї фірми-виробника партії сорбентів можуть мати кілька різні хроматографічні характеристики. Особливо це стосується тих випадків, коли такі сорбенти використовують для аналізу багатокомпонентних сумішей, що містять речовини, що помітно розрізняються за кількістю та положенням функціональних груп, за родом функціональності.

Враховуючи вищезгадане, завжди слід прагнути до того, щоб при використанні описаної в літературі методики аналізу застосовувати саме цей сорбент і ті ж умови роботи. І тут ймовірність того, що роботу не вдасться відтворити, є мінімальною. Якщо ж такої можливості немає, а береться сорбент іншої фірми з аналогічною щепленою фазою, потрібно бути готовим до того, що буде потрібна тривала робота по переробці методики. При цьому існує ймовірність (і її слід враховувати), що на цьому сорбенті навіть після тривалої розробки можна не домогтися необхідного поділу. Наявність у літературі багатьох описаних методик поділу на давно вироблених старих сорбентах стимулює їхнє подальше виробництво та застосування з цієї причини. Однак у тих випадках, коли доводиться переходити до розробки оригінальних методик, особливо стосовно речовин, схильних до розкладання, хемосорбції, перегрупування, доцільно починати роботу на сорбентах, розроблених останнім часом і випускаються за новими, поліпшеними варіантами технології. Нові сорбенти мають більш однорідний фракційний склад, більш однорідне та повне покриття поверхні щепленою фазою, досконаліші остаточні стадії обробки сорбентів.

2.3. ІОНООБМІННА ХРОМАТОГРАФІЯ

В іонообмінній хроматографії поділ компонентів суміші досягається за рахунок оборотної взаємодії речовин, що іонізуються, з іонними групами сорбенту. Збереження електронейтральності сорбенту забезпечується наявністю здатних до іонного обміну протиіонів, розташованих у безпосередній близькості до поверхні. Іон введеного зразка, взаємодіючи з фіксованим зарядом сорбенту, обмінюється протиіоном. Речовини, що мають різну спорідненість до фіксованих зарядів, поділяються на аніонітах або на катеонітах. Аніоніти мають на поверхні позитивно заряджені групи і сорбують з рухомої фази аніони. Катіоніти відповідно містять групи з негативним зарядом, що взаємодіють з катіонами.

В якості рухомої фази використовують водні розчини солей кислот, основ і розчинники типу рідкого аміаку, тобто системи розчинників, що мають високе значення діелектричної проникності е і велику тенденцію іонізувати сполуки.Зазвичай працюють з буферними розчинами, що дозволяють регулювати значення рН.

При хроматографічному поділі іони аналізованої речовини конкурують з іонами, що містяться в елюенті, прагнучи вступити у взаємодію з протилежно зарядженими групами сорбенту. Звідси випливає, що іонообмінну хроматографію можна застосовувати для поділу будь-яких сполук, які можуть бути іонізовані. Можна провести аналіз навіть нейтральних молекул Сахаров у вигляді їх комплексів із борат-іоном:

Цукор + ВО 3 2 - = Цукор - ВО 3 2 -.

Іонообмінна хроматографія незамінна при розподілі високополярних речовин, які без переведення у похідні не можуть бути проаналізовані методом ГРХ. До таких сполук належать амінокислоти, пептиди, цукри.

Іонообмінну хроматографію широко застосовують у медицині, біології, біохімії, для контролю навколишнього середовища, при аналізі вмісту ліків та їх метаболітів у крові та сечі, отрутохімікатів у харчовій сировині, а також для поділу неорганічних сполук, у тому числі радіоізотопів, лантаноїдів, актиноїдів та ін. Аналіз біополімерів (білків, нуклеїнових кислот та ін), на який зазвичай витрачали годинник або дні, за допомогою іонообмінної хроматографії проводять за 20-40 хв з кращим поділом. Застосування іонообмінної хроматографії в біології дозволило спостерігати за зразками безпосередньо в біосередовищах, зменшуючи можливість перегрупування або ізомеризації, що може призвести до неправильної інтерпретації кінцевого результату. Цікаво використання цього методу контролю змін, що відбуваються з біологічними рідинами . Застосування пористих слабких аніонообмінників на силікагелевій основі дозволило розділити пептиди. V

Механізм іонного обміну можна як наступних рівнянь:

для аніонного обміну

X- + R+Y- год ->■ Y-+R+X-.

для катіонного обміну

X + + R-Y + год = * Y + + R-X +.

У першому випадку іон зразка Х~ конкурує з іоном рухомої фази Y~ за іонні центри R+ іонообмінника, а в другому в конкуренцію з іонами рухомої фази Y+ за іонні центри R~ вступають катіони зразка Х+.

Природно, що іони зразка, що слабо взаємодіють з іонообмінником, при цій конкуренції будуть слабо утримуватися на колонці і першими вимиваються з неї і, навпаки, іони, що сильно утримуються, будуть елюювати з колонки останніми. Зазвичай виникають BTqpH4Hbie взаємодії неіонної природи за рахунок адсорбції або водневих зв'язків зразка з неіонною частиною матриці або за рахунок обмеженої розчинності зразка рухомої фази. Важко виділити "класичну" іонообмінну хроматографію в "чистому" вигляді, і тому деякі хроматографісти виходять з емпіричних, а не теоретичних закономірностей при іонообмінній хроматографії.

Поділ конкретних речовин залежить в першу чергу від вибору найбільш відповідного сорбенту та рухомої фази. Як нерухомі фази в іонообмінній хроматографії застосовують іонообмінні смоли та силікагелі з щепленими іоногенними групами.

2.4. ЕКСКЛЮЗІЙНА ХРОМАТОГРАФІЯ

Зклюзійна хроматографія є варіантом! рідинної хроматографії, в якому поділ відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходиться всередині пір сорбенту, і розчинником, що протікає " між його частинками.

На відміну від інших варіантів ВЕРХ, де поділ йдеза рахунок різної взаємодії компонентів з поверхнею сорбенту, роль твердого наповнювача в екслюзійній хроматографії полягає тільки у формуванні пір певного розміру, а нерухомою фазою є розчинник, що заповнює ці пори. Тому застосування терміна «сорбент» до даних наповнювачів певною мірою умовно.

Принциповою особливістю методу є можливість поділу молекул за їх розміром у розчині в діапазоні практично будь-яких молекулярних мас - від 10 2 до 10 8 , що робить його незамінним для дослідження синтетичних і біополімерів.

За традицією процес, що проводиться в органічних розчинниках, все ще часто називають гель-проникаючою, а у водних системах - гель-фільтраційною хроматографією. У цій книзі для обох варіантів прийнято єдиний термін, який походить від англійського «Size Exclusion» - виняток за розміром - і найбільш повною мірою відображає механізм процесу.

Детальний розбір існуючих уявлень про дуже складну теорію процесу эксклюзивної хроматографії проведено в монографіях.

Повний об'єм розчинника у колонці Vt (його часто називають повним об'ємом колонки, оскільки Vd не бере участі в хроматографічному процесі) являє собою суму обсягів рухомої та нерухомої фаз.

Утримання молекул в зксклюзійній колонці визначається ймовірністю їх дифузії в пори і залежить від співвідношення розмірів молекул і пір, що схематично показано на рис. 2.15. Коефіцієнт розподілу Ка,як і в інших варіантах хроматографії, являє собою відношення концентрацій речовини в нерухомій та рухомій фазах.

Так як рухлива та нерухома фази мають однаковий склад, то Kd речовини, котрій обидві фази однаково доступні, дорівнює одиниці. Ця ситуація реалізується для молекул З найменшими розмірами (у тому числі молекул розчинника), які проникають у всі пори (див. рис. 2.15) і тому рухаються через колонку найбільш повільно. Їх утримуваний об'єм дорівнює повному об'єму розчинника Vt-

Мал. 2.15. Модель поділу молекул за мірою в ексклюзивній хроматографії.

Всі молекули, розмір яких більше розміру пор сорбенту, не можуть потрапити в них (повна ексклюзив) і проходять каналами між частинками. Вони елююються з колонки з тим самим утримуваним об'ємом, рівним об'єму рухомої фази V 0 - Коефіцієнт розподілу для цих молекул дорівнює нулю.

Молекули проміжного розміру, здатні проникати тільки в якусь частину пір, утримуються в колонці відповідно до їх розміру. Коефіцієнт розподілу цих молекул змінюється в межах від нуля до одиниці і характеризує частку обсягу пор, доступних для молекул даного розміру. Їх утримуваний обсяг визначається сумою У про доступної частини обсягу пор.

ЯКІСНИЙ АНАЛІЗ

Хроматографіст, який починає працювати в галузі високоефективної рідинної хроматографії, повинен ознайомитися з основами якісного аналізу. Якісний аналіз застосовують для ідентифікації відомого продукту, отриманого новим шляхом або що знаходиться в суміші з іншими продуктами." деяких лікарських засобів хімічних продуктів та їх метаболітів у біомл.тер.іалах..„"Знайомство з основами якісного" аналізу допоможе уникнути типових помилок, наприклад/відрізнити домішки у зразку від домішок у розчиннику або перевіряти чистоту речовини не на одній довжині хвилі. спектрофотометра, але в різних тощо.

Перш ніж приступити до аналізу, необхідно встановити, весь зразок елююється з колонки даною системою розчинників чи ні. Щоб бути впевненим у повному елююванні, необхідно зібрати всю рідину, що витікає з колонки, упарити розчинник, зважити залишок і знайти ступінь вилучення зразка.

Ідентифікацію компонентів у ВЕРХ можна проводити трьома способами: 1) використовувати інформацію про утримання; 2) дослідити зони, отримані під час поділу в колонці рідинного хроматографа, методами спектрального або хімічного аналізу; 3) безпосередньо підключити спектральний аналізатор до колонки.

Для реєстрації піків у хроматографії використовують об'єм, що утримується. V R або час утримання t R. Обидві величини є характеристикою речовини у цій хроматографічної системі. Так як час утримування речовини, що розділяється, складається з часу взаємодії в колонці і часу проходження порожніх ділянок трубки, воно змінюється від приладу до приладу. Зручно мати речовину, яка не утримується даною колонкою, прийнявши її за стандарт, час та обсяг утримування якої t 0 , V o. Хроматографування речовини і стандарту необхідно проводити за тих самих умов (тиску та швидкості потоку). При ідентифікації за даними про утримання відомі індивідуальні речовини, які можуть бути присутніми у зразках, поділяють у тій же хроматографічній системі, і для них отримують значення t R. Порівнюючи ці значення t R з часом утримування невідомого піку, можна виявити, що вони або збігаються, і тоді ймовірно, що піки відповідають тому самому речовині, або t R відомої речовини не відповідає t R невідома зона. Тоді все ж таки можлива орієнтовна оцінка значень t R речовин, які не доступні для безпосереднього вимірювання ступеня їх утримування. Розглянемо обидва варіанти.

У першому випадку, очевидно, необхідне попереднє вивчення зразка для постулювання присутності у ньому конкретних речовин. При роботі з простими сумішами неважко визначити, чи збігається ступінь утримання зон зразка та відомих речовин, чи ні, тобто значення t B однакові чи різняться. У разі складних сумішей відразу кілька речовин можуть елююватися зі схожими значеннями t R, і реально одержувані при хроматографічному розподілі зони перекриваються. В результаті одержання точних значень t R для різних зон стає неможливим. Надійність ідентифікації зростає при підвищенні роздільної здатності, більш ретельному контролі умов поділу, багаторазовому вимірі значень t R та усереднення знайдених величин. При цьому хроматографічне поділ відомого та невідомого речовин має чергуватись. При поділі складних сумішей значення t R речовини можуть змінюватися під впливом матриці самого зразка. Такий вплив можливий на початку хроматограми та при перекриванні піків; можливе також затягування зон, про що вже згадувалося.

У подібних випадках слід додати стандарт до зразка у співвідношенні 1: 1. Якщо речовини ідентичні, значення t R вихідної речовини не зміниться, і на хроматограмі одержують лише один пік. Якщо є прилад із циклічною системою хроматографування, то для надійності ідентифікації бажано суміш пропускати через колонку кілька разів.

Відомості про ступінь утримання можна знайти й у літературі, проте цінність цієї інформації обмежена. Оскільки колонки навіть однієї партії дають погану відтворюваність, літературні значення не завжди відповідають справжньому значенню t R на цій колонці. Для адсорбційної хроматографії можливе, проте, передбачення t R виходячи з літературних даних. Інша проблема, пов'язана з використанням літературних значень t R, - складність їх пошуку у спеціальній літературі, хоча бібліографічні огляди, що публікуються в Jornal of chromatography, мають оновлюваний покажчик за типами речовин.

У другому випадку, коли часи утримання відомих з'єднань і зон зразка не збігаються, є можливість передбачити час утримання невідомого компонента. Цілком надійні передбачення відносного утримування на підставі даних про структуру просторово-ексклюзивної хроматографії. Менш точні вони в адсорбційній, розподільчій хроматографії і особливо під час роботи на хімічно прив'язаній фазі. Для іонної та іон-парної хроматографії речовин з відомою р Каможливі лише приблизні визначення значень tR. Завжди легше передбачити відносне утримання чи значення *х, ніж абсолютні значення k". Відносні значення t R легше оцінити для споріднених сполук або похідних, наприклад, заміщених алкілкарбонових кислот або похідних бензолу.

При ізократичному поділі гомологів чи олігомерів іноді спостерігається наступна закономірність:

\ gk" = A + Bn,

де Аі У- константи для низки обраних зразків і для даної хроматографічної системи (на одній і тій же колонці, з такою ж рухомою і нерухомою фазами); п- Число однакових структурних одиниць в молекулі зразка.

Введення в молекулу зразка функціональної групи / призводитиме до зміни k" у першому рівнянні деякий постійний коефіцієнт а/ у цій хроматографічної системі. Можна отримати групові константи а/ для різних заміщуючих груп /, значення яких зростатимуть при збільшенні полярності функціональних груп у всіх видах хроматографії, крім навернено-фазної, де значення констант зменшуватимуться зі збільшенням полярності.

Деякі групові константи а/ для різних груп, що заміщають / наведені в табл. 9.1.

В адсорбційної хроматографії перше рівняння не завжди застосовне, тому що воно справедливе за умови, що всі ізомери мають одне й те саме значення k", що не завжди дотримується. Можна, однак, побудувати графік залежності lgfe" одних і тих же з'єднань на одній колонці щодо lgfe" тих самих з'єднань, але на іншій колонці або щодо відповідних характеристик тонкошарової хроматографії, наприклад, lg[(l- Rf) IRf].

При порівнянні даних про утримання речовин можна використовувати значення коефіцієнта ємності k", тому що на нього на відміну від t R не впливають швидкість рухомої фази та геометричні особливості колонки.

Поділ на хімічно прив'язаній фазі аналогічно поділу методом розподільчої хроматографії з аналогічними фазами, і тому дані з екстракції при рівноважному стані можуть бути використані для передбачення часу утримання.

В іонообмінній хроматографії на ступінь утримання впливають три фактори: ступінь іонізації кислот і основ, заряд іонізованої молекули і здатність речовини з рухомої водної фази, що використовується в іонообмінній хроматографії, мігрувати в органічну фазу. Останнє залежить від молекулярної маси сполуки та її гідрофобності. Отже, сильніші кислоти або основи сильніше утримуються при аніонообмінному або катіонообмінному поділі. При зниженні РК аокремої кислоти, що входить у зразок, утримування зростає при поділі ряду кислот за рахунок аніонного обміну, а при збільшенні р/С збільшується утримування підстав при їх поділі за рахунок катіонного обміну.

Таким чином, збіг значень часу утримання відомої речовини з спостерігається дає можливість припустити їх ідентичність. Достовірність ідентифікації зростає, якщо порівняти хроматограм відомої речовини і невідомого компонента в різних умовах. Якщо речовини в адсорбційній та обернено-фазній або іоннообмінній та ексклюзійній хроматографії поводяться однаково, надійність ідентифікації зростає. Якщо достовірність ідентифікації при рівності відносного утримування становить 90%, то при вивченні поведінки цих же речовин в умовах суттєвих достовірність ідентифікації становить вже 99%.

Цінною характеристикою речовини, що застосовується під час ідентифікації, є відношення сигналів, отриманих для даної речовини на двох різних детекторах. Аналізована речовина після виходу з колонки проходить спочатку через перший детектор, потім через другий, а сигнали, що надходять з детекторів, реєструються одночасно за допомогою пір'яного самописця або на двох самописцях. Зазвичай застосовують послідовне з'єднання ультрафіолетового детектора (більш чутливого, але селективного) з рефрактометром, або ультрафіолетового з детектором флуоресценції, або двох ультрафіолетових детекторів, що працюють на різних довжинах хвиль. Відносний відгук, тобто відношення сигналу рефрактометра до сигналу фотометра, є характеристикою речовини за умови, що обидва детектори працюють у своєму лінійному діапазоні; це перевіряється запровадженням різних кількостей однієї й тієї ж речовини. Якісну інформацію можна отримати, працюючи на фотометричних детекторах, забезпечених пристроєм для зупинки потоку (Stop flow) і дозволяють реєструвати спектр "виходить з колонки піку, поки він знаходиться в проточній кюветі, порівнюючи його зі спектром відомого з'єднання.

Значний інтерес при ідентифікації становлять сучасні, поки що дорогі, спектрофотометри з діодними гратами.

Цілком невідома речовина неможливо ідентифікувати лише за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, необхідні й інші методи.

Кількісний аналіз

Кількісна рідинна хроматографія є добре розробленим аналітичним методом, який не поступається за точністю кількісної газової хроматографії і значно перевищує точність ТСХ або електрофорезу. ГЖХ) Тому для отримання кількісних результатів калібрування приладу обов'язкове.

Кількісний аналіз складається з наступних стадій: 1) хроматографічне поділ; 2) вимірювання площ чи висот піку; 3) розрахунок кількісного складу суміші на підставі хроматографічних даних; 4) інтерпретація одержаних результатів, тобто статистична обробка. Розглянемо всі ці стадії.

4.1. ХРМАТОГРАФІЧНИЙ РОЗДІЛ

При відборі проби можуть бути допущені помилки. Особливо важливо уникнути помилки та відібрати адекватну представницьку пробу неоднорідних твердих зразків, легколетких чи нестійких речовин, а також сільськогосподарських продуктів та біоматеріалів. Неоднорідні зразки, наприклад харчових продуктів, ретельно перемішують і квартують. Проводячи цю операцію багаторазово, домагаються однорідності проби.

Похибки та втрати речовин можуть бути допущені на стадії екстракції, виділення, очищення тощо.

Зразки мають бути повністю розчинені, які розчини приготовані з точністю ±0,1%. Розчиняти зразок бажано в рухомій фазі, що виключить можливість його осадження після введення в хроматограф. Якщо розчинення в рухомій фазі неможливо, слід застосовувати розчинник, що змішується з нею, і вводити в хроматограф обсяги зразка (менше 25 мкл).

Значні похибки можуть бути при введенні проби за рахунок її фракціонування, витоків та розмивання піків. Розмивання піків викликає утворення хвостів, що призводять до часткового перекриття піків, і як наслідок цього до похибок при детектуванні. Для введення проби при кількісному аналізі краще використовувати петлеві клапанні пристрої, а не шприци через більш високу точність і меншу залежність від індивідуальних особливостей операторів.

При хроматографічному поділі речовин можуть виникнути ускладнення, що призводять до спотворення даних: кількісного аналізу. Можливе розкладання або перетворення проби під час хроматографічного процесу або незворотна адсорбція речовини на цій колонці. Важливо переконатися у відсутності цих небажаних явищ та за необхідності провести регенерацію колонки або замінити її. Перекриття піків і утворення хвостів також можна зменшити, змінюючи умови хроматографування.

Не можна використовувати в кількісному аналізі піки несправжні або нечіткої форми, а також піки, час виходу яких близький до to, оскільки можливий недостатній їх поділ. Зазвичай використовують піки зі значенням й"^0,5. Найвища ефективність колонки досягається при введенні 10~ 5 -10~ 6 г розчиненої речовини на 1 г сорбенту. за площами піків.

До суттєвого спотворення результатів хроматографічного поділу призводять похибки, пов'язані з детектуванням, або посиленням. Кожен детектор характеризується специфічністю, лінійністю та чутливістю. Особливо важливою є перевірка на селективність при аналізі мікродомішок. Відгук УФ-детекторів може змінюватися на речовини зі схожими функціональними групами в 10 4 разів. Необхідно відгук детектора прокалібрувати для кожної речовини. Природно, що речовини, що не поглинають в УФ-області, не дадуть сигналу на самописець при використанні як детектор фотометра. При використанні рефрактометра можлива поява негативних піків. Крім того, цей детектор необхідно термостатувати, чого не потрібно УФ-детектора.

Лінійністю детектора визначається розмір проби, що вводиться. Необхідно пам'ятати, що швидкість потоку через колонку, температура колонки та детектора, а також його конструкція впливають на точність кількісного аналізу. Похибки при передачі електричного сигналу на вихідний пристрій (самописець), інтегратор або ЕОМ можуть виникати за рахунок наведення шумів, відсутності заземлення, коливання напруги в мережі і т. д.

4.2. ВИМІР ПЛОЩІВ АБО ВИСІТ ПІКІВ

Висотою пік h (Рис. 10.1) називають відстань від вершини піку до базової лінії, його вимірюють лінійною або підраховують кількість поділів на самописці. Деякі електронні інтегратори та обчислювальні машини дають інформацію про висоту піків. Положення базової лінії зміщених піків знаходять шляхом інтерполювання значень ординат, що відповідають початку та кінцю піку (пік 1 та 3див. рис. 10.1). Для підвищення точності потрібно мати пологу стабільну базову лінію. У разі нерозділених піків базову лінію будують між початком та кінцем піку, а не замінюють нульовою лінією. Так як висота піків менш залежить від впливу сусідніх піків, що перекриваються, оцінка по висоті піку точніше, і її майже завжди використовують при аналізі мікродомішок.

Площа піку можна визначати у різний спосіб. Розглянемо деякі з них.

1. Планіметричний метод полягає в тому, що пік обводять ручним планіметром, що є приладом, що механічно визначає площу піку. Метод точний, але трудомісткий і погано відтворюємо. Застосування цього небажано.

2. Метод паперових силуетів – пік вирізують та зважують. Метод добре відтворюваний, але трудомісткий, при цьому знищується хроматограма. Застосування його залежить від однорідності діаграмної стрічки. Метод також може бути широко рекомендований.

4. Метод тріангуляції полягає у побудові трикутника шляхом проведення дотичних до сторін піку. Вершина трикутника знаходиться вище, ніж вершина піку. Збільшення площі, утвореної цією продовженою вершиною, буде послідовним для всієї хроматограми і не надто вплине на точність. Крім того, деяку площу, що втрачається під час проведення дотичних, буде компенсовано. Основу трикутника визначають перетином дотичних з базовою лінією, а площа - добутком 7г основи на висоту. Для визначення площ асиметричних піків цей спосіб найкращий. Однак відтворюваність при побудові дотичних різних операторів різна і, отже; низька.

5. Метод із застосуванням дискового інтегратора заснований на електромеханічному пристрої, приєднаному до самописця. Перо, прикріплене до інтегратора, переміщається смугою внизу стрічки зі швидкістю, пропорційною переміщенню пера самописця.

Як і при ручному вимірі, пік повинен залишатися на шкалі самописця, однак регулювання, що компенсують зміщення базової лінії та неповний поділ суміжних піків, знижує надійність та збільшує тривалість аналізу.

Метод точніший, ніж ручні методи вимірювання, особливо при асиметричних піках, і дає перевагу у швидкості. Крім того, він забезпечує постійний кількісний запис аналізу.

6. Методи із застосуванням електронних інтеграторів, що визначають площу піків та друкують інформацію про цю площу та про часи утримування, можуть включати корекцію зміщення базової лінії та визначати площу лише частково розділених піків. Основні переваги – точність, швидкість, незалежність дії від роботи самописця. Інтегратори мають пам'ять і їх можна програмувати для конкретного аналізу, використовуючи попередньо закладену програму. До переваг інтегратора відносять його здатність використовувати поправочні коефіцієнти на відгук детектора при перерахуванні вихідних даних про площі піків, компенсуючи відмінність чутливості детектора до різних речовин. Подібні системи економлять час, покращують аналітичну точність та корисні для рутинного аналітичного аналізу.

7. У рідинній хроматографії широко застосовують ЕОМ, що вимірюють площі піків. Вони виводять на друк повне повідомлення, включаючи назву речовин, площі піків, часи утримування, поправочні коефіцієнти на відгук детектора та вміст (мас.%) для різних компонентів зразка.