Stosowana biologia molekularna. Przedmiot, zadania i cele biologii molekularnej Opowiedz nam o tym więcej

Komiks do konkursu „bio/mol/text”: Dzisiaj Test Tube biologa molekularnego poprowadzi Cię przez świat niesamowitej nauki - biologii molekularnej! Zaczniemy od wycieczki historycznej przez etapy jej rozwoju, opiszemy główne odkrycia i eksperymenty od 1933 roku. I jasno opiszemy również główne metody biologii molekularnej, które umożliwiły manipulowanie genami, ich zmianę i izolację. Pojawienie się tych metod było silnym impulsem do rozwoju biologii molekularnej. Pamiętajmy też o roli biotechnologii i dotykajmy jednego z najpopularniejszych tematów w tej dziedzinie - edycji genomu za pomocą systemów CRISPR/Cas.

Sponsorem generalnym zawodów i partnerem nominacji Skoltech jest .

Sponsorem konkursu jest firma Diaem: największy dostawca sprzętu, odczynników i materiałów eksploatacyjnych dla badania biologiczne i produkcje.

Firma sponsorowała nagrodę Audience Choice Award.

Sponsor konkursu "Książka" - "Alpina non-fiction"

1. Wstęp. Esencja biologii molekularnej

Bada podstawy życiowej aktywności organizmów na poziomie makrocząsteczek. Celem biologii molekularnej jest ustalenie roli i mechanizmów funkcjonowania tych makrocząsteczek na podstawie wiedzy o ich budowie i właściwościach.

Z historycznego punktu widzenia biologia molekularna powstała podczas rozwoju obszarów biochemii zajmujących się badaniem kwasów nukleinowych i białek. Podczas gdy biochemia to nauka o metabolizmie, skład chemiczny W żywych komórkach, organizmach i zachodzących w nich procesach chemicznych biologia molekularna koncentruje się na badaniu mechanizmów przekazywania, reprodukcji i przechowywania informacji genetycznej.

A przedmiotem badań biologii molekularnej są same kwasy nukleinowe - dezoksyrybonukleinowe (DNA), rybonukleinowe (RNA) - i białka, a także ich kompleksy makrocząsteczkowe - chromosomy, rybosomy, układy wieloenzymatyczne, które zapewniają biosyntezę białek i kwasów nukleinowych. Biologia molekularna również graniczy z przedmiotami badań i częściowo pokrywa się z genetyką molekularną, wirusologią, biochemią i szeregiem innych pokrewnych nauk biologicznych.

2. Wycieczka historyczna przez etapy rozwoju biologii molekularnej

Jako odrębny obszar biochemii biologia molekularna zaczęła się rozwijać w latach 30. ubiegłego wieku. Już wtedy konieczne stało się zrozumienie zjawiska życia na poziomie molekularnym w celu zbadania procesów transmisji i przechowywania informacji genetycznej. Właśnie w tym czasie postawiono zadanie biologii molekularnej w badaniu właściwości, struktury i interakcji białek i kwasów nukleinowych.

Termin „biologia molekularna” został po raz pierwszy użyty w 1933 rok William Astbury podczas badań białek fibrylarnych (kolagen, fibryna krwi, kurczliwe białka mięśniowe). Astbury zbadał związek między strukturą molekularną a biologicznymi, fizycznymi właściwościami tych białek. Na początku pojawienia się biologii molekularnej RNA uważano za składnik tylko roślin i grzybów, a DNA - tylko zwierząt. I w 1935 Odkrycie DNA grochu przez Andrieja Belozerskiego doprowadziło do ustalenia faktu, że DNA jest zawarte w każdej żywej komórce.

W 1940 Kolosalnym osiągnięciem było ustalenie przez George'a Beadle'a i Edwarda Tathama związku przyczynowego między genami a białkami. Hipoteza naukowców "Jeden gen - jeden enzym" stworzyła podstawę koncepcji, że specyficzna struktura białka jest regulowana przez geny. Uważa się, że informacja genetyczna jest kodowana przez specjalną sekwencję nukleotydów w DNA, która reguluje pierwotną strukturę białek. Później udowodniono, że wiele białek ma strukturę czwartorzędową. W tworzeniu takich struktur biorą udział różne łańcuchy peptydowe. Na tej podstawie przepis dotyczący związku między genem a enzymem został nieco przekształcony i teraz brzmi jak „Jeden gen – jeden polipeptyd”.

W 1944 W 1999 roku amerykański biolog Oswald Avery i jego współpracownicy (Colin McLeod i McLean McCarthy) udowodnili, że substancją powodującą transformację bakterii jest DNA, a nie białka. Eksperyment posłużył jako dowód roli DNA w przekazywaniu informacji dziedzicznych, przekreślając przestarzałą wiedzę o białkowej naturze genów.

Na początku lat pięćdziesiątych Frederick Sanger wykazał, że łańcuch białkowy jest unikalną sekwencją reszt aminokwasowych. W 1951 I 1952 lat naukowiec ustalił kompletną sekwencję dwóch łańcuchów polipeptydowych – insuliny bydlęcej W(30 reszt aminokwasowych) i ALE(21 reszt aminokwasowych).

Mniej więcej w tym samym czasie, w 1951–1953 Erwin Chargaff sformułował zasady dotyczące proporcji zasad azotowych w DNA. Zgodnie z zasadą, niezależnie od różnic gatunkowych organizmów żywych w ich DNA, ilość adeniny (A) jest równa ilości tyminy (T), a ilość guaniny (G) jest równa ilości cytozyny (C).

W 1953 udowodnił genetyczną rolę DNA. James Watson i Francis Crick na podstawie zdjęcia rentgenowskiego DNA uzyskanego przez Rosalind Franklin i Maurice'a Wilkinsa ustalili strukturę przestrzenną DNA i wysunęli później potwierdzone założenie dotyczące mechanizmu jego replikacji (podwajania), które leży u podstaw dziedziczności.

1958 rok - tworzenie centralnego dogmatu biologii molekularnej przez Francisa Cricka: transfer informacji genetycznej idzie w kierunku DNA → RNA → białko.

Istotą dogmatu jest to, że w komórkach istnieje pewien ukierunkowany przepływ informacji z DNA, który z kolei jest oryginalnym tekstem genetycznym, składającym się z czterech liter: A, T, G i C. Jest on zapisany w DNA podwójna helisa w postaci sekwencji tych liter - nukleotydów.

Trwa przepisywanie tego tekstu. A proces nazywa się transkrypcja. Podczas tego procesu syntetyzowany jest RNA, który jest identyczny z tekstem genetycznym, ale z tą różnicą: w RNA zamiast T występuje U (uracyl).

Ten RNA nazywa się posłańca RNA (mRNA), lub matryca (mRNA). Audycja mRNA przeprowadza się przy użyciu kodu genetycznego w postaci sekwencji trypletowych nukleotydów. Podczas tego procesu tekst kwasów nukleinowych DNA i RNA jest tłumaczony z tekstu czteroliterowego na dwudziestoznakowy tekst aminokwasów.

Naturalnych aminokwasów jest tylko dwadzieścia, aw tekście kwasów nukleinowych są cztery litery. Z tego powodu istnieje tłumaczenie z czteroliterowego alfabetu na dwudziestoliterowy alfabet poprzez kod genetyczny, w którym każdy trzy nukleotydy odpowiadają aminokwasowi. Czyli z czterech liter można zrobić całe 64 trzyliterowe kombinacje, ponadto aminokwasów jest 20. Z tego wynika, że ​​kod genetyczny musi koniecznie mieć właściwość degeneracji. Jednak w tym czasie kod genetyczny nie był znany, poza tym nawet nie zaczęto go odszyfrowywać, ale Crick już sformułował swój główny dogmat.

Niemniej jednak była pewność, że kod musi istnieć. Do tego czasu udowodniono, że kod ten miał charakter trójki. Oznacza to, że konkretnie trzy litery w kwasach nukleinowych ( kodony) odpowiadają dowolnemu aminokwasowi. Jest 64 takich kodonów, kodują one 20 aminokwasów. Oznacza to, że każdy aminokwas odpowiada kilku kodonom jednocześnie.

Możemy więc stwierdzić, że centralnym dogmatem jest postulat mówiący o tym, że w komórce zachodzi ukierunkowany przepływ informacji: DNA → RNA → białko. Crick podkreślił główną treść centralnego dogmatu: odwrotny przepływ informacji nie może nastąpić, białko nie jest w stanie zmienić informacji genetycznej.

To jest główne znaczenie centralnego dogmatu: białko nie jest w stanie zmienić i przekształcić informacji w DNA (lub RNA), przepływ zawsze przebiega tylko w jednym kierunku.

Jakiś czas później odkryto nowy enzym, który nie był znany w czasie formułowania centralnego dogmatu: odwrotna transkryptaza który syntetyzuje DNA z RNA. Enzym został odkryty w wirusach, w których informacja genetyczna jest zakodowana w RNA, a nie w DNA. Takie wirusy nazywane są retrowirusami. Posiadają wirusową otoczkę z zamkniętym w niej RNA i specjalnym enzymem. Enzym jest odwrotną transkryptazą, która syntetyzuje DNA zgodnie z szablonem tego wirusowego RNA, a ten DNA służy następnie jako materiał genetyczny dla dalszy rozwój wirus w komórce.

Oczywiście odkrycie to wywołało wielki szok i wiele kontrowersji wśród biologów molekularnych, ponieważ wierzono, że w oparciu o centralny dogmat tak być nie może. Jednak Crick natychmiast wyjaśnił, że nigdy nie powiedział, że to niemożliwe. Powiedział tylko, że nigdy nie może być przepływu informacji z białka do kwasów nukleinowych, a już w kwasach nukleinowych całkiem możliwe są wszelkiego rodzaju procesy: synteza DNA na DNA, DNA na RNA, RNA na DNA i RNA na RNA.

Po sformułowaniu centralnego dogmatu wciąż pozostawało wiele pytań: w jaki sposób alfabet czterech nukleotydów tworzących DNA (lub RNA) koduje 20-literowy alfabet aminokwasów tworzących białka? Jaka jest istota kodu genetycznego?

Pierwsze idee dotyczące istnienia kodu genetycznego sformułował Alexander Downes ( 1952 d.) i Georgy Gamow ( 1954 G.). Naukowcy wykazali, że sekwencja nukleotydów musi zawierać co najmniej trzy ogniwa. Później udowodniono, że taka sekwencja składa się z trzech nukleotydów, zwanych kodon (tryplet). Jednak pytanie, które nukleotydy są odpowiedzialne za włączenie którego aminokwasu do cząsteczki białka, pozostawało otwarte do 1961 roku.

I w 1961 Marshall Nirenberg wraz z Heinrichem Mattei wykorzystali system do nadawania in vitro. Jako matrycę zastosowano oligonukleotyd. Zawierała tylko reszty uracylowe, a zsyntetyzowany z niej peptyd zawierał tylko aminokwas fenyloalaninę. W ten sposób po raz pierwszy ustalono znaczenie kodonu: kodon UUU kody dla fenyloalaniny. Później Har Qur'an odkrył, że sekwencja nukleotydowa UCUCUCUCUCUC koduje zestaw aminokwasów seryna-leucyna-seryna-leucyna. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki pracom Nirenberga i Koranu, aby 1965 rok, kod genetyczny został całkowicie rozwikłany. Okazało się, że każdy triplet koduje określony aminokwas. A kolejność kodonów określa kolejność aminokwasów w białku.

Główne zasady funkcjonowania białek i kwasów nukleinowych zostały sformułowane na początku lat 70-tych. Stwierdzono, że synteza białek i kwasów nukleinowych przebiega zgodnie z mechanizmem macierzowym. Cząsteczka matrycy niesie zakodowaną informację o sekwencji aminokwasów lub nukleotydów. Podczas replikacji lub transkrypcji matrycą jest DNA, a podczas translacji i odwrotnej transkrypcji jest to mRNA.

W ten sposób powstały przesłanki do powstania obszarów biologii molekularnej, w tym inżynierii genetycznej. A w 1972 Paul Berg i współpracownicy opracowali technologię klonowania molekularnego. Naukowcy uzyskali pierwsze zrekombinowane DNA in vitro. Te wybitne odkrycia stały się podstawą nowego kierunku w biologii molekularnej i 1972 Od tego czasu rok jest uważany za datę narodzin inżynierii genetycznej.

3. Metody biologii molekularnej

Ogromny postęp w badaniach nad kwasami nukleinowymi, strukturą DNA i biosyntezą białek doprowadził do powstania wielu metod o dużym znaczeniu w medycynie, rolnictwie i ogólnie nauce.

Po przestudiowaniu kodu genetycznego i podstawowych zasad przechowywania, przekazywania i wdrażania informacji dziedzicznej, dla dalszego rozwoju biologii molekularnej konieczne stały się specjalne metody. Metody te umożliwiłyby manipulację, zmianę i izolację genów.

Pojawienie się takich metod nastąpiło w latach 70. i 80. XX wieku. Dało to ogromny impuls do rozwoju biologii molekularnej. Przede wszystkim metody te są bezpośrednio związane z produkcją genów i ich wprowadzaniem do komórek innych organizmów, a także możliwością określenia sekwencji nukleotydów w genach.

3.1. Elektroforeza DNA

Elektroforeza DNA to podstawowa metoda pracy z DNA. Elektroforeza DNA jest używana wraz z prawie wszystkimi innymi metodami do izolacji pożądanych cząsteczek i dalszej analizy wyników. Sama metoda elektroforezy żelowej służy do rozdzielania fragmentów DNA według długości.

Przed lub po elektroforezie żel jest traktowany barwnikami, które mogą wiązać się z DNA. Barwniki fluoryzują w świetle ultrafioletowym, tworząc wzór pasm w żelu. Aby określić długość fragmentów DNA, można je porównać z markery- zestawy fragmentów o standardowej długości, które nakłada się na ten sam żel.

Białka fluorescencyjne

Podczas badania organizmów eukariotycznych wygodnie jest używać białek fluorescencyjnych jako genów markerowych. Gen pierwszego zielonego białka fluorescencyjnego ( zielone białko fluorescencyjne, GFP) wyizolowany z meduzy Aqeuorea wiktoria a następnie wprowadzane do różnych organizmów. Następnie wyizolowano geny białek fluorescencyjnych o innych kolorach: niebieskim, żółtym, czerwonym. Aby uzyskać białka o interesujących właściwościach, takie geny zostały sztucznie zmodyfikowane.

Ogólnie rzecz biorąc, najważniejszymi narzędziami do pracy z cząsteczką DNA są enzymy, które przeprowadzają szereg transformacji DNA w komórkach: polimeraza DNA, Ligazy DNA I restrykcje (endonukleazy restrykcyjne).

transgeneza

transgeneza Nazywa się to transferem genów z jednego organizmu do drugiego. Takie organizmy nazywają się transgeniczny.

Rekombinowane preparaty białkowe są właśnie otrzymywane przez przeniesienie genów do komórek mikroorganizmów. Większość z tych białek to interferony, insulina, niektóre hormony białkowe, a także białka do produkcji szeregu szczepionek.

W innych przypadkach wykorzystuje się kultury komórkowe eukariontów lub zwierząt transgenicznych, głównie żywego inwentarza, które wydzielają niezbędne białka do mleka. W ten sposób uzyskuje się przeciwciała, czynniki krzepnięcia krwi i inne białka. Metodę transgenezy stosuje się w celu uzyskania upraw odpornych na szkodniki i herbicydy, a ścieki oczyszcza się za pomocą mikroorganizmów transgenicznych.

Oprócz wszystkich powyższych, technologie transgeniczne są niezbędne w badaniach naukowych, ponieważ rozwój biologii jest szybszy dzięki zastosowaniu metod modyfikacji i transferu genów.

Ograniczenia

Sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są symetryczne, więc w środku takiej sekwencji mogą wystąpić jakiekolwiek pęknięcia lub z przesunięciem jednej lub obu nici cząsteczki DNA.

Podczas dzielenia dowolnego DNA enzymem restrykcyjnym sekwencje na końcach fragmentów będą takie same. Będą mogli się ponownie połączyć, ponieważ mają witryny uzupełniające.

Możesz uzyskać pojedynczą cząsteczkę, łącząc te sekwencje za pomocą Ligazy DNA. Dzięki temu możliwe jest połączenie fragmentów dwóch różnych DNA i uzyskanie zrekombinowanego DNA.

3.2. PCR

Metoda opiera się na zdolności polimeraz DNA do uzupełniania drugiej nici DNA wzdłuż nici komplementarnej w taki sam sposób, jak w procesie replikacji DNA w komórce.

3.3. sekwencjonowanie DNA

Szybki rozwój metody sekwencjonowania umożliwia efektywne określenie cech badanego organizmu na poziomie jego genomu. Główną zaletą takich technologii genomicznych i postgenomicznych jest zwiększenie możliwości badań i studiowania genetycznej natury chorób człowieka w celu podjęcia z wyprzedzeniem niezbędnych działań i uniknięcia chorób.

Dzięki szeroko zakrojonym badaniom możliwe jest uzyskanie niezbędnych danych na temat różnych cech genetycznych różnych grup ludzi, a tym samym opracowanie metod medycyny. Z tego powodu identyfikacja predyspozycji genetycznych do różnych chorób jest dziś bardzo popularna.

Podobne metody są szeroko stosowane praktycznie na całym świecie, w tym w Rosji. W związku z postępem naukowym następuje wprowadzanie takich metod do badań medycznych i ogólnie do praktyki medycznej.

4. Biotechnologia

Biotechnologia- dyscyplina badająca możliwości wykorzystania żywych organizmów lub ich systemów do rozwiązywania problemów technologicznych, a także tworzenia żywych organizmów o pożądanych właściwościach poprzez inżynierię genetyczną. Biotechnologia wykorzystuje metody chemii, mikrobiologii, biochemii i oczywiście biologii molekularnej.

Główne kierunki rozwoju biotechnologii (zasady procesów biotechnologicznych wprowadzane są do produkcji wszystkich branż):

1. Tworzenie i produkcja nowych rodzajów żywności i pasz dla zwierząt.
2. Pozyskiwanie i badanie nowych szczepów mikroorganizmów.
3. Hodowla nowych odmian roślin, a także tworzenie środków ochrony roślin przed chorobami i szkodnikami.
4. Zastosowanie metod biotechnologicznych na potrzeby ekologii. Takie metody biotechnologiczne są wykorzystywane do recyklingu odpadów, oczyszczania ścieków, oczyszczania powietrza wywiewanego i gleby.
5. Produkcja witamin, hormonów, enzymów, serum na potrzeby medycyny. Biotechnologowie opracowują ulepszone leki, które wcześniej uważano za nieuleczalne.

Głównym osiągnięciem biotechnologii jest inżynieria genetyczna.

Inżynieria genetyczna- zestaw technologii i metod pozyskiwania rekombinowanych cząsteczek RNA i DNA, izolowania poszczególnych genów z komórek, manipulacji genami i wprowadzania ich do innych organizmów (bakterie, drożdże, ssaki). Takie organizmy są w stanie wytwarzać produkty końcowe o pożądanych, zmodyfikowanych właściwościach.

Metody inżynierii genetycznej mają na celu konstruowanie nowych, wcześniej nieistniejących kombinacji genów w przyrodzie.

Mówiąc o osiągnięciach inżynierii genetycznej nie sposób nie poruszyć tematu klonowania. Klonowanie jest jedną z metod biotechnologii wykorzystywanych do uzyskania identycznego potomstwa różnych organizmów poprzez rozmnażanie bezpłciowe.

Innymi słowy, klonowanie można traktować jako proces tworzenia genetycznie identycznych kopii organizmu lub komórki. A sklonowane organizmy są podobne lub całkowicie identyczne nie tylko pod względem cech zewnętrznych, ale także treści genetycznej.

Słynna owca Dolly w 1966 roku stała się pierwszym sklonowanym ssakiem. Został on uzyskany przez przeszczepienie jądra komórki somatycznej do cytoplazmy jaja. Dolly była genetyczną kopią owcy dawcy jądra komórkowego. W warunkach naturalnych osobnik powstaje z jednego zapłodnionego jaja, otrzymując połowę materiału genetycznego od dwóch rodziców. Jednak podczas klonowania materiał genetyczny został pobrany z komórki jednego osobnika. Najpierw z zygoty usunięto jądro, które zawiera samo DNA. Następnie usunęli jądro z komórki dorosłej owcy i wszczepili je do tej zygoty bez jądra, a następnie przeszczepiono je do macicy dorosłej osoby i umożliwiono jej wzrost i rozwój.

Jednak nie wszystkie próby klonowania zakończyły się sukcesem. Równolegle z klonowaniem Dolly przeprowadzono eksperyment wymiany DNA na 273 innych jajach. Ale tylko w jednym przypadku żywe dorosłe zwierzę mogło się w pełni rozwinąć i rosnąć. Po Dolly naukowcy próbowali sklonować inne typy ssaków.

Jednym z rodzajów inżynierii genetycznej jest edycja genomu.

Narzędzie CRISPR/Cas opiera się na elemencie systemu obrony immunologicznej bakterii, który naukowcy przystosowali do wprowadzania jakichkolwiek zmian w DNA zwierząt lub roślin.

CRISPR/Cas to jedna z biotechnologicznych metod manipulacji poszczególnymi genami w komórkach. Zastosowań tej technologii jest wiele. CRISPR/Cas umożliwia naukowcom poznanie funkcji różnych genów. Aby to zrobić, wystarczy wyciąć z DNA badany gen i zbadać, które funkcje organizmu zostały naruszone.

Kilka praktycznych zastosowań systemu:

1. Rolnictwo. Dzięki systemom CRISPR/Cas plony można poprawić. Mianowicie, aby były smaczniejsze i bardziej pożywne, a także odporne na ciepło. Możliwe jest nadanie roślinom innych właściwości: np. wycięcie genu alergenu z orzechów (orzechów ziemnych lub laskowych).
2. Medycyna, choroby dziedziczne. Naukowcy mają na celu wykorzystanie CRISPR/Cas do usunięcia mutacji z ludzkiego genomu, które mogą powodować choroby, takie jak anemia sierpowata itp. Teoretycznie CRISPR/Cas może powstrzymać rozwój HIV.
3. Napęd genowy. CRISPR/Cas może zmienić nie tylko genom pojedynczego zwierzęcia lub rośliny, ale także pulę genów gatunku. Ta koncepcja jest znana jako „napęd genowy”. Każdy żywy organizm przekazuje połowę swoich genów potomstwu. Jednak użycie CRISPR/Cas może zwiększyć prawdopodobieństwo przeniesienia genów nawet o 100%. Jest to ważne, aby pożądana cecha rozprzestrzeniała się szybciej w populacji.

Szwajcarscy naukowcy znacznie udoskonalili i unowocześnili metodę edycji genomu CRISPR/Cas, rozszerzając w ten sposób jej możliwości. Jednak naukowcy mogli modyfikować tylko jeden gen na raz za pomocą systemu CRISPR/Cas. Ale teraz badacze szwajcarskiej Wyższej Technikum Zurich opracowali metodę, dzięki której możliwa jest jednoczesna modyfikacja 25 genów w komórce.

W najnowszej technice eksperci wykorzystali enzym Cas12a. Genetycy po raz pierwszy w historii z powodzeniem sklonowali małpy. „Mechanika popularna”;

Nikolenko S. (2012). Genomika: Stwierdzenie problemu i metody sekwencjonowania. „Postauka”.

wywiad

Pirogov Sergey – uczestnik przygotowań do olimpiady z biologii zorganizowanej przez „Słoń i żyrafa” w 2012 roku.
Laureat Międzynarodowej Uniwersjady w Biologii
Zwycięzca Olimpiady „Łomonosow”
Zwycięzca regionalnego etapu Ogólnorosyjskiej Olimpiady Biologicznej w 2012 r.
Studiuje na Moskiewskim Uniwersytecie Państwowym. Śr. Łomonosowa na Wydziale Biologii: Katedra Biologii Molekularnej, student VI roku. Pracuje w Pracowni Biochemicznej Genetyki Zwierząt Instytutu Genetyki Molekularnej.

- Seryozha, jeśli czytelnicy mają pytania, czy będą mogli cię zadać?

Tak, oczywiście możesz zadawać pytania przynajmniej od razu. W tym polu:

Kliknij tutaj, aby zadać pytanie.

- Zacznijmy od szkoły, nie miałeś super fajnej szkoły?

Uczyłem się w bardzo słabej moskiewskiej szkole, takiej przeciętnej liceum. To prawda, że ​​mieliśmy wspaniałego nauczyciela w Moskiewskim Teatrze Artystycznym, dzięki czemu mieliśmy w szkole w dużej mierze nominalną orientację na „krytykę sztuki”.

- A co z biologią?

Nasza nauczycielka biologii była bardzo starą, głuchą i bystrą kobietą, której wszyscy się bali. Ale miłość do jej tematu nie dodała. Pasjonuję się biologią od dzieciństwa, od piątego roku życia. Czytam wszystko sama, głównie zafascynowana anatomią i zoologią. Więc przybory szkolne istniał równolegle do moich własnych zainteresowań. Igrzyska zmieniły wszystko.

- Powiedz mi więcej o tym.

W 7 klasie po raz pierwszy brałam udział w etapie miejskim (oczywiście z prawie wszystkich przedmiotów naraz, bo byłam jedyną uczennicą, której nauczyciele mieli powody wysłać). I wygrał w biologii. Wtedy szkoła potraktowała to jako zabawny, ale niezbyt ciekawy fakt.

- Pomogło ci to w szkole?

Pamiętam, że mimo błyskotliwych studiów często dostawałem B od nauczyciela biologii z czepianiem się, jak „na rysunku odcinka cebuli korzenie powinny być pomalowane na brązowo, a nie na szaro”. To wszystko było dość przygnębiające. W 8 klasie ponownie poszedłem na olimpiadę, ale z jakiegoś powodu nie zostałem wysłany na biologię. Ale został zwycięzcą i zdobywcą nagród w innych dziedzinach.

- Co się stało w 9 klasie?

W 9 klasie nie poszedłem do etapu powiatowego. Tam niespodziewanie zdobyłem słaby, graniczny wynik, który jednak okazał się przechodzeniem do etapu regionalnego. Miało to potężną siłę motywującą – uświadomienie sobie, ile nie wiem i ile osób to wszystko wie (ile takich osób w skali kraju nawet bałam się sobie wyobrazić).

- Powiedz nam, jak się przygotowałeś.

Intensywna samodzielna nauka, wypady do księgarni i tysiące zeszłorocznych zadań miały działanie lecznicze. Zdobyłem jedną z najwyższych ocen za teorię (co też było dla mnie zupełnie nieoczekiwane), przeszedłem do etapu praktycznego… i oblałem. Wtedy nawet nie wiedziałem o istnieniu sceny praktycznej.

- Czy olimpiada miała na ciebie wpływ?

Moje życie zmieniło się radykalnie. Dowiedziałem się o wielu innych olimpiadach, szczególnie zakochałem się w SBO. Następnie pokazał wiele ładne wyniki, niektórzy wygrali, dzięki „Lomonosovskaya” dostała prawo do wjazdu bez egzaminów. Jednocześnie wygrywałem olimpiady w historii sztuki, do których wciąż nierówno oddycham. To prawda, że ​​nie przyjaźnił się z praktycznymi wycieczkami. W 11 klasie dotarłem jednak do ostatniego etapu, ale Fortuna nie sprzyjała i tym razem nie zdążyłem wypełnić macierzy odpowiedzi etapu teoretycznego. Ale to pozwoliło nie martwić się zbytnio o praktyczność.

- Spotkałeś wiele olimpiad?

Tak, nadal uważam, że miałem szczęście do grona rówieśników, którzy znacznie poszerzyli moje horyzonty. Drugą stroną olimpiad, oprócz motywacji do bardziej harmonijnego studiowania przedmiotu, była znajomość olimpiad. Już wtedy zauważyłem, że komunikacja pozioma jest czasem bardziej użyteczna niż komunikacja pionowa – z nauczycielami na obozie szkoleniowym.

- Jak wszedłeś na uniwersytet? Wybrałeś wydział?

Po 11 klasie wstąpiłem na Wydział Biologii Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego. Tylko większość moich ówczesnych towarzyszy dokonała wyboru na korzyść FBB, ale tutaj pierwszoplanową rolę odegrał fakt, że nie zostałem zwycięzcą Wszechrosyjskiego. Musiałabym więc zdać egzamin wewnętrzny z matematyki, aw nim, szczególnie w szkole – zakochałam się w wyższym o wiele bardziej – nie byłam silna. A przygotowanie w szkole było bardzo słabe (nie byliśmy nawet przygotowani do prawie całej części C). Jeśli chodzi o zainteresowania, już wtedy domyślałem się, że w końcu można dojść do dowolnego rezultatu, niezależnie od miejsca przyjęcia. Później okazało się, że jest wielu absolwentów FBB, którzy przeszli na biologię głównie mokrą i odwrotnie – wielu dobrych bioinformatyków zaczynało jako amatorzy. Chociaż w tamtym momencie wydawało mi się, że kontyngent na wydziale biologii będzie inny niż na FBBshny. W tym z pewnością się myliłem.

Czy wiedziałeś?

ciekawe

Czy wiedziałeś?

ciekawe

W obozie Słonia i Żyrafy odbywają się zmiany w biochemii i biologii molekularnej, gdzie uczniowie wraz z doświadczonymi nauczycielami z Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego przygotowują eksperymenty, a także przygotowują się do olimpiad.

© Wywiad przeprowadził Reshetov Denis. Zdjęcia uprzejmie udostępnił Sergey Pirogov.

31.2

Dla przyjaciół!

sprawdzenie

Biologia molekularna wyrosła z biochemii w kwietniu 1953 roku. Jego wygląd kojarzy się z nazwiskami Jamesa Watsona i Francisa Cricka, którzy odkryli strukturę cząsteczki DNA. Odkrycie stało się możliwe dzięki badaniu genetyki, bakterii i biochemii wirusów. Zawód biologa molekularnego nie jest powszechny, ale dziś jego rola we współczesnym społeczeństwie jest bardzo duża. Duża liczba chorób, w tym manifestujących się na poziomie genetycznym, wymaga od naukowców znalezienia rozwiązań tego problemu.

Opis działalności

Wirusy i bakterie nieustannie mutują, co oznacza, że ​​leki nie pomagają już człowiekowi, a choroby stają się nieuleczalne. Zadaniem biologii molekularnej jest wyprzedzenie tego procesu i opracowanie nowego leku na choroby. Naukowcy pracują według ustalonego schematu: blokując przyczynę choroby, eliminując mechanizmy dziedziczności, a tym samym łagodząc stan pacjenta. Na całym świecie istnieje wiele ośrodków, klinik i szpitali, w których biolodzy molekularni opracowują nowe metody leczenia, aby pomóc pacjentom.

Odpowiedzialność zawodowa

Obowiązki biologa molekularnego obejmują badanie procesów zachodzących w komórce (na przykład zmian w DNA podczas rozwoju nowotworów). Eksperci badają również cechy DNA, ich wpływ na cały organizm i pojedynczą komórkę. Takie badania przeprowadzane są np. na podstawie PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy), która pozwala na analizę organizmu pod kątem infekcji, chorób dziedzicznych oraz określenie pokrewieństwa biologicznego.

Cechy rozwoju kariery

Zawód biologa molekularnego jest dość obiecujący w swojej dziedzinie i już dziś pretenduje do miana pierwszego w rankingu zawodów medycznych przyszłości. Nawiasem mówiąc, biolog molekularny nie musi cały czas przebywać w tej dziedzinie. Jeśli istnieje chęć zmiany zawodu, może przekwalifikować się na kierownika sprzedaży sprzętu laboratoryjnego, rozpocząć opracowywanie instrumentów do różnych badań lub otworzyć własną firmę.

Rozwój biochemii, biofizyki, genetyki, cytochemii, wielu działów mikrobiologii i wirusologii około początku lat 40-tych XX wieku. ściśle doprowadziły do ​​badania zjawisk życiowych na poziomie molekularnym. Sukcesy osiągnięte przez te nauki, jednocześnie iz różnych stron, doprowadziły do ​​uświadomienia sobie, że to na poziomie molekularnym główne systemy kontroli organizmu funkcjonują i dalszy postęp tych nauk będzie zależał od ujawnienia biologiczne funkcje cząsteczek tworzących ciała organizmów, ich udział w syntezie i rozpadzie, wzajemnych przemianach i reprodukcji związków w komórce, a także wymiana energii i informacji, która w tym przypadku zachodzi. W ten sposób na styku tych dyscyplin biologicznych z chemią i fizyką powstała zupełnie nowa gałąź - biologia molekularna.

W przeciwieństwie do biochemii, uwaga współczesnej biologii molekularnej skupia się głównie na badaniu struktury i funkcji najważniejszych klas biopolimerów - białek i kwasów nukleinowych, z których pierwsza determinuje samą możliwość wystąpienia reakcji metabolicznych, a druga - biosynteza określonych białek. Jest zatem jasne, że nie da się wyraźnie rozróżnić biologii molekularnej i biochemii, odpowiadających im gałęzi genetyki, mikrobiologii i wirusologii.

Pojawienie się biologii molekularnej było ściśle związane z rozwojem nowych metod badawczych, które zostały już omówione w odpowiednich rozdziałach. Wraz z rozwojem mikroskopii elektronowej i innych metod techniki mikroskopowej ważną rolę odegrały opracowane w latach pięćdziesiątych metody frakcjonowania elementów komórkowych. Opierały się one na ulepszonych metodach wirowania różnicowego (A. Claude, 1954). Do tego czasu istniały już dość niezawodne metody izolacji i frakcjonowania biopolimerów. Obejmuje to w szczególności metodę frakcjonowania białek przez elektroforezę zaproponowaną przez A. Tiseliusa (1937; Nagroda Nobla, 1948), metody izolacji i oczyszczania kwasów nukleinowych (E. Kay, A. Downs, M. Sevag, A. Mirsky i inne. ). W tym samym czasie w wielu laboratoriach świata opracowano różne metody analizy chromatograficznej (A. Martin i R. Sing, 1941; Nagroda Nobla, 1952), które następnie zostały znacznie ulepszone.

Analiza dyfrakcji rentgenowskiej odegrała nieocenioną rolę w rozszyfrowaniu struktury biopolimerów. Podstawowe zasady analizy dyfrakcji rentgenowskiej zostały opracowane w King's College London University pod kierownictwem W. Bragga przez grupę badaczy, w skład której wchodzili J. Bernal, A. Londsdale, W. Astbury, J. Robertson i inni.

Na szczególną uwagę zasługują badania profesora Moskowskiego Uniwersytet stanowy A. R. Kizel o biochemii protoplazmy (1925 - 1929), które miały ogromne znaczenie dla późniejszego powstania biologii molekularnej. Kizel zadał cios mocno zakorzenionej idei, że w sercu każdej protoplazmy znajduje się specjalne ciało białkowe - płytki, które rzekomo determinują wszystkie jej najważniejsze strukturalne i cechy funkcjonalne. Pokazał, że płytki są białkiem, które znajduje się tylko w myksomycetes, a następnie na pewnym etapie rozwoju, i że w protoplazmie nie ma stałego składnika - pojedynczego białka szkieletowego. Tym samym badanie problemu budowy protoplazmy i funkcjonalnej roli białek poszło właściwą drogą i uzyskało pole do jej rozwoju. Badania Kisela zdobyły uznanie na całym świecie, stymulując badania chemii części składowych komórki.

Termin „biologia molekularna”, po raz pierwszy użyty przez angielskiego krystalografa W. Astbury, profesora na Uniwersytecie w Leeds, pojawił się prawdopodobnie na początku lat 40. (przed 1945 r.). Podstawowe badania dyfrakcji rentgenowskiej białek i DNA, przeprowadzone przez Astbury w latach 30. XX wieku, posłużyły jako podstawa do późniejszego udanego rozszyfrowania struktury drugorzędowej tych biopolimerów. W 1963 r. J. Bernal pisał: „Pomnik mu wzniesie cała biologia molekularna – nauka, którą nazwał i rzeczywiście założył” * , W literaturze termin ten pojawił się po raz pierwszy być może w 1946 r. w artykule W. Astbury „Postępy w analizie dyfrakcyjnej rentgenowskiej związków organicznych i fibrylarnych”, opublikowanym w angielskim czasopiśmie „Nature” ** . W swoim Harvey Lecture, Astbury (1950) zauważył: "Cieszę się, że termin biologia molekularna jest obecnie dość powszechnie używany, chociaż jest mało prawdopodobne, abym go zaproponował jako pierwszy. Spodobał mi się i od dawna próbowałem go rozpowszechniać ”***. Już w 1950 roku Astbury było jasne, że biologia molekularna zajmuje się przede wszystkim strukturą i konformacją makrocząsteczek, których badanie ma decydujące znaczenie dla zrozumienia funkcjonowania organizmów żywych.

* (biogr. Pam. Koledzy Roy. Soc, 1963, t. 9, 29.)

** (WT Astbury. Postępy analizy rentgenowskiej struktur organicznych i włóknistych.- Przyroda,. 1946, ks. 157, 121.)

*** (WT Astbury. Przygody w biologii molekularnej. Thomas Springfield, 1952, s. 3.)

Biologia molekularna stanęła i stoi przed tymi samymi zadaniami, co biologia jako całość - poznaniem istoty życia i jego głównych zjawisk, w szczególności takich jak dziedziczność i zmienność. Współczesna biologia molekularna ma na celu przede wszystkim rozszyfrowanie struktury i funkcji genów, sposobów i mechanizmów realizacji informacji genetycznej organizmów na różnych etapach ontogenezy i na różnych etapach jej odczytywania. Ma na celu ujawnienie subtelnych mechanizmów regulacji aktywności genów i różnicowania komórek, wyjaśnienie natury mutagenezy i molekularnych podstaw procesu ewolucyjnego.

Ustalenie genetycznej roli kwasów nukleinowych

Dla rozwoju biologii molekularnej największe znaczenie miały następujące odkrycia. W 1944 roku amerykańscy badacze O. Avery, K. McLeod (Nagroda Nobla, 1923) i M. McCarthy wykazali, że cząsteczki DNA wyizolowane z pneumokoków mają aktywność transformującą. Po hydrolizie tych DNA przez dezoksyrybonukleazę ich aktywność transformująca całkowicie zanikła. W ten sposób po raz pierwszy przekonująco udowodniono, że to DNA, a nie białko, ma w komórce funkcje genetyczne.

Należy uczciwie zauważyć, że zjawisko transformacji bakteryjnej zostało odkryte znacznie wcześniej niż odkrycie Avery'ego, McLeoda i McCarthy'ego. W 1928 roku F. Griffith opublikował artykuł, w którym donosił, że po dodaniu zabitych komórek otoczkowanego wirulentnego szczepu do niezjadliwych (nieotoczkowanych) pneumokoków, powstała mieszanina komórek staje się śmiertelna dla myszy. Ponadto żywe komórki pneumokoków wyizolowane ze zwierząt zakażonych tą mieszaniną były już zjadliwe i posiadały otoczkę polisacharydową. Tak więc w tym eksperymencie wykazano, że pod wpływem niektórych składników uśmierconych komórek pneumokokowych nieotoczkowata forma bakterii zamienia się w wirulentną formę tworzącą otoczkę. Szesnaście lat później Avery, McLeod i McCarthy zastąpili w tym eksperymencie zabite całe komórki pneumokoków ich kwasem dezoksyrybonukleinowym i wykazali, że to DNA miało aktywność transformującą (patrz także rozdziały 7 i 25). Trudno przecenić znaczenie tego odkrycia. Stymulowało badania kwasów nukleinowych w wielu laboratoriach na całym świecie i zmusiło naukowców do skupienia się na DNA.

Wraz z odkryciem na początku lat pięćdziesiątych Avery'ego, McLeoda i McCarthy'ego zgromadzono już dość dużą ilość bezpośrednich i pośrednich dowodów na to, że kwasy nukleinowe odgrywają wyjątkową rolę w życiu i pełnią funkcję genetyczną. Wskazuje na to w szczególności charakter lokalizacji DNA w komórce oraz dane R. Vendrelli (1948), że zawartość DNA w komórce jest ściśle stała i koreluje ze stopniem ploidii: w haploidalnych komórkach zarodkowych DNA jest połowę tego w diploidalnych komórkach somatycznych. Wyraźna stabilność metaboliczna DNA również świadczyła na korzyść genetycznej roli DNA. Na początku lat 50. nagromadziło się wiele różnych faktów, które wskazują, że większość znanych czynników mutagennych działa głównie na kwasy nukleinowe, aw szczególności na DNA (R. Hotchkiss, 1949; G. Ephrussi-Taylor, 1951; E. Freese, 1957 i inni).

Szczególne znaczenie w ustaleniu genetycznej roli kwasów nukleinowych miało badanie różnych fagów i wirusów. W 1933 D. Schlesinger znalazł DNA w bakteriofagu Escherichia coli. Od czasu izolacji W. Stanleya (1935, Nagroda Nobla, 1946) wirusa mozaiki tytoniu (TMV) w stanie krystalicznym, Nowa scena w badaniu wirusów roślinnych. W latach 1937 - 1938. pracownicy Stacji Rolniczej Rothamsted (Anglia) F. Bowden i N. Pirie wykazali, że wiele izolowanych przez nich wirusów roślinnych nie jest globulinami, lecz rybonukleoproteinami i zawiera kwas nukleinowy jako obowiązkowy składnik. Na samym początku lat 40. ukazały się prace G. Schramma (1940), PA Agatowa (1941), G. Millera i W. Stanleya (1941) wskazujące, że zauważalna modyfikacja chemiczna składnika białkowego nie prowadzi do utraty zakaźności TMV. Wskazuje to, że składnik białkowy nie może być nośnikiem dziedzicznych właściwości wirusa, jak uważało wielu mikrobiologów. Przekonujące dowody na korzyść genetycznej roli kwasu nukleinowego (RNA) w wirusach roślinnych uzyskali w 1956 r. G. Schramm w Tübingen (FRG) i H. Frenkel-Konrath w Kalifornii (USA). Badacze ci niemal jednocześnie i niezależnie od siebie wyizolowali RNA z TMV i wykazali, że to on, a nie białko, ma zakaźność: w wyniku infekcji roślin tytoniu tym RNA powstały i namnażały się w nich normalne cząsteczki wirusa. Oznaczało to, że RNA zawierał informacje potrzebne do syntezy i składania wszystkich składników wirusa, w tym białka wirusa. W 1968 r. I. G. Atabekov ustalił, że białko odgrywa znaczącą rolę w samej infekcji roślin - charakter białka determinuje spektrum roślin żywicielskich.

W 1957 roku Frenkel-Konrat po raz pierwszy przeprowadził rekonstrukcję TMV z jego składowych składników - RNA i białka. Wraz z normalnymi cząsteczkami otrzymał mieszane „hybrydy”, w których RNA pochodziło z jednego szczepu, a białko z drugiego. Dziedziczność takich hybryd była całkowicie determinowana przez RNA, a potomstwo wirusów należało do szczepu, którego RNA użyto do uzyskania początkowych zmieszanych cząstek. Późniejsze eksperymenty A. Gierera, G. Schustera i G. Schramma (1958) i G. Witmana (1960 - 1966) wykazały, że modyfikacja chemiczna składnika nukleinowego TMV prowadzi do pojawienia się różnych mutantów tego wirusa.

W 1970 roku D. Baltimore i G. Temin odkryli, że transfer informacji genetycznej może zachodzić nie tylko z DNA do RNA, ale odwrotnie. Odkryli w niektórych onkogennych wirusach zawierających RNA (onkornawirusy) specjalny enzym, tak zwaną odwrotną transkryptazę, który jest zdolny do syntetyzowania komplementarnego DNA na łańcuchach RNA. To ważne odkrycie umożliwiło zrozumienie mechanizmu wstawiania informacji genetycznej wirusów zawierających RNA do genomu gospodarza i świeże spojrzenie na naturę ich działania onkogennego.

Odkrycie kwasów nukleinowych i badanie ich właściwości

Termin kwasy nukleinowe został wprowadzony przez niemieckiego biochemika R. Altmana w 1889 r., po odkryciu tych związków w 1869 r. przez szwajcarskiego lekarza F. Mieschera. Misher przez kilka tygodni ekstrahował komórki ropne rozcieńczonym kwasem solnym, aw pozostałej części uzyskał prawie czysty materiał jądrowy. Uznał ten materiał za charakterystyczną „substancję jąder komórkowych i nazwał go nukleiną. Pod względem właściwości nukleina różniła się znacznie od białek: była bardziej kwaśna, nie zawierała siarki, ale zawierała dużo fosforu, była łatwo rozpuszczalny w alkaliach, ale nie rozpuszczalny w rozcieńczonych kwasach.

Misher przesłał wyniki swoich obserwacji dotyczących nukleiny F. Goppe-Seylerowi do publikacji w czasopiśmie. Opisana przez niego substancja była tak niezwykła (w tym czasie znana była tylko lecytyna ze wszystkich biologicznych związków zawierających fosfor), że Goppe-Seyler nie uwierzył w eksperymenty Mishera, zwrócił mu rękopis i poinstruował swoich pracowników N. Plosha i N. Lyubavina, aby sprawdź jego wnioski na innym materiale. Praca Mieschera „O składzie chemicznym komórek ropnych” została opublikowana dwa lata później (1871). W tym samym czasie opublikowano prace Goppe-Seylera i jego współpracowników na temat składu komórek ropnych, erytrocytów ptaków, węży i ​​innych komórek. W ciągu następnych trzech lat nukleinę izolowano z komórek zwierzęcych i drożdży.

W swojej pracy Misher zauważył, że szczegółowe badanie różnych nuklein może prowadzić do ustalenia różnic między nimi, wyprzedzając tym samym ideę specyficzności kwasów nukleinowych. Badając mleko łososiowe, Misher odkrył, że zawarta w nich nukleina ma postać soli i jest powiązana z głównym białkiem, które nazwał protaminą.

W 1879 r. A. Kossel rozpoczął badania nuklein w laboratorium Goppe-Seylera. W 1881 roku wyizolował hipoksantynę z nukleiny, ale w tym czasie wciąż wątpił w pochodzenie tej zasady i wierzył, że hipoksantyna może być produktem degradacji białek. W 1891 roku wśród produktów hydrolizy nuklein Kossel odkrył adeninę, guaninę, kwas fosforowy i inną substancję o właściwościach cukru. Za badania nad chemią kwasów nukleinowych Kossel otrzymał w 1910 roku Nagrodę Nobla.

Dalszy postęp w rozszyfrowaniu struktury kwasów nukleinowych wiąże się z badaniami P. Levina i współpracowników (1911 - 1934). W 1911 P. Levin i V. Jacobs zidentyfikowali węglowodanowy składnik adenozyny i guanozyny; odkryli, że te nukleozydy zawierają D-rybozę. W 1930 Lewin wykazał, że węglowodanowym składnikiem dezoksyrybonukleozydów jest 2-deoksy-D-ryboza. Z jego pracy wyszło na jaw, że kwasy nukleinowe zbudowane są z nukleotydów, czyli fosforylowanych nukleozydów. Levin uważał, że głównym rodzajem wiązania w kwasach nukleinowych (RNA) jest wiązanie fosfodiestrowe 2”, 5”. Ten pogląd okazał się błędny. Dzięki pracy angielskiego chemika A. Todda (Nagroda Nobla, 1957) i jego współpracowników, a także angielskich biochemików R. Markhama i J. Smitha, na początku lat 50. okazało się, że główny typ wiązania w RNA wynosi 3", 5" - wiązanie fosfodiestrowe.

Lewin wykazał, że różne kwasy nukleinowe mogą różnić się charakterem składnika węglowodanowego: niektóre z nich zawierają dezoksyrybozę cukru, a inne rybozę. Ponadto te dwa typy kwasów nukleinowych różniły się charakterem jednej z zasad: kwasy nukleinowe typu pentozowego zawierały uracyl, a kwasy nukleinowe typu deoksypentozowego zawierały tyminę. Kwas nukleinowy dezoksypentozowy (we współczesnej terminologii kwas dezoksyrybonukleinowy - DNA) był zwykle łatwo izolowany w dużych ilościach z grasicy (gruczołu słodkiego) cieląt. Dlatego nazwano go kwasem tymonukleinowym. Źródłem kwasu nukleinowego typu pentozowego (RNA) były głównie drożdże i kiełki pszenicy. Ten typ był często określany jako kwas nukleinowy drożdży.

We wczesnych latach 30. XX wieku pogląd, że komórki roślinne charakteryzują się kwasem nukleinowym typu drożdży, był dość mocno zakorzeniony, podczas gdy kwas tymonukleinowy był charakterystyczny tylko dla jąder komórek zwierzęcych. Dwa rodzaje kwasów nukleinowych, RNA i DNA, nazwano wówczas odpowiednio roślinnymi i zwierzęcymi kwasami nukleinowymi. Jednak, jak wykazały wczesne badania A. N. Belozersky'ego, taki podział kwasów nukleinowych jest nieuzasadniony. W 1934 r. Belozersky po raz pierwszy odkrył kwas tymonukleinowy w komórkach roślinnych: z siewek grochu wyizolował i zidentyfikował zasadę tyminy-pirymidynę, która jest charakterystyczna dla DNA. Następnie odkrył tyminę w innych roślinach (nasiona soi, fasola). W 1936 r. A. N. Belozersky i I. I. Dubrovskaya preparatywnie wyizolowali DNA z sadzonek kasztanowca. Ponadto seria badań przeprowadzonych w Anglii w latach 40. XX wieku przez D. Davidsona i współpracowników przekonująco wykazała, że ​​roślinny kwas nukleinowy (RNA) jest zawarty w wielu komórkach zwierzęcych.

Powszechne zastosowanie reakcji cytochemicznej DNA opracowanej przez R. Felgena i G. Rosenbecka (1924) oraz reakcji J. Bracheta (1944) na RNA umożliwiło szybkie i jednoznaczne rozwiązanie kwestii preferencyjnej lokalizacji tych jąder kwasy w komórce. Okazało się, że DNA jest skoncentrowany w jądrze, podczas gdy RNA jest skoncentrowany głównie w cytoplazmie. Później odkryto, że RNA jest zawarte zarówno w cytoplazmie, jak iw jądrze, a ponadto zidentyfikowano cytoplazmatyczne DNA.

Jeśli chodzi o kwestię pierwotnej struktury kwasów nukleinowych, w połowie lat czterdziestych XX wieku idea P. Levina została mocno zakorzeniona w nauce, zgodnie z którą wszystkie kwasy nukleinowe są zbudowane według tego samego typu i składają się z tego samego tak zwanego tetranukleotydu Bloki. Każdy z tych bloków, według Lewina, zawiera cztery różne nukleotydy. Teoria tetranukleotydowa struktury kwasów nukleinowych w dużej mierze pozbawiła te biopolimery specyficzności. Nic więc dziwnego, że w tym czasie wszystkie specyfiki żywych istot były związane tylko z białkami, których natura monomerów jest znacznie bardziej zróżnicowana (20 aminokwasów).

Pierwszą lukę w teorii budowy tetranukleotydów kwasów nukleinowych zrobiły dane analityczne angielskiego chemika J. Goulanda (1945 - 1947). Przy określaniu składu kwasów nukleinowych zasadowym azotem nie uzyskał równomolowego stosunku zasad, jak powinien był według teorii Lewina. Wreszcie teoria tetranukleotydowa struktury kwasów nukleinowych upadła w wyniku badań E. Chargaffa i jego współpracowników (1949 - 1951). Chargaff zastosował chromatografię papierową do oddzielenia zasad uwolnionych z DNA w wyniku hydrolizy kwasowej. Każda z tych zasad została dokładnie określona spektrofotometrycznie. Chargaff zauważył znaczne odchylenia od równomolowego stosunku zasad w DNA różnego pochodzenia i po raz pierwszy zdecydowanie stwierdził, że DNA ma wyraźną specyficzność gatunkową. To zakończyło hegemonię koncepcji specyficzności białek w żywej komórce. Analizując DNA o różnym pochodzeniu, Chargaff odkrył i sformułował unikalne wzory składu DNA, które weszły do ​​nauki pod nazwą zasad Chargaffa. Zgodnie z tymi zasadami, we wszystkich DNA, niezależnie od pochodzenia, ilość adeniny jest równa ilości tyminy (A = T), ilość guaniny jest równa ilości cytozyny (G = C), ilość puryn jest równa ilości pirymidyn (G + A = C + T), ilość zasad z grupami 6-aminowymi jest równa ilości zasad z grupami 6-keto (A + C = G + T). Jednocześnie, pomimo tak ścisłych zależności ilościowych, DNA różnych gatunków różni się wartością stosunku A+T:G+C. W niektórych DNA ilość guaniny i cytozyny przeważa nad ilością adeniny i tyminy (Chargaff nazwał te DNA DNA typu GC); inne DNA zawierały więcej adeniny i tyminy niż guanina i cytozyna (te DNA nazwano DNA typu AT). Uzyskane przez Chargaffa dane na temat składu DNA odegrały wyjątkową rolę w biologii molekularnej. To właśnie one stały się podstawą do odkrycia struktury DNA, dokonanego w 1953 roku przez J. Watsona i F. Cricka.

W 1938 roku W. Astbury i F. Bell, stosując analizę dyfrakcji rentgenowskiej, wykazali, że płaszczyzny bazowe w DNA powinny być prostopadłe do długiej osi cząsteczki i przypominać jakby stos płytek leżący powyżej inny. Wraz z udoskonaleniem techniki analizy dyfrakcyjnej promieniowania rentgenowskiego w latach 1952 - 1953. zgromadzono informacje, które umożliwiły ocenę długości poszczególnych wiązań i kątów nachylenia. Umożliwiło to przedstawienie z największym prawdopodobieństwem natury orientacji pierścieni reszt pentozowych w szkielecie cukrowo-fosforanowym cząsteczki DNA. W 1952 S. Farberg zaproponował dwa spekulacyjne modele DNA, które przedstawiały jednoniciową cząsteczkę zwiniętą lub skręconą na sobie. Nie mniej spekulatywny model struktury DNA zaproponowali w 1953 r. L. Pauling (laureat Nagrody Nobla, 1954) i R. Corey. W tym modelu trzy skręcone nici DNA utworzyły długą helisę, której rdzeń był reprezentowany przez grupy fosforanowe, a zasady znajdowały się poza nią. Do 1953 roku M. Wilkins i R. Franklin uzyskali wyraźniejsze wzory dyfrakcji rentgenowskiej DNA. Ich analiza wykazała całkowitą porażkę modeli Farberga, Paulinga i Coreya. Korzystając z danych Chargaffa, porównując różne kombinacje modeli molekularnych poszczególnych monomerów i danych dyfrakcji rentgenowskiej, J. Watson i F. Crick w 1953 r. doszli do wniosku, że cząsteczka DNA musi być dwuniciową helisą. Reguły Chargaffa poważnie ograniczyły liczbę możliwych uporządkowanych kombinacji zasad w proponowanym modelu DNA; zasugerowali Watsonowi i Crickowi, że w cząsteczce DNA musi istnieć specyficzna para zasad - adenina z tyminą i guanina z cytozyną. Innymi słowy, adenina w jednej nici DNA zawsze ściśle odpowiada tyminie w drugiej nici, a guanina w jednej nici koniecznie odpowiada cytozynie w drugiej. Tak więc Watson i Crick jako pierwsi sformułowali niezwykle ważną zasadę komplementarnej struktury DNA, zgodnie z którą jedna nić DNA uzupełnia inną, tj. sekwencja zasad jednej nici jednoznacznie określa sekwencję zasad drugiej (komplementarnej) nici. . Stało się oczywiste, że już w samej strukturze DNA tkwi potencjał do jego dokładnej reprodukcji. Ten model struktury DNA jest obecnie powszechnie akceptowany. Crick, Watson i Wilkins otrzymali Nagrodę Nobla w 1962 za rozszyfrowanie struktury DNA.

Należy zauważyć, że pomysł mechanizmu dokładnej reprodukcji makrocząsteczek i przekazywania informacji dziedzicznych zrodził się w naszym kraju. W 1927 r. N. K. Koltsov zasugerował, że podczas rozmnażania komórek reprodukcja cząsteczek następuje przez dokładne autokatalityczne rozmnażanie istniejących cząsteczek rodzicielskich. To prawda, że ​​\u200b\u200bw tym czasie Kolcow obdarzył tę właściwość nie cząsteczkami DNA, ale cząsteczkami o charakterze białkowym, których funkcjonalne znaczenie było wówczas nieznane. Niemniej jednak sama idea autokatalitycznego rozmnażania makrocząsteczek i mechanizmu przenoszenia właściwości dziedzicznych okazała się prorocza: stała się ideą przewodnią współczesnej biologii molekularnej.

Przeprowadzone w laboratorium A. N. Belozersky'ego przez A. S. Spirina, G. N. Zaitseva, B. F. Vanyushina, S. O. Uryson, A. S. Antonova i innych, w pełni potwierdziły wzorce odkryte przez Chargaffa i pełną zgodność z molekularnym modelem struktury DNA zaproponowanym przez Watsona i Cricka. Badania te wykazały, że DNA różnych bakterii, grzybów, alg, promieniowców, roślin wyższych, bezkręgowców i kręgowców ma specyficzny skład. Różnice w składzie (zawartość par zasad AT) są szczególnie wyraźne w mikroorganizmach, co okazuje się ważną cechą taksonomiczną. U wyższych roślin i zwierząt różnice gatunkowe w składzie DNA są znacznie mniej wyraźne. Ale to nie znaczy, że ich DNA jest mniej specyficzne. Oprócz składu zasad o specyficzności w dużej mierze decyduje ich sekwencja w łańcuchach DNA.

Oprócz zwykłych zasad w DNA i RNA znaleziono dodatkowe zasady azotowe. Tak więc G. White (1950) znalazł 5-metylocytozynę w DNA roślin i zwierząt, a D. Dunn i J. Smith (1958) znaleźli metylowaną adeninę w niektórych DNA. Przez długi czas metylocytozyna była uważana za znak rozpoznawczy materiału genetycznego organizmów wyższych. W 1968 r. A. N. Belozersky, B. F. Vanyushin i N. A. Kokurina odkryli, że można go również znaleźć w DNA bakterii.

W 1964 roku M. Gold i J. Hurwitz odkryli nową klasę enzymów, które dokonują naturalnej modyfikacji DNA – jego metylacji. Po tym odkryciu stało się jasne, że mniejsze (zawarte w niewielkich ilościach) zasady powstają już na gotowym łańcuchu polinukleotydowym DNA w wyniku specyficznej metylacji reszt cytozyny i adeniny w specjalnych sekwencjach. W szczególności, według B. F. Vanyushin, Ya. I. Buryanov i A. N. Belozersky (1969), metylacja adeniny w DNA Escherichia coli może zachodzić w kodonach kończących. Według AN Belozersky'ego i współpracowników (1968 - 1970), a także M. Meselsona (USA) i V. Arbera (Szwajcaria) (1965 - 1969), metylacja nadaje cząsteczkom DNA unikalne indywidualne cechy i w połączeniu z działaniem specyficzne nukleazy, jest częścią złożonego mechanizmu kontrolującego syntezę DNA w komórce. Innymi słowy, charakter metylacji danego DNA przesądza o tym, czy może się on rozmnażać w danej komórce.

Niemal w tym samym czasie rozpoczęła się izolacja i intensywne badania metylaz DNA i endonukleaz restrykcyjnych; w latach 1969 - 1975 ustalono sekwencje nukleotydowe rozpoznawane w DNA przez niektóre z tych enzymów (X. Boyer, X. Smith, S. Lynn, K. Murray). Gdy różne DNA są hydrolizowane przez enzym restrykcyjny, odcinane są raczej duże fragmenty z identycznymi „lepkimi” końcami. Umożliwia to nie tylko analizę struktury genów, jak ma to miejsce w przypadku małych wirusów (D. Nathans, S. Adler, 1973 - 1975), ale także konstruowanie różnych genomów. Wraz z odkryciem tych specyficznych enzymów restrykcyjnych inżynieria genetyczna stała się namacalną rzeczywistością. Osadzone w małym plazmidowym DNA geny różnego pochodzenia są już łatwo wprowadzane do różnych komórek. W ten sposób uzyskano nowy typ biologicznie aktywnych plazmidów, dających oporność na niektóre antybiotyki (S. Cohen, 1973), do plazmidów Escherichia coli wprowadzono rybosomalne geny żaby i Drosophila (J. Morrow, 1974; X. Boyer, D. Hogness, R. Davis, 1974 - 1975). W ten sposób otwierają się prawdziwe sposoby uzyskania całkowicie nowych organizmów poprzez wprowadzanie i integrowanie różnych genów do ich puli genów. To odkrycie może być skierowane na korzyść całej ludzkości.

W 1952 G. White i S. Cohen odkryli, że DNA fagów T-even zawiera niezwykłą zasadę – 5-hydroksymetylocytozynę. Później z prac E. Volkina i R. Sinsheimera (1954) i Cohena (1956) wiadomo było, że reszty hydroksymetylocytozyny mogą być całkowicie lub częściowo zglukozydowane, w wyniku czego cząsteczka DNA faga jest chroniona przed działaniem hydrolitycznym nukleaz.

Na początku lat pięćdziesiątych z prac D. Dunna i J. Smitha (Anglia), S. Zamenhofa (USA) i A. Wackera (Niemcy) wyszło na jaw, że w DNA można zawrzeć wiele sztucznych analogów zasad, zastępując je niekiedy do 50% tyminy. Z reguły te podstawienia prowadzą do błędów w replikacji, transkrypcji i translacji DNA oraz do pojawienia się mutantów. Tak więc J. Marmur (1962) stwierdził, że DNA niektórych fagów zawiera oksymetylouracyl zamiast tyminy. W 1963 roku I. Takahashi i J. Marmur odkryli, że DNA jednego z fagów zawiera uracyl zamiast tyminy. W ten sposób załamała się kolejna zasada, zgodnie z którą kwasy nukleinowe były wcześniej rozdzielone. Od czasu pracy P. Levina uważano, że tymina jest znakiem rozpoznawczym DNA, a uracyl jest znakiem rozpoznawczym RNA. Stało się jasne, że znak ten nie zawsze jest wiarygodny, a zasadniczą różnicą w naturze chemicznej obu rodzajów kwasów nukleinowych, jak się dzisiaj wydaje, jest jedynie charakter składnika węglowodanowego.

W badaniu fagów odkryto wiele niezwykłych cech organizacji kwasów nukleinowych. Od 1953 uważa się, że całe DNA jest dwuniciowymi cząsteczkami liniowymi, podczas gdy RNA jest tylko jednoniciowy. Pozycja ta została znacząco zachwiana w 1961 roku, kiedy R. Sinsheimer odkrył, że DNA faga φ X 174 jest reprezentowane przez jednoniciową cząsteczkę kolistą. Jednak później okazało się, że w tej postaci ten DNA istnieje tylko w wegetatywnej cząstce faga, a forma replikacyjna DNA tego faga jest również dwuniciowa. Ponadto okazało się dość nieoczekiwane, że RNA niektórych wirusów może być dwuniciowe. Ten nowy typ makromolekularnej organizacji RNA został odkryty w 1962 roku przez P. Gomatosa, I. Tamma i innych badaczy niektórych wirusów zwierzęcych i wirusa nowotworowego ran roślin. Niedawno V. I. Agol i A. A. Bogdanov (1970) ustalili, że oprócz liniowych cząsteczek RNA istnieją również cząsteczki zamknięte lub cykliczne. Wykryli cykliczny dwuniciowy RNA, w szczególności w wirusie zapalenia mózgu i rdzenia. Dzięki pracom X. Deveaux, L. Tinoko, T. I. Tikhonenko, E. I. Budovsky i innych (1960 - 1974) poznano główne cechy organizacji (układania) materiału genetycznego w bakteriofagach.

Pod koniec lat pięćdziesiątych amerykański naukowiec P. Doty odkrył, że ogrzewanie powoduje denaturację DNA, której towarzyszy zerwanie wiązań wodorowych między parami zasad i oddzielenie łańcuchów komplementarnych. Proces ten ma charakter przejścia fazowego „spirala-cewka” i przypomina topienie kryształów. Dlatego Doty nazwał proces termicznej denaturacji topnienia DNA DNA. Przy powolnym chłodzeniu następuje renaturacja cząsteczek, czyli ponowne zjednoczenie komplementarnych połówek.

Zasadę renaturacji w 1960 roku wykorzystali J. Marmur i K. Schildkraut do określenia stopnia „hybrydyzowalności” DNA różnych mikroorganizmów. Następnie E. Bolton i B. McCarthy udoskonalili tę technikę, proponując metodę tzw. kolumn agarowych DNA. Metoda ta okazała się nieodzowna w badaniu stopnia homologii sekwencji nukleotydowej różnych DNA i wyjaśnianiu genetycznego pokrewieństwa różnych organizmów. Denaturacja DNA odkryta przez Doty w połączeniu z chromatografią na metylowanej albuminie opisana przez J. Mandela i A. Hershey* (1960) i wirowaniem w gradiencie gęstości (metoda została opracowana w 1957 przez M. Meselsona, F. Stahla i D. Winograd) jest szeroko stosowany do separacji, izolacji i analizy poszczególnych komplementarnych nici DNA Na przykład W. Shibalsky (USA), stosując te techniki do oddzielania DNA faga lambda, wykazał w latach 1967 - 1969, że oba łańcuchy fagów są genetycznie aktywne , a nie jeden, jak to uważano (S. Spiegelman, 1961). Należy zauważyć, że po raz pierwszy ideę genetycznego znaczenia obu nici DNA faga lambda wyraził w ZSRR SE Bresler (1961).

* (Za pracę nad genetyką bakterii i wirusów A. Hershey wraz z M. Delbrückem i S. Lurią otrzymali w 1969 roku Nagrodę Nobla.)

Aby zrozumieć organizację i aktywność funkcjonalną genomu, niezwykle ważne jest określenie sekwencji nukleotydowej DNA. Poszukiwania metod do takiego oznaczenia prowadzone są w wielu laboratoriach na całym świecie. Od końca lat pięćdziesiątych M. Beer i jego współpracownicy próbowali ustalić sekwencję DNA za pomocą mikroskopii elektronowej w USA, ale jak dotąd bez powodzenia. We wczesnych latach pięćdziesiątych, z pierwszych prac Sinsheimera, Chargaffa i innych badaczy dotyczących enzymatycznej degradacji DNA, okazało się, że różne nukleotydy w cząsteczce DNA są rozmieszczone, choć nie losowo, ale nierównomiernie. Według angielskiego chemika C. Bartona (1961) pirymidyny (ponad 70%) są skoncentrowane głównie w postaci odpowiednich bloków. A. L. Mazin i B. F. Vanyushin (1968 - 1969) ustalili, że różne DNA mają różne stopnie kohezji pirymidyny i że w DNA organizmów zwierzęcych znacznie wzrasta, gdy przechodzi od niższego do wyższego. Tak więc ewolucja organizmów znajduje odzwierciedlenie również w strukturze ich genomów. Dlatego dla zrozumienia procesu ewolucyjnego jako całości szczególnie ważne jest badanie porównawcze budowy kwasów nukleinowych. Analiza struktury biologicznie ważnych polimerów, a przede wszystkim DNA jest niezwykle ważna dla rozwiązania wielu szczegółowych problemów filogenetyki i taksonomii.

Warto zauważyć, że angielski fizjolog E. Lankester, który badał hemoglobiny mięczaków, dokładnie 100 lat temu przewidział idee biologii molekularnej, napisał: „Różnice chemiczne między różnymi gatunkami i rodzajami zwierząt i roślin są równie ważne dla wyjaśnienia historia ich powstania jako ich forma.Gdybyśmy mogli jasno ustalić różnice w molekularnej organizacji i funkcjonowaniu organizmów, bylibyśmy w stanie zrozumieć pochodzenie i ewolucję różnych organizmów znacznie lepiej niż na podstawie obserwacji morfologicznych” * . Znaczenie badań biochemicznych dla taksonomii podkreślał również V.L. Komarov, pisząc, że „podstawą wszystkich nawet czysto morfologicznych cech, na podstawie których klasyfikujemy i ustalamy gatunki, są właśnie różnice biochemiczne”**.

* (E.R. Lankestera. Uber das Vorcommen von Hemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- „Pfluger's Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

** (V.L. Komarov. Wybrane prace, t. 1. M.-L., Wydawnictwo Akademii Nauk ZSRR, 1945, s. 331.)

A. V. Blagoveshchenskii i S. L. Ivanov już w latach dwudziestych XX wieku podjęli w naszym kraju pierwsze kroki w celu wyjaśnienia pewnych kwestii ewolucji i systematyki organizmów na podstawie analizy porównawczej ich składu biochemicznego (patrz rozdział 2). Analiza porównawcza struktura białek i kwasów nukleinowych staje się obecnie coraz bardziej namacalnym narzędziem dla taksonomów (patrz rozdział 21). Ta metoda biologii molekularnej umożliwia nie tylko wyjaśnienie pozycji poszczególnych gatunków w systemie, ale także wymaga świeżego spojrzenia na same zasady klasyfikacji organizmów, a czasem zrewidowania całego systemu jako całości , jak to miało miejsce na przykład z systematyką mikroorganizmów. Niewątpliwie w przyszłości analiza struktury genomu zajmie centralne miejsce w chemosystematyce organizmów.

Ogromne znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej miało odszyfrowanie mechanizmów replikacji i transkrypcji DNA (patrz rozdział 24).

Biosynteza białek

Ważna zmiana w rozwiązaniu problemu biosyntezy białek wiąże się z postępami w badaniach kwasów nukleinowych. W 1941 r. T. Kasperson (Szwecja) iw 1942 r. J. Brachet (Belgia) zwrócili uwagę na fakt, że tkanki z aktywną syntezą białek zawierają zwiększoną ilość RNA. Doszli do wniosku, że kwasy rybonukleinowe odgrywają decydującą rolę w syntezie białek. Wydaje się, że w 1953 E. Gale i D. Fox otrzymali bezpośrednie dowody na bezpośredni udział RNA w biosyntezie białek: zgodnie z ich danymi, rybonukleaza znacząco hamowała włączanie aminokwasów do lizatów komórek bakteryjnych. Podobne dane uzyskali V. Olfri, M. Delhi i A. Mirsky (1953) na homogenatach wątroby. Później E. Gale odrzucił swoją słuszną koncepcję wiodącej roli RNA w syntezie białek, błędnie uważając, że aktywacja syntezy białek w systemie bezkomórkowym nastąpiła pod wpływem jakiejś innej substancji o nieznanym charakterze. W 1954 r. P. Zamechnik, D. Littlefield, R. B. Khesin-Lurie i inni stwierdzili, że najbardziej aktywne włączanie aminokwasów występuje w bogatych w RNA frakcjach cząstek subkomórkowych - mikrosomach. P. Zamechnik i E. Keller (1953 - 1954) stwierdzili, że włączanie aminokwasów było zauważalnie zwiększone w obecności supernatantu w warunkach regeneracji ATP. P. Sikevitz (1952) i M. Hoagland (1956) wyizolowali z supernatantu frakcję białkową (frakcja pH 5), która odpowiadała za gwałtowną stymulację inkluzji aminokwasów w mikrosomach. Wraz z białkami w supernatancie znaleziono specjalną klasę RNA o niskiej masie cząsteczkowej, zwaną obecnie transferowymi RNA (tRNA). W 1958 Hoagland i Zamechnik, a także P. Berg, R. Sweet i F. Allen oraz wielu innych badaczy odkryli, że każdy aminokwas do aktywacji wymaga własnego specjalnego enzymu, ATP i specyficznego tRNA. Stało się jasne, że tRNA pełnią wyłącznie funkcję adaptorów, czyli urządzeń, które znajdują miejsce na macierzy nukleinowej (mRNA) dla odpowiedniego aminokwasu w powstającej cząsteczce białka. Badania te w pełni potwierdziły hipotezę adaptorową F. Cricka (1957), która przewidywała istnienie w komórce adaptorów polinukleotydowych, niezbędnych do prawidłowego rozmieszczenia reszt aminokwasowych syntetyzowanego białka na macierzy nukleinowej. Znacznie później francuski naukowiec F. Chapville (1962) w laboratorium F. Lipmana (Nagroda Nobla, 1953) w USA bardzo pomysłowo i jednoznacznie wykazał, że umiejscowienie aminokwasu w zsyntetyzowanej cząsteczce białka jest całkowicie zdeterminowane przez specyficzne tRNA, do którego jest dołączony. Hipoteza adaptacyjna Cricka została opracowana przez Hoaglanda i Zamechnika.

Do 1958 r. poznano następujące główne etapy syntezy białek: 1) aktywacja aminokwasu przez określony enzym z „frakcja pH 5” w obecności ATP z wytworzeniem adenylanu aminoacylo; 2) przyłączenie aktywowanego aminokwasu do specyficznego tRNA z uwolnieniem monofosforanu adenozyny (AMP); 3) wiązanie aminoacylo-tRNA (tRNA obciążone aminokwasem) do mikrosomów i włączanie aminokwasów do białka z uwolnieniem tRNA. Hoagland (1958) zauważył, że trifosforan guanozyny (GTP) jest wymagany na ostatnim etapie syntezy białek.

Transfer RNA i synteza genów

Po odkryciu tRNA rozpoczęto aktywne poszukiwania ich frakcjonowania i określania sekwencji nukleotydów. Największy sukces odniósł amerykański biochemik R. Holly. W 1965 ustalił strukturę alaninowego tRNA z drożdży. Za pomocą rybonukleaz (RNazy guanylowej i RNazy trzustkowej) Holly podzieliła cząsteczkę kwasu nukleinowego na kilka fragmentów, określiła sekwencję nukleotydową w każdym z nich z osobna, a następnie zrekonstruowała sekwencję całej cząsteczki tRNA alaniny. Ten sposób analizy sekwencji nukleotydów nazywa się metodą blokową. Zasługa Holly polegała głównie na tym, że nauczył się dzielić cząsteczkę RNA nie tylko na małe kawałki, jak wielu przed nim, ale także na duże fragmenty (ćwiartki i połówki). To dało mu możliwość prawidłowego złożenia ze sobą pojedynczych małych kawałków, a tym samym odtworzenia pełnej sekwencji nukleotydowej całej cząsteczki tRNA (Nagroda Nobla, 1968).

Ta technika została natychmiast przyjęta przez wiele laboratoriów na całym świecie. W ciągu następnych dwóch lat odszyfrowano pierwotną strukturę kilku tRNA w ZSRR i za granicą. A. A. Baev (1967) i współpracownicy po raz pierwszy ustalili sekwencję nukleotydową w drożdżowym tRNA waliny. Do tej pory zbadano kilkanaście różnych pojedynczych tRNA. Szczególny zapis w określaniu sekwencji nukleotydów został ustanowiony w Cambridge przez F. Sengera i G. Brownlee. Badacze ci opracowali zaskakująco elegancką metodę oddzielania oligonukleotydów i sekwencjonowania tak zwanego 5 S (rybosomalnego) RNA z komórek E. coli (1968). Ten RNA składa się ze 120 reszt nukleotydowych i w przeciwieństwie do tRNA nie zawiera dodatkowych pomniejszych zasad, co znacznie ułatwia analizę sekwencji nukleotydowej, służąc jako unikalne punkty orientacyjne dla poszczególnych fragmentów cząsteczki. Obecnie, dzięki zastosowaniu metody Sangera i Brownlee, w laboratorium J. Ebela (Francja) i innych badaczy z powodzeniem rozwijają się prace nad badaniem sekwencji długich rybosomalnych RNA i niektórych wirusowych RNA.

A. A. Baev i współpracownicy (1967) odkryli, że waliny tRNA przecięty na pół przywraca swoją strukturę makromolekularną w roztworze i pomimo defektu w strukturze pierwszorzędowej, ma aktywność funkcjonalną oryginalnej (natywnej) cząsteczki. Takie podejście - rekonstrukcja pociętej makrocząsteczki po usunięciu niektórych fragmentów - okazało się bardzo obiecujące. Obecnie jest szeroko stosowany do wyjaśnienia funkcjonalnej roli poszczególnych odcinków niektórych tRNA.

W ostatnich latach osiągnięto duży sukces w otrzymywaniu preparatów krystalicznych poszczególnych tRNA. Wiele tRNA zostało już skrystalizowanych w kilku laboratoriach w USA i Anglii. Umożliwiło to badanie struktury tRNA za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej. W 1970 r. R. Bock zaprezentował pierwsze wzory rentgenowskie i trójwymiarowe modele kilku tRNA, które stworzył na Uniwersytecie Wisconsin. Modele te pomagają określić lokalizację poszczególnych funkcjonalnie aktywnych miejsc w tRNA i zrozumieć podstawowe zasady funkcjonowania tych cząsteczek.

Rozszyfrowanie natury kodu genetycznego (zob. rozdział 24), które bez przesady można uznać za czołowe osiągnięcie nauk przyrodniczych XX wieku, miało ogromne znaczenie dla ujawnienia mechanizmu syntezy białek i rozwiązania problemu specyfiki tego procesu.

Odkrycie przez R. Holly'ego pierwotnej struktury tRNA dało impuls do prac G. Korany* (USA) nad syntezą oligonukleotydów i skierowało je w kierunku syntezy specyficznej struktury biologicznej – cząsteczki DNA kodującej tRNA alaniny. Pierwsze kroki w chemicznej syntezie krótkich oligonukleotydów dokonane przez Koran prawie 15 lat temu zakończyły się w 1970 roku pierwszą syntezą genów. Koran i jego współpracownicy jako pierwsi zsyntetyzowali chemicznie krótkie fragmenty 8-12 reszt nukleotydowych z poszczególnych nukleotydów. Te fragmenty z daną sekwencją nukleotydową tworzyły spontanicznie dwuniciowe komplementarne fragmenty z nakładaniem się 4-5 nukleotydów. Następnie te gotowe kawałki połączono od końca do końca we właściwej kolejności za pomocą enzymu ligazy DNA. Tak więc, w przeciwieństwie do replikacji cząsteczek DNA, według A. Kornberga ** (patrz rozdział 24), Koranowi udało się odtworzyć naturalną dwuniciową cząsteczkę DNA zgodnie z wcześniej zaplanowanym programem zgodnie z sekwencja tRNA opisana przez Holly. Podobnie trwają obecnie prace nad syntezą innych genów (M. N. Kolosov, Z. A. Shabarova, D. G. Knorre, 1970 - 1975).

* (Za badanie kodu genetycznego G. Koran i M. Nirenberg otrzymali w 1968 roku Nagrodę Nobla.)

** (Za odkrycie polimerazy i syntezę DNA A. Kornberg oraz syntezę RNA S. Ochoa w 1959 otrzymał Nagrodę Nobla.)

Mikrosomy, rybosomy, tłumaczenie

W połowie lat pięćdziesiątych uważano, że mikrosomy stanowią centrum syntezy białek w komórce. Termin mikrosomy został po raz pierwszy wprowadzony w 1949 roku przez A. Claude w odniesieniu do frakcji małych granulek. Później okazało się, że za syntezę białek odpowiada nie cała frakcja mikrosomów, składająca się z błon i granulek, a jedynie małe cząsteczki rybonukleoproteiny. Cząstki te w 1958 roku R. Roberts nazwał rybosomami.

Klasyczne badania rybosomów bakteryjnych przeprowadzili A. Tisier i J. Watson w latach 1958-1959. Rybosomy bakteryjne okazały się nieco mniejsze niż rybosomy roślinne i zwierzęce. J. Littleton (1960), M. Clark (1964) i E.N. Svetailo (1966) wykazali, że rybosomy chloroplastów roślin wyższych i mitochondriów należą do typu bakteryjnego. A. Tisier i inni (1958) odkryli, że rybosomy dysocjują na dwie nierówne podjednostki zawierające po jednej cząsteczce RNA. Pod koniec lat 50. uważano, że każda cząsteczka rybosomalnego RNA składa się z kilku krótkich fragmentów. Jednak AS Spirin w 1960 roku jako pierwszy pokazał, że RNA w subcząstkach jest reprezentowane przez ciągłą cząsteczkę. D. Waller (1960), po rozdzieleniu białek rybosomalnych za pomocą elektroforezy w żelu skrobiowym, stwierdził, że są one bardzo niejednorodne. Początkowo wielu wątpiło w dane Wallera, ponieważ wydawało się, że białko rybosomów powinno być ściśle jednorodne, jak na przykład białko TMV. Obecnie, w wyniku badań D. Wallera, R. Trouta, P. Trauba i innych biochemików, wyszło na jaw, że w skład właściwych cząstek rybosomalnych wchodzi ponad 50 białek o zupełnie odmiennej budowie. A. S. Spirin w 1963 roku jako pierwszy rozwinął subcząstki rybosomalne i pokazał, że rybosomy są zwartą skręconą nicią rybonukleoproteinową, która w pewnych warunkach może się rozwijać. W latach 1967 - 1968 M. Nomura całkowicie zrekonstruował biologicznie czynną podjednostkę z rybosomalnego RNA i białka, a nawet uzyskał rybosomy, w których białko i RNA należały do ​​różnych mikroorganizmów.

Rola rybosomalnego RNA jest nadal niejasna. Zakłada się, że jest to ta unikalna, specyficzna matryca, na której podczas formowania cząstki rybosomalnej każde z licznych białek rybosomalnych znajduje ściśle określone miejsce (AS Spirin, 1968).

A. Rich (1962) odkrył agregaty kilku rybosomów połączonych ze sobą nicią mRNA. Te kompleksy nazwano polisomami. Odkrycie polisomów pozwoliło Richowi i Watsonowi (1963) zasugerować, że synteza łańcucha polipeptydowego zachodzi na rybosomie, który niejako porusza się wzdłuż łańcucha mRNA. Gdy rybosom porusza się wzdłuż łańcucha mRNA, informacje są odczytywane w cząstce i tworzy się białkowy łańcuch polipeptydowy, a nowe rybosomy naprzemiennie przyłączają się do uwolnionego do odczytu końca mRNA. Z danych Richa i Watsona wynikało, że znaczenie polisomów w komórce polega na masowej produkcji białka przez kolejne odczytywanie matrycy przez kilka rybosomów jednocześnie.

W wyniku badań M. Nirenberga, S. Ochoa, F. Lipmana, G. Korany i innych w latach 1963 - 1970. okazało się, że wraz z mRNA, rybosomami, ATP i aminoacylo-tRNA w procesie translacji bierze udział wiele różnych czynników, a sam proces translacji można warunkowo podzielić na trzy etapy - inicjację, samą translację i zakończenie.

Inicjacja translacji oznacza syntezę pierwszego wiązania peptydowego w kompleksie rybosom – polinukleotyd matrycowy – aminoacylo-tRNA. Taką aktywność inicjującą ma nie jakikolwiek aminoacylo-tRNA, ale formylometionylo-tRNA. Substancję tę po raz pierwszy wyizolowali w 1964 roku F. Senger i K. Marker. S. Bretcher i K. Marker (1966) wykazali, że inicjacyjna funkcja formylometionylo-tRNA wynika z jego zwiększonego powinowactwa do centrum peptydylowego rybosomu. Dla rozpoczęcia translacji niezwykle ważne są również niektóre czynniki inicjacji białek, które wyizolowano w laboratoriach S. Ochoa, F. Gro i innych ośrodkach badawczych. Po utworzeniu pierwszego wiązania peptydowego w rybosomie rozpoczyna się sama translacja, tj. kolejne dodawanie reszty aminoacylowej do C-końca polipeptydu. Wiele szczegółów procesu tłumaczenia badali K. Monroe i J. Bishop (Anglia), I. Rykhlik i F. Shorm (Czechosłowacja), F. Lipman, M. Bretcher, W. Gilbert (USA) i inni badacze. W 1968 roku A. S. Spirin zaproponował oryginalną hipotezę wyjaśniającą mechanizm rybosomu. Mechanizmem napędowym, który zapewnia wszystkie ruchy przestrzenne tRNA i mRNA podczas translacji, jest okresowe otwieranie i zamykanie subcząstek rybosomów. Terminacja translacji jest zakodowana w samej czytelnej macierzy, która zawiera kodony terminacji. Jak wykazał S. Brenner (1965 - 1967), takimi kodonami są trojaczki UAA, UAG i UGA. M. Capecci (1967) również zidentyfikował specjalne czynniki terminacji białek. AS Spirin i LP Gavrilova opisali tak zwaną „nieenzymatyczną” syntezę białek w rybosomach (1972 - 1975) bez udziału czynników białkowych. Odkrycie to jest ważne dla zrozumienia pochodzenia i ewolucji biosyntezy białek.

Regulacja aktywności genów i białek

Po problemie specyfiki syntezy białek, problem regulacji syntezy białek, czyli tym samym regulacji aktywności genów, okazał się w biologii molekularnej na pierwszym miejscu.

Funkcjonalna nierówność komórek oraz związana z nią represja i aktywacja genów od dawna przyciągały uwagę genetyków, ale do niedawna prawdziwy mechanizm kontrolowania aktywności genów pozostawał nieznany.

Pierwsze próby wyjaśnienia aktywności regulacyjnej genów wiązały się z badaniem białek histonowych. Nawet małżonkowie Steadman * na początku lat 40. XX wieku. zasugerował, że to histony mogą odgrywać główną rolę w tym zjawisku. Następnie uzyskali pierwsze wyraźne dane dotyczące różnic w naturze chemicznej białek histonowych. Obecnie z roku na rok rośnie liczba faktów przemawiających za tą hipotezą.

* (E. Stedmana, E. Stedmana. Podstawowe białka jąder komórkowych.- Filozof. Przeł. Roya. soc. Londyn, 1951, v. 235, 565 - 595.)

Jednocześnie gromadzi się coraz więcej danych, co wskazuje, że regulacja aktywności genów jest procesem znacznie bardziej złożonym niż prosta interakcja fragmentów genów z cząsteczkami białek histonowych. W latach 1960 - 1962 w laboratorium RB Khesin-Lurie stwierdzono, że geny fagowe zaczynają być odczytywane niejednocześnie: geny fagowe T2 można podzielić na wczesne, których funkcjonowanie nastąpiło w pierwszych minutach infekcji komórki bakteryjnej, oraz późnych, które zaczęły syntetyzować mRNA po zakończeniu prac wczesnych genów.

W 1961 francuscy biochemicy F. Jacob i J. Monod zaproponowali schemat regulacji aktywności genów, który odegrał wyjątkową rolę w ogólnym zrozumieniu mechanizmów regulacyjnych komórki. Zgodnie ze schematem Jacoba i Monoda, oprócz genów strukturalnych (informacyjnych), DNA zawiera również geny-regulatory i geny-operatory. Gen regulatorowy koduje syntezę określonej substancji – represora, który może łączyć się zarówno z genem indukującym, jak i operatorem. Gen operatora jest powiązany z genami strukturalnymi, podczas gdy gen regulatorowy znajduje się w pewnej odległości od nich. Jeżeli w środowisku nie ma induktora, np. laktozy, wówczas represor syntetyzowany przez gen regulatorowy wiąże się z genem operatorowym i blokując go wyłącza pracę całego operonu (blok genów strukturalnych wraz z operatorem). który je kontroluje). W tych warunkach nie dochodzi do tworzenia enzymów. Jeśli induktor (laktoza) pojawia się w pożywce, wówczas produkt genu regulatorowego, represora, wiąże się z laktozą i usuwa blok z genu operatorowego. W takim przypadku praca genu strukturalnego kodującego syntezę enzymu staje się możliwa, a enzym (laktoza) pojawia się w pożywce.

Według Jacoba i Monoda ten schemat regulacji ma zastosowanie do wszystkich enzymów adaptacyjnych i może mieć miejsce zarówno podczas represji, gdy tworzenie enzymu jest tłumione przez nadmiar produktu reakcji, jak i podczas indukcji, gdy wprowadzenie substratu powoduje synteza enzymu. Za badania nad regulacją aktywności genów Jacob i Monod otrzymali w 1965 roku Nagrodę Nobla.

Początkowo ten schemat wydawał się zbyt daleko idący. Jednak później okazało się, że regulacja genów według tej zasady zachodzi nie tylko w bakteriach, ale także w innych organizmach.

Od 1960 roku poczesne miejsce w biologii molekularnej zajmują badania organizacji genomu i struktury chromatyny w organizmach eukariotycznych (J. Bonner, R. Britten, W. Olfrey, P. Walker, Yu S. Chentsov , IB Zbarsky i in.) oraz regulacji transkrypcji (A. Mirsky, G.P. Georgiev, M. Bernstiel, D. Goll, R. Tsanev, R.I. Salganik). Przez długi czas charakter represora pozostawał nieznany i kontrowersyjny. W 1968 roku M. Ptashne (USA) wykazał, że białko jest represorem. Wyizolował go w laboratorium J. Watsona i odkrył, że represor rzeczywiście ma powinowactwo do induktora (laktozy) i jednocześnie „rozpoznaje” gen operatora operonu lac i specyficznie się z nim wiąże.

W ciągu ostatnich 5 - 7 lat uzyskano dane o obecności innej komórki kontrolnej aktywności genu - promotora. Okazało się, że w sąsiedztwie miejsca operatora, do którego przyczepiony jest produkt syntetyzowany na regulatorze genu – substancja białkowa represora, znajduje się inne miejsce, które należy również przypisać członkom systemu regulatorowego aktywności genów. Do tego miejsca przyłączona jest cząsteczka białka enzymu polimerazy RNA. W regionie promotora musi nastąpić wzajemne rozpoznanie unikalnej sekwencji nukleotydowej w DNA i specyficznej konfiguracji białka polimerazy RNA. Realizacja procesu odczytywania informacji genetycznej z daną sekwencją genów operonu sąsiadującego z promotorem będzie zależeć od skuteczności rozpoznawania.

Oprócz schematu opisanego przez Jacoba i Monoda istnieją inne mechanizmy regulacji genów w komórce. F. Jacob i S. Brenner (1963) ustalili, że regulacja replikacji DNA bakterii jest kontrolowana w pewien sposób przez błonę komórkową. Doświadczenia Jacoba (1954) nad indukcją różnych profagów przekonująco wykazały, że pod wpływem różnych czynników mutagennych w komórce bakterii lizogennych rozpoczyna się selektywna replikacja genu profaga, a replikacja genomu gospodarza zostaje zablokowana. W 1970 roku F. Bell doniósł, że małe cząsteczki DNA mogą przechodzić z jądra do cytoplazmy i tam podlegać transkrypcji.

W ten sposób aktywność genów można regulować na poziomie replikacji, transkrypcji i translacji.

Poczyniono znaczne postępy w badaniu regulacji nie tylko syntezy enzymów, ale także ich aktywności. A. Novik i L. Szilard zwracali uwagę na zjawiska regulacji aktywności enzymów w komórce już w latach 50. XX wieku. G. Umbarger (1956) odkrył, że w komórce istnieje bardzo racjonalny sposób tłumienia aktywności enzymu przez produkt końcowy łańcucha reakcji sprzężenia zwrotnego. Jak ustalili J. Monod, J. Change, F. Jacob, A. Purdy i inni badacze (1956 - 1960), regulacja aktywności enzymów może odbywać się zgodnie z zasadą allosteryczną. Enzym lub jedna z jego podjednostek, oprócz powinowactwa do substratu, wykazuje powinowactwo do jednego z produktów łańcucha reakcji. Pod wpływem takiego produktu sygnałowego enzym zmienia swoją konformację w taki sposób, że traci aktywność. W efekcie na samym początku cały łańcuch reakcji enzymatycznych zostaje wyłączony. D. Wieman i R. Woodward (1952; noblista 1965) wskazali na zasadniczą rolę zmian konformacyjnych białek w reakcjach enzymatycznych iw pewnym sensie na występowanie efektu allosterycznego.

Struktura i funkcja białek

W wyniku prac T. Osborne'a, G. Hofmeistera, A. Gurbera, F. Schulza i wielu innych w późny XIX w. Wiele białek zwierzęcych i roślinnych uzyskano w postaci krystalicznej. Mniej więcej w tym samym czasie określono masy cząsteczkowe niektórych białek przy użyciu różnych metod fizycznych. Tak więc w 1891 r. A. Sabaneev i N. Alexandrov poinformowali, że masa cząsteczkowa albuminy jaja kurzego wynosi 14 000; w 1905 r. E. Reid stwierdził, że masa cząsteczkowa hemoglobiny wynosi 48 000. Polimerową strukturę białek odkryli w 1871 r. G. Glasivetz i D. Gaberman. Ideę wiązania peptydowego poszczególnych reszt aminokwasowych w białkach przedstawił T. Curtius (1883). Prace nad kondensacją chemiczną aminokwasów (E. Schaal, 1871; G. Schiff, 1897; L. Balbiano i D. Traschiatti, 1900) oraz syntezą heteropolipeptydów (E. Fisher, 1902 - 1907, Nagroda Nobla, 1902) doprowadziły do ​​opracowania podstawowych zasad budowy chemicznej białek.

Pierwszy enzym krystaliczny (ureazę) otrzymał w 1926 r. J. Sumner (Nagroda Nobla, 1946), a w 1930 r. J. Northrop (Nagroda Nobla, 1946) otrzymał pepsynę krystaliczną. Po tych pracach stało się jasne, że enzymy mają charakter białkowy. W 1940 roku M. Kunits wyizolował krystaliczną RNazę. Do roku 1958 znano już ponad 100 enzymów krystalicznych i ponad 500 enzymów niekrystalicznych. Uzyskanie wysoce oczyszczonych preparatów poszczególnych białek przyczyniło się do rozszyfrowania ich pierwotnej struktury i organizacji makromolekularnej.

Ogromne znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej w ogóle, aw szczególności genetyki człowieka, miało odkrycie przez L. Paulinga (1940) nieprawidłowej hemoglobiny S, izolowanej z erytrocytów osób z ciężką chorobą dziedziczną, anemią sierpowatą. W latach 1955 - 1957 W. Ingram wykorzystał metodę „odcisków palców” opracowaną przez F. Sangera (plamy tworzone przez poszczególne peptydy podczas chromatografii na papierze) do analizy produktów hydrolizy hemoglobiny S alkaliami i trypsyną. W 1961 Ingram poinformował, że hemoglobina S różni się od normalnej hemoglobiny tylko w naturze jednej reszty aminokwasowej: w normalnej hemoglobinie reszta kwasu glutaminowego znajduje się na siódmej pozycji łańcucha, a w hemoglobinie S reszta waliny. Tym samym w pełni potwierdziło się założenie Paulinga (1949), że anemia sierpowata jest chorobą o charakterze molekularnym. Dziedziczna zmiana w zaledwie jednej reszcie aminokwasowej w każdej połowie makrocząsteczki hemoglobiny prowadzi do tego, że hemoglobina traci zdolność łatwego rozpuszczania się przy niskim stężeniu tlenu i zaczyna krystalizować, co prowadzi do zaburzenia struktury komórki. Badania te wyraźnie wykazały, że struktura białka jest ściśle określoną sekwencją aminokwasową, która jest zakodowana w genomie. Prace K. Anfinsena (1951) świadczyły o wyjątkowym znaczeniu pierwotnej struktury białka w tworzeniu unikalnej biologicznie aktywnej konformacji makrocząsteczki. Anfinsen wykazał, że biologicznie aktywna makrostruktura rybonukleazy trzustkowej, która jest tracona w wyniku odbudowy, jest z góry określona przez sekwencję aminokwasową i może pojawiać się samoistnie podczas utleniania grup SH pozostałości cysteiny z tworzeniem się wiązań dwusiarczkowych w ściśle określonych określone miejsca łańcucha peptydowego enzymu.

Do tej pory szczegółowo zbadano mechanizm działania dużej liczby enzymów i określono strukturę wielu białek.

W 1953 F. Sanger ustalił sekwencję aminokwasową insuliny. : Białko to składa się z dwóch łańcuchów polipeptydowych połączonych dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi. Jeden z łańcuchów zawiera tylko 21 reszt aminokwasowych, podczas gdy drugi zawiera 30 reszt. Sanger spędził około 10 lat na rozszyfrowaniu struktury tego stosunkowo prostego białka. Za te wybitne badania otrzymał w 1958 roku Nagrodę Nobla. Po stworzeniu przez V. Steina i S. Moore'a (1957) automatycznego analizatora aminokwasów identyfikacja produktów częściowej hydrolizy białek znacznie przyspieszyła. Już w 1960 roku Stein i Moore poinformowali o tym. że byli w stanie określić sekwencję rybonukleazy, której łańcuch peptydowy jest reprezentowany przez 124 reszty aminokwasowe. W tym samym roku w laboratorium G. Schramma w Tübingen (Niemcy) F. Anderer i inni określili sekwencję aminokwasów w białku TMV. Następnie określono sekwencję aminokwasów w mioglobinie (A. Edmunson) oraz łańcuchach α i β ludzkiej hemoglobiny (G. Braunitzer, E. Schroeder, itp.), lizozymie z białka jaja (J. Jollet, D. Keyfield) . W 1963 F. Shorm i B. Keil (Czechosłowacja) ustalili sekwencję aminokwasów w cząsteczce chymotrypsynogenu. W tym samym roku określono sekwencję aminokwasową trypsynogenu (F. Shorm, D. Walsh). W 1965 K. Takahashi ustalił pierwotną strukturę rybonukleazy T1. Następnie określono sekwencję aminokwasową kilku kolejnych białek.

Jak wiadomo, ostatecznym dowodem poprawności definicji danej struktury jest jej synteza. W 1969 r. R. Merifield (USA) jako pierwszy przeprowadził chemiczną syntezę rybonukleazy trzustkowej. Stosując metodę syntezy, którą opracował na nośniku fazy stałej, Merifield dodawał do łańcucha jeden aminokwas po drugim, zgodnie z sekwencją opisaną przez Steina i Moore'a. W rezultacie otrzymał białko identyczne pod względem właściwości z rybonukleazą trzustkową A. Za odkrycie struktury rybonukleazy V. Stein, S. Moore i K. Anfinsen otrzymali w 1972 roku Nagrodę Nobla. Ta naturalna synteza białek otwiera ogromne perspektywy, wskazując na możliwość tworzenia dowolnych białek zgodnie z wcześniej zaplanowaną sekwencją.

Z badań rentgenowskich W. Astbury (1933) wynikało, że łańcuchy peptydowe cząsteczek białek są skręcone lub ułożone w stos w ściśle określony sposób. Od tego czasu wielu autorów sformułowało różne hipotezy dotyczące sposobów fałdowania łańcuchów białkowych, ale do 1951 r. wszystkie modele pozostawały konstrukcjami spekulacyjnymi, które nie odpowiadały danym eksperymentalnym. W 1951 L. Pauling i R. Corey opublikowali serię znakomitych prac, w których ostatecznie sformułowano teorię struktury drugorzędowej białek, teorię α-helisy. Wraz z tym okazało się również, że białka mają również strukturę trzeciorzędową: α-helisę łańcucha peptydowego można sfałdować w określony sposób, tworząc raczej zwartą strukturę.

W 1957 J. Kendrew i jego współpracownicy po raz pierwszy zaproponowali trójwymiarowy model budowy mioglobiny. Model ten był następnie dopracowywany przez kilka lat, aż w 1961 roku ukazała się ostateczna praca, w której scharakteryzowano strukturę przestrzenną tego białka. W 1959 roku M. Perutz i współpracownicy ustalili trójwymiarową strukturę hemoglobiny. Naukowcy spędzili nad tą pracą ponad 20 lat (pierwsze prześwietlenia hemoglobiny uzyskał Perutz w 1937 roku). Ponieważ cząsteczka hemoglobiny składa się z czterech podjednostek, po rozszyfrowaniu jej organizacji, Perutz po raz pierwszy opisał czwartorzędową strukturę białka. Za pracę nad określeniem trójwymiarowej struktury białek Kendrew i Perutz otrzymali w 1962 roku Nagrodę Nobla.

Stworzenie przestrzennego modelu struktury hemoglobiny przez Perutza DOZWOLONE. zbliżyć się do zrozumienia mechanizmu działania tego białka, które, jak wiadomo, realizuje transport tlenu w komórkach zwierzęcych. Już w 1937 roku F. Gaurowitz doszedł do wniosku, że oddziaływaniu hemoglobiny z tlenem, powietrzem powinna towarzyszyć zmiana struktury białka. W latach 60. Perutz i współpracownicy odkryli zauważalną zmianę w łańcuchach hemoglobiny po jej utlenieniu, spowodowaną przesunięciem atomów żelaza w wyniku wiązania z tlenem. Na tej podstawie powstały pomysły dotyczące „oddychania” makrocząsteczek białkowych.

W 1960 D. Phillips i jego współpracownicy rozpoczęli badania dyfrakcji rentgenowskiej cząsteczki lizozymu. Do 1967 roku byli mniej więcej w stanie ustalić szczegóły organizacji tego białka i lokalizacji poszczególnych atomów w jego cząsteczce. Ponadto Phillips odkrył naturę dodatku lizozymu do substratu (triacetyloglukozaminy). Umożliwiło to odtworzenie mechanizmu działania tego enzymu. Znajomość struktury pierwotnej i organizacji makrocząsteczek umożliwiła zatem nie tylko ustalenie natury centrów aktywnych wielu enzymów, ale także pełne ujawnienie mechanizmu działania tych makrocząsteczek.

Zastosowanie metod mikroskopii elektronowej pomogło ujawnić zasady makromolekularnej organizacji takich złożonych formacji białkowych, jak kolagen, fibrynogen, kurczliwe fibryle mięśniowe itp. Pod koniec lat pięćdziesiątych zaproponowano modele aparatu kurczliwości mięśniowej. Wyjątkowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu skurczu mięśni miało odkrycie przez V. A. Engelgardta i M. N. Lyubimova (1939) aktywności ATPazy miozyny. Oznaczało to, że akt skurczu mięśni opiera się na zmianie właściwości fizykochemicznych i organizacji makrocząsteczkowej białka kurczliwego pod wpływem kwasu adenozynotrójfosforowego (patrz także rozdział 11).

Badania wirusologiczne były niezbędne do zrozumienia zasad tworzenia struktur biologicznych (patrz rozdział 25).

Nie rozwiązane problemy

Główne postępy we współczesnej biologii molekularnej zostały osiągnięte głównie dzięki badaniom kwasów nukleinowych. Jednak nawet w tej dziedzinie nie wszystkie problemy zostały rozwiązane. W szczególności konieczne będzie odszyfrowanie całej sekwencji nukleotydowej genomu. Ten problem z kolei jest nierozerwalnie związany z problemem heterogeniczności DNA i wymaga opracowania nowych zaawansowanych metod frakcjonowania i izolacji pojedynczych cząsteczek z całkowitego materiału genetycznego komórki.

Do tej pory wysiłki koncentrowały się głównie na oddzielnych badaniach białek i kwasów nukleinowych. W komórce te biopolimery są ze sobą nierozerwalnie związane i działają głównie w postaci nukleoprotein. Dlatego potrzeba badania interakcji białek i kwasów nukleinowych stała się obecnie szczególnie dotkliwa. Na pierwszy plan wysuwa się problem rozpoznawania niektórych odcinków kwasów nukleinowych przez białka. Nakreślono już kroki w kierunku zbadania takiego oddziaływania tych biopolimerów, bez którego pełne zrozumienie struktury i funkcji chromosomów, rybosomów i innych struktur jest nie do pomyślenia. Bez tego nie da się też zrozumieć regulacji aktywności genów i ostatecznie rozszyfrować zasady działania mechanizmów syntezy białek. Po pracach Jacoba i Monoda pojawiły się nowe dane dotyczące regulacyjnego znaczenia błon w syntezie materiału jądrowego. Stawia to problem głębszego zbadania roli błon w regulacji replikacji DNA. Ogólnie rzecz biorąc, problem regulacji aktywności genów i ogólnie aktywności komórek stał się jednym z najważniejszych problemów współczesnej biologii molekularnej.

Aktualny stan biofizyki

W ścisłym związku z problematyką biologii molekularnej postępował rozwój biofizyki. Zainteresowanie tą dziedziną biologii stymulowane było z jednej strony potrzebą kompleksowego badania wpływu różnych rodzajów promieniowania na organizm, z drugiej zaś koniecznością studiowania fizyko-fizycznego. -chemiczne podstawy zjawisk życiowych zachodzących na poziomie molekularnym.

Uzyskanie dokładnych informacji o strukturach molekularnych i zachodzących w nich procesach stało się możliwe dzięki zastosowaniu nowych, precyzyjnych metod fizykochemicznych. W oparciu o osiągnięcia elektrochemii możliwe było udoskonalenie metody pomiaru potencjałów bioelektrycznych za pomocą elektrod jonoselektywnych (G. Eisenman, B.P. Nikolsky, Khuri, 50-60s). Coraz częściej stosowana jest spektroskopia w podczerwieni (z wykorzystaniem urządzeń laserowych), która umożliwia badanie zmian konformacyjnych białek (I. Plotnikov, 1940). Cennych informacji dostarcza również metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (E.K. Zavoisky, 1944) oraz metoda biochemiluminescencyjna (B.N. Tarusov i in., 1960), które umożliwiają w szczególności ocenę transportu elektronów podczas procesów oksydacyjnych.

W latach pięćdziesiątych biofizyka zdobywała już silną pozycję. Istnieje potrzeba szkolenia wykwalifikowanych specjalistów. Jeśli w 1911 r. w Europie katedrę biofizyki miał tylko Uniwersytet w Peczu na Węgrzech, to w 1973 r. takie katedry istnieją na prawie wszystkich głównych uniwersytetach.

W 1960 zorganizowano Międzynarodowe Towarzystwo Biofizyków. W sierpniu 1961 roku w Sztokholmie odbył się pierwszy Międzynarodowy Kongres Biofizyczny. Drugi kongres odbył się w 1965 w Paryżu, trzeci w 1969 w Bostonie, czwarty w 1972 w Moskwie.

W biofizyce istnieje wyraźne rozróżnienie między dwoma obszarami o różnej treści - biofizyką molekularną i biofizyką komórkową. Wyróżnienie to zyskuje także wyraz organizacyjny: powstają odrębne katedry z tych dwóch dziedzin biofizyki. Na Uniwersytecie Moskiewskim pierwszy wydział biofizyki powstał w 1953 r. na Wydziale Biologii i Gleboznawstwa, a nieco później na Wydziale Fizyki pojawił się Zakład Biofizyki. Na tej samej zasadzie zorganizowano wydziały na wielu innych uczelniach.

Biofizyka molekularna

W ostatnich latach związek biofizyki molekularnej z biologią molekularną jest coraz bardziej zacieśniany i obecnie trudno jest czasem określić, gdzie przebiega granica między nimi. W ogólnym ataku na problem informacji dziedzicznej taka współpraca biofizyki i biologii molekularnej jest nieunikniona.

Głównym kierunkiem pracy badawczej jest badanie fizyki kwasów nukleinowych – DNA i RNA. Zastosowanie powyższych metod, a przede wszystkim rentgenowskiej analizy dyfrakcyjnej, przyczyniło się do rozszyfrowania struktury molekularnej kwasów nukleinowych. Obecnie trwają intensywne badania nad zachowaniem tych kwasów w roztworach. Szczególną uwagę zwrócono na przejścia konformacyjne „helix-coil”, które badane są poprzez zmiany lepkości, parametrów optycznych i elektrycznych. W związku z badaniem mechanizmów mutagenezy trwają prace nad badaniem wpływu promieniowania jonizującego na zachowanie kwasów nukleinowych w roztworach, a także wpływu promieniowania na kwasy nukleinowe wirusów i fagów. Kompleksowej analizie poddano wpływ promieniowania ultrafioletowego, którego niektóre obszary widmowe są dobrze absorbowane przez kwasy nukleinowe. Duży udział w tego rodzaju badaniach stanowi wykrywanie aktywnych rodników kwasów nukleinowych i białek metodą elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Z wykorzystaniem tej metody wiąże się pojawienie się całego niezależnego kierunku.

Problem kodowania informacji DNA i RNA oraz ich przekazywania podczas syntezy białek od dawna jest przedmiotem zainteresowania biofizyki molekularnej, a fizycy wielokrotnie wyrażali pewne rozważania na ten temat (E. Schrödinger, G. Gamow). Rozszyfrowanie kodu genetycznego spowodowało liczne badania teoretyczne i eksperymentalne dotyczące budowy helisy DNA, mechanizmu przesuwania się i skręcania jej nitek oraz badania sił fizycznych zaangażowanych w te procesy.

Biofizyka molekularna zapewnia znaczną pomoc biologii molekularnej w badaniu struktury cząsteczek białek za pomocą analizy dyfrakcyjnej promieniowania rentgenowskiego, którą po raz pierwszy zastosował w 1930 r. J. Bernal. W wyniku zastosowania metod fizycznych w połączeniu z biochemicznymi (metodami enzymatycznymi) ujawniono konformację molekularną i sekwencję aminokwasów szeregu białek.

Współczesne badania pod mikroskopem elektronowym, które ujawniły obecność złożonych systemów błonowych w komórkach i ich organellach, pobudziły próby zrozumienia ich struktury molekularnej (patrz rozdziały 10 i 11). Skład chemiczny błon, a w szczególności właściwości ich lipidów badane są in vivo. Stwierdzono, że te ostatnie są zdolne do nadoksydacji i nieenzymatycznych reakcji utleniania łańcucha (Yu. A. Vladimirov i F. F. Litvin, 1959; B. N. Tarusov i in., 1960; I. I. Ivanov, 1967), co prowadzi do dysfunkcji błony. Do badania składu błon zaczęto również stosować metody modelowania matematycznego (V. Ts. Presman, 1964 - 1968; M. M. Shemyakin, 1967; Yu. A. Ovchinnikov, 1972).

Biofizyka komórkowa

Istotnym wydarzeniem w historii biofizyki było ukształtowanie się w latach pięćdziesiątych klarownych wyobrażeń na temat termodynamiki procesów biologicznych, w wyniku których założenia o możliwości samodzielnego wytwarzania energii w żywych komórkach, wbrew drugiej zasadzie termodynamiki , w końcu zniknął. Zrozumienie działania tego prawa w układach biologicznych wiąże się z wprowadzeniem przez belgijskiego naukowca I. Prigozhina (1945) * do termodynamiki biologicznej pojęcia systemy otwarte które wymieniają energię i materię z otoczeniem. Prigogine wykazał, że dodatnia entropia powstaje w żywych komórkach podczas procesów roboczych zgodnie z drugą zasadą termodynamiki. Wprowadzone przez niego równania określiły warunki, w jakich powstaje tzw. stan stacjonarny (wcześniej nazywano go też równowagą dynamiczną), w którym ilość energii swobodnej (negentropia) wchodząca do komórek z pokarmem kompensuje jej zużycie, a entropia dodatnia jest wyjście. To odkrycie wzmocniło ogólną biologiczną ideę nierozerwalnego związku między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym komórek. Był to początek prawdziwych badań termodynamiki systemów żywych, w tym metody modelowania (A. Burton, 1939; A. G. Pasynsky, 1967).

* (ogólna teoria systemy otwarte zostały po raz pierwszy przedstawione przez L. Bertalanffy w 1932 roku.)

Zgodnie z podstawową zasadą biotermodynamiki warunkiem koniecznym istnienia życia jest stacjonarność w rozwoju jego procesów biochemicznych, do realizacji których konieczna jest koordynacja szybkości wielu reakcji metabolicznych. Na podstawie nowej termodynamiki biofizycznej pojawił się trend, który wyróżnia czynniki zewnętrzne i wewnętrzne, które zapewniają tę koordynację reakcji i stabilizację. W ciągu ostatnich dwóch dekad ujawniono dużą rolę w utrzymaniu stanu stacjonarnego układu inhibitorów, a zwłaszcza przeciwutleniaczy (B. N. Tarusov i A. I. Zhuravlev, 1954, 1958). Ustalono, że niezawodność rozwoju stacjonarnego jest związana z czynnikami środowiskowymi (temperatura) i fizyczne i chemiczne właściwościśrodowiska komórkowe.

Współczesne zasady biotermodynamiki umożliwiły interpretację fizykochemiczną mechanizmu adaptacji. Według naszych danych, adaptacja do warunków środowiskowych może nastąpić tylko wtedy, gdy, gdy się zmieniają, organizm jest w stanie ustalić stacjonarność w rozwoju bio reakcje chemiczne(B.N. Tarusow, 1974). Pojawiło się pytanie o opracowanie nowych metod, które pozwoliłyby na ocenę stanu stacjonarnego in vivo i przewidywanie jego ewentualnych naruszeń. Wprowadzenie cybernetycznych zasad systemów samoregulujących do biotermodynamiki i badań nad procesami adaptacji biologicznej obiecuje duże korzyści. Stało się jasne, że w celu rozwiązania problemu stabilności stanu stacjonarnego ważne jest uwzględnienie tzw. czynników perturbacyjnych, do których należą w szczególności nieenzymatyczne reakcje utleniania lipidów. W ostatnim czasie rozwijają się badania nad procesami peroksydacji w fazach lipidowych żywych komórek oraz wzrostu aktywnych produktów rodnikowych, które zaburzają funkcje regulacyjne błon. Źródłem informacji o tych procesach jest zarówno detekcja aktywnych rodników nadtlenkowych, jak i związków nadtlenkowych biolipidów (A. Tappel, 1965; I. I. Ivanov, 1965; E. B. Burlakova, 1967 i in.). Do wykrywania rodników wykorzystuje się biochemiluminescencję, która zachodzi w lipidach żywych komórek podczas ich rekombinacji.

Na podstawie fizykochemicznych pomysłów dotyczących stabilności stanu stacjonarnego pojawiły się biofizyczne pomysły dotyczące adaptacji roślin do zmian warunków środowiskowych jako naruszenia hamujących układów przeciwutleniaczy (B. N. Tarusov, Ya. E. Doskoch, B. M. Kitlaev, A. M. Agaverdiev , 1968 - 1972). Stworzyło to możliwość oceny takich właściwości, jak mrozoodporność i tolerancja na sól, a także dokonywania odpowiednich prognoz w doborze roślin rolniczych.

W latach 50. odkryto ultrasłabą poświatę - biochemiluminescencję szeregu obiektów biologicznych w widzialnej i podczerwonej części widma (B. N. Tarusov, A. I. Zhuravlev, A. I. Polivoda). Stało się to możliwe dzięki opracowaniu metod rejestracji supersłabych strumieni świetlnych za pomocą fotopowielaczy (L.A. Kubetsky, 1934). Będąc wynikiem reakcji biochemicznych zachodzących w żywej komórce, biochemiluminescencja umożliwia ocenę ważnych procesów oksydacyjnych w łańcuchach przenoszenia elektronów między enzymami. Odkrycie i badanie biochemiluminescencji ma wielkie znaczenie teoretyczne i wartość praktyczna. Tak więc B. N. Tarusov i Yu B. Kudryashov zwracają uwagę na wielką rolę produktów utleniania nienasyconych Kwasy tłuszczowe w mechanizmie powstawania stanów patologicznych rozwijających się pod wpływem promieniowania jonizującego, w karcynogenezie i innych zaburzeniach normalne funkcje komórki.

W latach 50. XX wieku, w związku z szybkim rozwojem fizyki jądrowej, z biofizyki wyłoniła się radiobiologia badająca biologiczny wpływ promieniowania jonizującego. Produkcja sztucznych izotopów promieniotwórczych, tworzenie broni termojądrowej, reaktorów atomowych i rozwój innych form praktycznego wykorzystania energii atomowej stawiały z całą ostrością problem ochrony organizmów przed szkodliwymi skutkami promieniowania jonizującego, rozwijając się podstawy teoretyczne zapobieganie i leczenie choroby popromiennej. Aby to zrobić, trzeba było przede wszystkim dowiedzieć się, które składniki komórki i ogniwa metabolizmu są najbardziej wrażliwe.

Przedmiotem badań w biofizyce i radiobiologii było wyjaśnienie natury pierwotnych reakcji chemicznych zachodzących w żywych podłożach pod wpływem energii promieniowania. Tutaj ważne było nie tylko zrozumienie mechanizmów tego zjawiska, ale także możliwość wpływania na proces wymiany energia fizyczna do chemicznego, zmniejsz jego współczynnik „użytecznego” działania. Pracę w tym kierunku zapoczątkowały studia szkoły N. N. Semenova (1933) w ZSRR i D. Hinshelwooda (1935) w Anglii.

Ważne miejsce w badaniach radiobiologicznych zajmowało badanie stopnia odporności na promieniowanie różnych organizmów. Stwierdzono, że zwiększona odporność na promieniowanie (np. u gryzoni pustynnych) jest spowodowana wysoką aktywnością antyoksydacyjną lipidów błony komórkowej (M. Chang i in., 1964; N. K. Ogryzov i in., 1969). Okazało się, że tokoferole, witamina K i związki tio odgrywają ważną rolę w kształtowaniu właściwości antyoksydacyjnych tych układów (II Ivanov i in., 1972). W ostatnich latach wiele uwagi przyciągnęły również badania mechanizmów mutagenezy. W tym celu badany jest wpływ promieniowania jonizującego na zachowanie kwasów nukleinowych i białek in vitro, a także wirusów i fagów (A. Gustafson, 1945 - 1950).

Walka o dalszy wzrost skuteczności ochrony chemicznej, poszukiwanie skuteczniejszych inhibitorów oraz zasad hamowania pozostają głównymi zadaniami biofizyki w tym kierunku.

Poczyniono postępy w badaniach stanów wzbudzonych biopolimerów, które decydują o ich wysokiej aktywności chemicznej. Najbardziej udane były badania stanów wzbudzonych powstających na pierwotnym etapie procesów fotobiologicznych - fotosyntezy i widzenia.

W ten sposób wniesiono solidny wkład w zrozumienie pierwotnej aktywacji molekuł roślinnych układów pigmentowych. Stwierdzono duże znaczenie przenoszenia (migracji) energii stanów wzbudzonych bez strat z aktywowanych pigmentów na inne podłoża. Dużą rolę w rozwoju tych idei odegrały prace teoretyczne A. N. Terenina (1947 i później). A. A. Krasnovsky (1949) odkrył i zbadał reakcję odwracalnej fotochemicznej redukcji chlorofilu i jego analogów. Obecnie panuje powszechne przekonanie, że w niedalekiej przyszłości możliwe będzie odtworzenie fotosyntezy w sztucznych warunkach (patrz także rozdział 5).

Biofizycy nadal pracują nad odkryciem natury skurczu mięśni oraz mechanizmów wzbudzania i przewodzenia nerwów (patrz rozdział 11). Aktualne znaczenie zyskały również badania nad mechanizmami przejścia ze stanu wzbudzonego do stanu normalnego. Stan wzbudzony jest obecnie uważany za wynik reakcji autokatalitycznej, a hamowanie jest uważane za konsekwencję gwałtownej mobilizacji hamującej aktywności przeciwutleniającej w wyniku przegrupowań molekularnych w związkach takich jak tokoferol (II Ivanov, OR Kols, 1966; OR Kols, 1970).

najważniejsze powszechny problem biofizyka pozostaje wiedzą o jakościowych cechach fizykochemicznych żywej materii. Właściwości takie jak zdolność żywych biopolimerów do selektywnego wiązania potasu czy polaryzacji prądu elektrycznego nie mogą być zachowane nawet przy najbardziej ostrożnym usunięciu z organizmu. Dlatego biofizyka komórkowa nadal intensywnie rozwija kryteria i metody badania życia materii żywej.

Pomimo młodego wieku biologii molekularnej postęp, jaki dokonała się w tej dziedzinie, jest naprawdę oszałamiający. W stosunkowo krótkim czasie ustaliła się natura genu oraz podstawowe zasady jego organizacji, reprodukcji i funkcjonowania. Co więcej, przeprowadzono nie tylko reprodukcję genów in vitro, ale także po raz pierwszy zakończono pełną syntezę samego genu. Kod genetyczny został całkowicie rozszyfrowany i rozwiązany został najważniejszy biologiczny problem specyficzności biosyntezy białek. Zidentyfikowano i zbadano główne sposoby i mechanizmy powstawania białek w komórce. Pierwotna struktura wielu transportujących RNA, swoistych cząsteczek adaptorowych, które tłumaczą język matryc nukleinowych na język sekwencji aminokwasowej syntetyzowanego białka, została całkowicie określona. Sekwencja aminokwasowa wielu białek została w pełni rozszyfrowana, a niektórych z nich ustalono strukturę przestrzenną. Umożliwiło to wyjaśnienie zasady i szczegółów funkcjonowania cząsteczek enzymu. Przeprowadzono syntezę chemiczną jednego z enzymów, rybonukleazy. Ustalono podstawowe zasady organizacji różnych cząstek subkomórkowych, wielu wirusów i fagów oraz poznano główne sposoby ich biogenezy w komórce. Odkryto podejścia do zrozumienia sposobów regulacji aktywności genów i wyjaśnienia mechanizmów regulacyjnych czynności życiowych. Już prosta lista tych odkryć wskazuje na drugą połowę XX wieku. zaznaczył się ogromnym postępem w biologii, co jest spowodowane przede wszystkim dogłębnym badaniem struktury i funkcji ważnych biologicznie makrocząsteczek - kwasów nukleinowych i białek.

Osiągnięcia biologii molekularnej są już dziś wykorzystywane w praktyce i przynoszą wymierne rezultaty w medycynie, rolnictwie i niektórych gałęziach przemysłu. Nie ma wątpliwości, że powrót tej nauki będzie wzrastał z każdym dniem. Za główny wynik należy jednak uznać, że pod wpływem sukcesów biologii molekularnej umocniła się wiara w istnienie nieograniczonych możliwości na drodze do ujawnienia najbardziej tajnych tajemnic życia.

Najwyraźniej w przyszłości zostaną otwarte nowe sposoby badania biologicznej formy ruchu materii - za pomocą Poziom molekularny biologia przejdzie na poziom atomowy. Jednak obecnie chyba nie ma ani jednego badacza, który mógłby realistycznie przewidzieć rozwój biologii molekularnej nawet na najbliższe 20 lat.

Biologia molekularna / m jaɛ doJʊ jaer / to dział biologii, który dotyczy molekularnych podstaw aktywności biologicznej między biocząsteczkami w różnych układach komórkowych, w tym interakcji między DNA, RNA, białkami i ich biosyntezą oraz regulacji tych interakcji. Nagrywanie w Natura w 1961 Astbury opisał biologię molekularną:

Nie tyle technika, ile podejście, podejście z punktu widzenia tak zwanych nauk podstawowych z wiodącą ideą poszukiwania poniżej wielkoskalowych przejawów biologii klasycznej dla odpowiedniego planu molekularnego. Dotyczy to w szczególności: formularze molekuły biologiczne i [...] w przeważającej mierze trójwymiarowe i strukturalne – co nie znaczy jednak, że jest to tylko udoskonalenie morfologii. Musi jednocześnie badać genezę i funkcję.

Związek z innymi naukami biologicznymi

Naukowcy zajmujący się biologią molekularną wykorzystują specyficzne metody uprawy biologii molekularnej, ale coraz częściej łączą je z metodami i pomysłami z genetyki i biochemii. Nie ma określonej granicy między tymi dyscyplinami. Jest to pokazane na poniższym diagramie, który przedstawia jeden możliwy rodzaj relacji między polami:

• Biochemia czy studium? substancje chemiczne i procesy życiowe zachodzące w organizmach żywych. Biochemicy mają trudności ze skoncentrowaniem się na roli, funkcji i strukturze biomolekuł. Badania chemii procesów biologicznych i synteza biologicznie aktywnych cząsteczek to przykłady biochemii.
• Genetyka to badanie wpływu różnic genetycznych w organizmach. Często można to wywnioskować z braku normalnego składnika (np. pojedynczego genu). Badanie „mutantów” – organizmów, które posiadają jeden lub więcej składników funkcjonalnych w stosunku do fenotypu tzw. „typu dzikiego” lub normalnego. Interakcje genetyczne (epistaza) są często mylone przez proste interpretacje takich „knockoutowych” badań.
• Biologia molekularna to nauka o molekularnych podstawach procesów replikacji, transkrypcji, translacji i funkcji komórki. Centralny dogmat biologii molekularnej, w którym materiał genetyczny jest transkrybowany na RNA, a następnie tłumaczony na białko, pomimo nadmiernego uproszczenia, nadal stanowi dobry punkt wyjścia do zrozumienia tej dziedziny. Obraz został zrewidowany w świetle pojawiających się nowych ról dla RNA.

Metody biologii molekularnej

Klonowanie molekularne

Jedną z najbardziej podstawowych technik biologii molekularnej do badania funkcji białka jest klonowanie molekularne. W tej technice DNA kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania jest klonowany przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i/lub enzymów restrykcyjnych w plazmidzie (wektorze ekspresyjnym). Wektor ma 3 cechy charakterystyczne: początek replikacji, miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) i marker selekcyjny, zwykle z opornością na antybiotyki. Powyżej miejsca wielokrotnego klonowania są regiony promotora i miejsca startu transkrypcji, które regulują ekspresję sklonowanego genu. Plazmid ten można wprowadzić do komórek bakteryjnych lub zwierzęcych. Wprowadzenie DNA do komórek bakteryjnych można przeprowadzić przez transformację poprzez wychwyt nagiego DNA, sprzęganie przez kontakty międzykomórkowe lub transdukcję wektorem wirusowym. Wprowadzenie DNA do komórek eukariotycznych, takich jak komórki zwierzęce, za pomocą środków fizycznych lub chemicznych nazywa się transfekcją. Dostępnych jest kilka różnych metod transfekcji, takich jak transfekcja fosforanem wapnia, elektroporacja, mikroiniekcja i transfekcja liposomalna. Plazmid może być zintegrowany z genomem, co skutkuje stabilną transfekcją, lub może pozostać niezależny od genomu, co określane są jako przejściowe transfekcji.

DNA kodujące białka będące przedmiotem zainteresowania znajduje się teraz w komórce i białka mogą być teraz wyrażane. Różnorodne systemy, takie jak indukowalne promotory i specyficzne czynniki sygnalizacji komórkowej, pomagają wyrażać zainteresowanie białkami na wysokim poziomie. Duże ilości białka można następnie wyekstrahować z komórki bakteryjnej lub eukariotycznej. Białko może być testowane pod kątem aktywności enzymatycznej w różnych sytuacjach, białko może być krystalizowane w celu zbadania jego struktury trzeciorzędowej lub, w przemyśle farmaceutycznym, można badać aktywność nowych leków przeciwko białku.

reakcja łańcuchowa polimerazy

Wymazywanie i badanie makrocząsteczek

Warunki północny , zachód I orientalny blotting wychodzi z tego, co pierwotnie było żartem z biologii molekularnej, który grał na tym terminie Sieć południowa, postępując zgodnie z techniką opisaną przez Edwina Southerna dla hybrydyzacji BLOTTED DNA. Patricia Thomas, twórca technologii blottingu RNA, która później stała się znana jako północna - blotting, właściwie nie używaj tego terminu.

Southern blotting

Nazwany na cześć jego wynalazcy, biologa Edwina Southerna, Southern blot to technika badania obecności określonej sekwencji DNA w próbce DNA. Próbki DNA przed lub po trawieniu enzymami restrykcyjnymi (enzymami restrykcyjnymi) rozdziela się metodą elektroforezy żelowej, a następnie przenosi na membranę metodą blottingu kapilarnego. Błonę następnie eksponuje się na znakowaną sondę DNA, która ma sekwencję zasad komplementarną do sekwencji na interesującym DNA. Southern blotting jest rzadziej stosowany w laboratoriach naukowych ze względu na zdolność innych metod, takich jak PCR, do wykrywania określonych sekwencji DNA z próbek DNA. Te bloty są jednak nadal używane w niektórych zastosowaniach, takich jak pomiar liczby kopii transgenu u transgenicznych myszy lub w inżynierii linii knockout genów embrionalnych komórek macierzystych.

północna blotting

Northern blot chart

Wschodnia blotting

Badania kliniczne i terapie medyczne wywodzące się z biologii molekularnej są częściowo objęte terapią genową. Zastosowanie biologii molekularnej lub biologii molekularnej komórki w medycynie nazywa się obecnie medycyną molekularną. Biologia molekularna też gra ważna rola w zrozumieniu powstawania, działania i regulacji różnych części komórek, które można wykorzystać do skutecznego ukierunkowania na nowe leki, diagnozowania chorób i zrozumienia fizjologii komórki.

dalsze czytanie

• Cohen, SN, Chang, NKD, Boyer, H. & Heling, RB Konstruowanie biologicznie funkcjonalnych plazmidów bakteryjnych in vitro .