Прикладна молекулярна біологія. Предмет, завдання та цілі молекулярної біології Розкажи про це докладніше

Комікс на конкурс «біо/мол/текст»: Сьогодні молекулярний біолог Пробірочка проведе вас світом дивовижної науки - молекулярної біології! Ми почнемо з історичного екскурсу етапами її розвитку, опишемо головні відкриття та експерименти, починаючи з 1933 року. А також наочно розповімо про основні методи молекулярної біології, які дозволили маніпулювати генами, змінювати та виділяти їх. Поява цих методів послужило сильним поштовхом у розвитку молекулярної біології. А ще згадаємо про роль біотехнології і торкнемося однієї з найпопулярніших тем у цій галузі - редагування геному за допомогою CRISPR/Cas-систем.

Генеральний спонсор конкурсу та партнер номінації «Сколтех» - .


Спонсор конкурсу - компанія «Діаем»: найбільший постачальник обладнання, реагентів та витратних матеріалів для біологічних дослідженьта виробництв.

Спонсором призу глядацьких симпатій виступила компанія.


«Книжковий» спонсор конкурсу – «Альпіна нон-фікшн»

1. Введення. Сутність молекулярної біології

Вивчає основи життєдіяльності організмів лише на рівні макромолекул. Метою молекулярної біології є встановлення ролі та механізмів функціонування цих макромолекул на основі знань про їх структури та властивості.

Історично молекулярна біологія сформувалася під час розвитку напрямів біохімії, що вивчають нуклеїнові кислоти та білки. У той час як біохімія досліджує обмін речовин, хімічний складживих клітин, організмів і здійснювані у яких хімічні процеси, молекулярна біологія головну увагу зосереджує на вивченні механізмів передачі, відтворення та зберігання генетичної інформації.

А об'єктом вивчення молекулярної біології є самі нуклеїнові кислоти – дезоксирибонуклеїнові (ДНК), рибонуклеїнові (РНК) – та білки, а також їх макромолекулярні комплекси – хромосоми, рибосоми, мультиферментні системи, що забезпечують біосинтез білків та нуклеїнових кислот. Молекулярна біологія також межує з об'єктами дослідження і частково збігається з молекулярною генетикою, вірусологією, біохімією та іншими суміжними біологічними науками.

2. Історичний екскурс етапами розвитку молекулярної біології

Як окремий напрямок біохімії, молекулярна біологія почала розвиватися в 30-х роках минулого століття. Ще тоді виникла потреба розуміння феномену життя на молекулярному рівні для досліджень процесів передачі та зберігання генетичної інформації. Саме тоді встановилося завдання молекулярної біології у вивченні якостей, структури та взаємодії білків і нуклеїнових кислот.

Вперше термін «молекулярна біологія» застосував у 1933 У Вільям Астбері в ході дослідження фібрилярних білків (колагену, фібрину крові, скорочувальних білків м'язів). Астбері вивчав зв'язок між молекулярною структурою та біологічними, фізичними особливостями даних білків. Спочатку виникнення молекулярної біології РНК вважалася складовою тільки рослин і грибів, а ДНК - тільки тварин. А в 1935 Цього року відкриття ДНК гороху Андрієм Білозерським призвело до встановлення факту, що ДНК міститься в кожній живій клітині.

В 1940 році колосальним досягненням стало встановлення Джорджем Бідлом та Едуардом Тейтемом причинно-наслідкового зв'язку між генами та білками. Гіпотеза вчених «Один ген - один фермент» лягла основою концепції у тому, що специфічне будова білка регулюється генами. Вважається, що генетична інформація закодована спеціальною послідовністю нуклеотидів у ДНК, що регулює первинну структуру білків. Пізніше було доведено, що багато білків мають четвертинну структуру. У освіті таких структур беруть участь різні пептидні ланцюги. Виходячи з цього, положення про зв'язок між геном та ферментом було дещо перетворено, і тепер звучить як «Один ген – один поліпептид».

В 1944 американський біолог Освальд Евері з колегами (Коліном Маклеодом і Макліном Маккарті) довів, що речовиною, що викликає трансформацію бактерій, є ДНК, а не білки. Експеримент був доказом ролі ДНК у передачі спадкової інформації, перекресливши застарілі знання про білкову природу генів.

На початку 50-х років Фредерік Сенгер показав, що білковий ланцюг – унікальна послідовність амінокислотних залишків. В 1951 і 1952 роках вчений визначив повну послідовність двох поліпептидних ланцюгів - бичачого інсуліну В(30 амінокислотних залишків) та А(21 амінокислотний залишок) відповідно.

Приблизно в той же час, в 1951–1953 рр., Ервін Чаргафф сформулював правила про співвідношення азотистих основ у ДНК. Згідно з правилом, незалежно від видових відмінностей живих організмів у їх ДНК кількість аденіну (A) дорівнює кількості тиміну (T), а кількість гуаніну (G) дорівнює кількості цитозину (C).

В 1953 році доведено генетичну роль ДНК. Джеймс Уотсон і Френсіс Крик на основі рентгенограми ДНК, отриманої Розалінд Франклін і Морісом Уїлкінсом, встановили просторову структуру ДНК і висунули підтверджене пізнє припущення про механізм її реплікації (подвоєння), що лежить в основі спадковості.

1958 рік – формування центральної догми молекулярної біології Френсісом Криком: перенесення генетичної інформації йде у напрямку ДНК → РНК → білок.

Суть догми полягає в тому, що в клітинах є певний спрямований потік інформації від ДНК, яка, у свою чергу, є вихідним генетичним текстом, що складається з чотирьох літер: A, T, G і C. Він записаний у подвійній спіралі ДНК у вигляді послідовностей цих літер – нуклеотидів.

Цей текст транскрибується. А сам процес називається транскрипцією. У ході цього процесу відбувається синтез РНК, яка є ідентичною генетичному тексту, але на відміну: в РНК замість T стоїть U (урацил).

Ця РНК називається інформаційної РНК (іРНК), або матричної (мРНК). ТрансляціяіРНК здійснюється за допомогою генетичного коду як триплетних послідовностей нуклеотидів. У ході цього процесу відбувається переклад тексту нуклеїнових кислот ДНК і РНК із чотирилітерного тексту в двадцятилітерний текст амінокислот.

Природних амінокислот існує лише двадцять, а літер у тексті нуклеїнових кислот чотири. Через це відбувається переклад із чотирилітерного алфавіту в двадцятилітерний за допомогою генетичного коду, в якому кожним трьом нуклеотидам відповідає будь-яка амінокислота. Так можна зробити з чотирьох букв цілі 64 трилітерні комбінації, при тому що амінокислот 20. З цього випливає, що генетичний код обов'язково повинен мати властивість виродженості. Проте на той час генетичний код не був відомий, до того ж його навіть не почали розшифровувати, але Крік уже сформулював свою центральну догму.

Проте була впевненість у тому, що код має існувати. На той час було доведено, що цей код має триплетність. Це означає, що три літери в нуклеїнових кислотах ( кодони) відповідають будь-якій амінокислоті. Цих кодонів лише 64, вони кодують 20 амінокислот. Це означає, що кожній амінокислоті відповідає відразу кілька кодонів.

Таким чином, можна дійти невтішного висновку, що центральна догма є постулатом, який свідчить, що у клітині відбувається спрямований потік інформації: ДНК → РНК → білок. Крик наголосив на головному змісті центральної догми: зворотного потоку інформації відбуватися не може, білок не здатний змінювати генетичну інформацію.

У цьому полягає основний сенс центральної догми: білок неспроможна змінювати і перетворювати інформацію на ДНК (чи РНК), потік завжди йде лише у одну сторону.

Через деякий час після цього було відкрито новий фермент, який не був відомий за часів формулювання центральної догми. зворотна транскриптазаяка синтезує ДНК по РНК Фермент був відкритий у вірусах, у яких генетична інформація закодована в РНК, а не ДНК. Такі віруси називають ретровірус. Вони мають вірусну капсулу із укладеними у ній РНК і спеціальним ферментом. Фермент і є зворотна транскриптаза, яка синтезує ДНК по матриці цієї вірусної РНК, а ця ДНК вже служить генетичним матеріалом для подальшого розвиткувірусу у клітці.

Звичайно, це відкриття викликало великий шок і безліч суперечок серед молекулярних біологів, оскільки вважалося, що, виходячи з центральної догми, цього не може бути. Проте Крик одразу пояснив, що він ніколи не казав, що це неможливо. Він говорив лише те, що ніколи не може відбуватися потік інформації від білка до нуклеїнових кислот, а вже всередині нуклеїнових кислот будь-якого роду процеси цілком можливі: синтез ДНК на ДНК, ДНК на РНК, РНК на ДНК та РНК на РНК.

Після формулювання центральної догми, як і раніше, залишався ряд питань: як алфавіт з чотирьох нуклеотидів, що становлять ДНК (або РНК), кодує 20-літерний алфавіт амінокислот, з яких складаються білки? У чому полягає сутність генетичного коду?

Перші ідеї про існування генетичного коду сформулювали Олександр Даунс ( 1952 р.) та Георгій Гамов ( 1954 р). Вчені показали, що послідовність нуклеотидів повинна включати не менше трьох ланок. Пізніше було доведено, що така послідовність складається із трьох нуклеотидів, названих кодоном (триплетом). Проте питання, які нуклеотиди відповідальні за включення якої амінокислоти в білкову молекулу, залишалося відкритим до 1961 року.

А в 1961 році Маршалл Ніренберг разом із Генріх Маттеї використали систему для трансляції in vitro. У ролі матриці взяли олігонуклеотид. До його складу входили лише залишки урацилу, а пептид, синтезований з нього, включав лише амінокислоту фенілаланін. Таким чином, вперше було встановлено значення кодону: кодон UUU кодує фенілаланін. По них Хар Корана з'ясував, що послідовність нуклеотидів UCUCUCUCUCUC кодує набір амінокислот серин-лейцин-серин-лейцин. За великим рахунком, завдяки роботам Ніренберга та Корани, 1965 Цього року генетичний код був повністю розгаданий. З'ясувалося, кожен триплет кодує певну амінокислоту. А порядок кодонів визначає порядок амінокислот у білку.

Основні принципи функціонування білків та нуклеїнових кислот сформулювали до початку 70-х років. Було зафіксовано, що синтез білків та нуклеїнових кислот здійснюється за матричним механізмом. Молекула-матриця містить закодовану інформацію про послідовність амінокислот або нуклеотидів. При реплікації або транскрипції матрицею служить ДНК, при трансляції та зворотній транскрипції - іРНК.

Так було створено передумови на формування напрямів молекулярної біології, зокрема і генної інженерії. А 1972 року Пол Берг із колегами розробив технологію молекулярного клонування. Вчені отримали першу рекомбінантну ДНК in vitro. Ці визначні відкриття лягли в основу нового напряму молекулярної біології, а 1972 рік відтоді вважається датою народження генної інженерії.

3. Методи молекулярної біології

Колосальні успіхи у вивченні нуклеїнових кислот, будові ДНК та біосинтезу білка призвели до створення низки методів, що мають велике значення у медицині, сільському господарстві та науці в цілому.

Після вивчення генетичного коду та основних принципів зберігання, передачі та реалізації спадкової інформації для подальшого розвитку молекулярної біології стали необхідні спеціальні методи. Ці методи дозволили б проводити маніпуляції з генами, змінювати та виділяти їх.

Поява таких методів сталася у 1970–1980-х роках. Це дало величезний поштовх до розвитку молекулярної біології. У першу чергу, ці методи безпосередньо пов'язані з отриманням генів та їх впровадженням у клітини інших організмів, а також з можливістю визначення послідовності нуклеотидів у генах.

3.1. Електрофорез ДНК

Електрофорез ДНКє базовим способом роботи з ДНК. Електрофорез ДНК застосовується разом з іншими методами виділення необхідних молекул і подальшого аналізу результатів. Сам метод електрофорезу в гелі використовується для розподілу фрагментів ДНК за довжиною.

Попередньо або після електрофорезу гель обробляється барвниками, які можуть зв'язатися з ДНК. Барвники флуоресціюють в ультрафіолетовому світлі, виходить картина зі смуг у гелі. Для визначення довжин фрагментів ДНК їх можна порівняти з маркерами- наборами фрагментів стандартних довжин, що наносяться на той самий гель.

Флуоресцентні білки

При дослідженні еукаріотичних організмів як гени-маркери зручно використовувати флуоресцентні білки. Ген першого зеленого флуоресцентного білка ( green fluorescent protein, GFP) виділили з медузи Aqeuorea victoria, після чого впровадили у різні організми. Після цього виділяли гени флуоресцентних білків інших кольорів: синіх, жовтих, червоних. Щоб отримати білки з властивостями, що цікавлять, такі гени були модифіковані штучно.

Взагалі найважливішими інструментами для роботи з молекулою ДНК є ферменти, що здійснюють ряд перетворень ДНК у клітинах: ДНК-полімерази, ДНК-лігазиі рестриктази (рестрикційні ендонуклеази).

Трансгенез

Трансгенезомназивається перенесення генів з одного організму до іншого. А такі організми називаються трансгенними.

Рекомбінантні білкові препарати отримують шляхом перенесення генів у клітини мікроорганізмів. В основному такими білковими препаратами є інтерферони, інсуліндеякі білкові гормони, а також білки для виробництва ряду вакцин.

В інших випадках застосовують клітинні культури еукаріотів або трансгенних тварин, переважно, худобу, яка виділяє потрібні білки в молоко. Таким чином отримують антитіла, фактори зсідання крові та інші білки. Метод трансгенезу використовують для одержання культурних рослин, стійких до шкідників та гербіцидів, а за допомогою трансгенних мікроорганізмів очищають стічні води.

Крім всього перерахованого, трансгенні технології незамінні в наукових дослідженнях, адже розвиток біології відбувається швидше із застосуванням методів модифікації та перенесення генів.

Рестриктази

Розпізнавані рестриктазами послідовності є симетричними, тому різного роду розриви можуть відбуватися або в середині такої послідовності, або зі зсувом в одній або обох нитках молекули ДНК.

При розщепленні будь-якої ДНК рестриктазою, послідовності на кінцях фрагментів будуть однаковими. Вони зможуть знову з'єднуватись, оскільки мають комплементарні ділянки.

Отримати єдину молекулу можна, зшивши дані послідовності за допомогою ДНК-лігази. За рахунок цього можна поєднувати фрагменти двох різних ДНК та отримувати рекомбінантні ДНК.

3.2. ПЛР

В основі методу лежить здатність ДНК-полімераз добудовувати другу нитку ДНК комплементарної нитки так само, як при процесі реплікації ДНК в клітині.

3.3. Секвенування ДНК

Стрімкий розвиток методу секвенування дозволяє ефективно визначати особливості досліджуваного організму лише на рівні його геному. Головною перевагою таких геномних і постгеномних технологій є збільшення можливостей дослідження та вивчення генетичної природи захворювань людини, щоб заздалегідь вжити необхідних заходів та уникнути хвороб.

За рахунок великих досліджень можна отримати необхідні дані про різні генетичні характеристики різних груп людей, тим самим розвиваючи методи медицини. Через це виявлення генетичної схильності до різних захворювань сьогодні користується величезною популярністю.

Подібні методи широко застосовні практично в усьому світі, зокрема й у Росії. Через науковий прогрес відбувається впровадження таких методів у медичні дослідження та медичну практику загалом.

4. Біотехнологія

Біотехнологія- дисципліна, вивчає можливості використання живих організмів чи його систем на вирішення технологічних завдань, а також створення живих організмів з корисними властивостями шляхом генної інженерії. Біотехнологія застосовує методи хімії, мікробіології, біохімії та, звичайно ж, молекулярної біології.

Основні напрямки розвитку біотехнології (принципи біотехнологічних процесів впроваджують у виробництво всіх галузей):

  1. Створення та виробництво нових видів продуктів харчування та кормів для тварин.
  2. Одержання та вивчення нових штамів мікроорганізмів.
  3. Виведення нових сортів рослин, а також створення засобів для захисту рослин від хвороб та шкідників.
  4. Застосування методів біотехнології потреб екології. Такі методи біотехнології використовують для переробки утилізації відходів, очищення стічних вод, відпрацьованого повітря та санації ґрунтів.
  5. Виготовлення вітамінів, гормонів, ферментів, сироваток для потреб медицини. Біотехнологи розробляють удосконалені лікарські препарати, які раніше вважалися невиліковними.

Великим досягненням біотехнології є генна інженерія.

Генна інженерія- сукупність технологій та методів отримання рекомбінантних молекул РНК та ДНК, виділення окремих генів із клітин, здійснення маніпуляцій з генами та введення їх в інші організми (бактерій, дріжджі, ссавців). Такі організми здатні виробляти кінцеві продукти з потрібними зміненими властивостями.

Методи генної інженерії спрямовані на конструювання нових, які раніше не існували поєднань генів у природі.

Говорячи про досягнення генної інженерії, неможливо не торкнутися теми клонування. Клонування- це один із методів біотехнології, що застосовується для отримання ідентичних нащадків різних організмів за допомогою безстатевого розмноження.

Інакше кажучи, клонування можна як процес створення генетично ідентичних копій організму чи клітини. А клоновані організми схожі або зовсім ідентичні не лише за зовнішніми ознаками, а й за генетичним змістом.

Відома овечка Доллі в 1966 стала першим клонованим ссавцем. Вона була отримана за рахунок пересадки ядра соматичної клітини до цитоплазми яйцеклітини. Доллі була генетичною копією вівці-донора ядра клітини. У природних умовах особина формується з однієї заплідненої яйцеклітини, отримавши по половині генетичного матеріалу двох батьків. Однак при клонуванні генетичний матеріал взяли із клітини однієї особини. Спочатку із зиготи видалили ядро, в якому знаходиться сама ДНК. Після чого витягли ядро ​​з клітини дорослої особи вівці та імплантували його в ту позбавлену ядра зиготу, а потім її пересадили в матку дорослої особи і надали можливість для зростання та розвитку.

Проте не всі спроби клонування були вдалими. Паралельно з клонуванням Доллі експеримент із заміни ДНК було проведено на 273 інших яйцеклітинах. Але тільки в одному випадку змогло повноцінно розвинутися і вирости живу дорослу тварину. Після Доллі вчені намагалися клонувати й інші види ссавців.

Одним з видів генної інженерії є редагування геному.

Інструмент CRISPR/Cas базується на елементі імунної захисної системи бактерій, який вчені пристосували для впровадження будь-яких змін ДНК тварин або рослин.

CRISPR/Cas є одним із біотехнологічних методів маніпулювання окремими генами у клітинах. Існує безліч застосувань такої технології. CRISPR/Cas дозволяє дослідникам з'ясовувати функцію різних генів. Для цього потрібно просто вирізати досліджуваний ген із ДНК та вивчити, які функції організму були порушені.

Деякі практичні застосування системи:

  1. Сільське господарство.З допомогою CRISPR/Cas-систем можна вдосконалити сільськогосподарські культури. А саме, зробити їх смачнішими та поживними, а також стійкими до спеки. Можна наділити рослини та іншими якостями: наприклад, вирізати з горіхів (арахісу або фундука) ген алергену.
  2. Медицина, спадкові захворювання.Вчені мають на меті застосовувати CRISPR/Cas для видалення з людського геному мутацій, через які можуть розвиватися захворювання, такі, як серповидноклітинна анемія та ін. У теорії, за рахунок CRISPR/Cas можна зупиняти розвиток ВІЛ.
  3. Генний драйв. CRISPR/Cas може змінювати не тільки геном окремої тварини або рослини, але також генофонд виду. Ця концепція відома як «генний драйв». Кожен живий організм передає своєму нащадку половину генів. Але використання CRISPR/Cas може підвищувати можливість передачі генів до 100%. Це важливо для того, щоб потрібна ознака швидше поширилася у всій популяції.

Швейцарські вчені значно вдосконалили та модернізували метод редагування геному CRISPR/Cas, тим самим розширивши його можливості. Тим не менше, вчені могли модифікувати тільки один ген за раз, використовуючи CRISPR/Cas-систему. Але зараз дослідники Швейцарської вищої технічної школиЦюріха розробили метод, за допомогою якого можна одночасно модифікувати 25 генів у клітині.

Для новітньої методики фахівці використовували фермент Cas12a. Генетики вперше в історії успішно клонували мавп. "Популярна механіка";

  • Ніколенко С. (2012). Геноміка: постановка задачі та методи секвенування. «Постнаука».

  • інтерв'ю

    Пирогов Сергій – учасник підготовки до олімпіади з біології, організованої "Слон та Жираф" у 2012 р.
    Переможець міжнародної універсіади з біології
    Переможець олімпіади «Ломоносів»
    Призер регіонального етапу Всеросійської олімпіади з біології у 2012 р.
    Вчиться у МДУ ім. М.В. Ломоносова на біологічному факультеті: кафедра молекулярної біології, на 6 курсі. Працює у лабораторії біохімічної генетики тварин Інституту молекулярної генетики.

    - Сергію, якщо у читачів з'являться питання, вони зможуть їх тобі поставити?

    Так, звичайно, поставити запитання можна хоч одразу. У цьому полі:

    Натисніть, щоб поставити запитання.

    - Давай почнемо зі школи, у тебе начебто була не суперкрута школа?

    Я навчався у дуже слабкій московській школі школі, такій середньостатистичній ЗОШ. Щоправда, у нас була чудова вчителька з МХК, завдяки якій у нас з'явилася багато в чому номінальна "мистецтвознавча" спрямованість школи.

    – А що з біологією?

    Біологію у нас вела дуже літня, глуховата і різка жінка, яку всі побоювалися. Але любові до її предмета не додавало. Я ж з дитинства був захоплений біологією, років із п'яти. Читав все сам, переважно захоплюючись анатомією та зоологією. Так що шкільні предметиіснували паралельно до моїх власних інтересів. Усі змінили олімпіади.

    - Розкажи про це докладніше.

    У 7 класі я вперше взяв участь у муніципальному етапі (звичайно, відразу майже з усіх предметів, оскільки був єдиним учнем, якого вчителі мали підстави відправити). І став переможцем із біології. Тоді школа поставилася до цього як до кумедного, але не надто цікавого факту.


    - Чи це допомогло тобі в школі?

    Пам'ятаю, що незважаючи на блискуче навчання, нерідко отримував від викладача з біології четвірки з причіпками на кшталт "на малюнку розрізу цибулини коріння повинні бути розфарбовані коричневим, а не сірим". Все це було досить обтяжливим. У 8 класі я знову пішов на олімпіади, але з біології мене чомусь не відправили. Натомість став переможцем та призером з інших предметів.

    - А що було у 9 класі?

    У 9-му класі не пішов на окружний етап. Там я несподівано набрав слабенький, прикордонний бал, який виявився все ж таки прохідним на регіональний етап. Це мало потужну мотивуючу силу - усвідомлення того, як багато виявляється я не знаю і як багато людей, які все це знають (скільки таких людей у ​​масштабі країни я навіть боявся уявити).

    – Розкажи, як ти готувався.

    Інтенсивні самостійні заняття, набіги на книгарні і тисячі торішніх завдань мали цілющий ефект. Я набрав один із найбільших балів за теорію (що теж було для мене зовсім раптовим), пройшов на практичний етап... і провалив його. Тоді я ще взагалі не знав про існування практичного етапу.

    - Чи вплинула на тебе олімпіада?

    Моє життя радикально змінилося. Я дізнався про багато інших олімпіад, особливо полюбив ШПВ. Згодом на багатьох показував гарні результати, деякі вигравав, завдяки "Ломоносівській" отримав право на вступ без іспитів. Паралельно я вигравав олімпіади з історії мистецтва, до якого нерівно дихаю й досі. Щоправда, з практичними турами так і не дружив. В 11 класі я таки дійшов до заключного етапу, але Фортуна не була прихильною і цього разу я не встиг заповнити матрицю відповідей теоретичного етапу. Зате це дозволило вже не турбуватися за практичний.

    - Ти з багатьма олімпіадниками познайомився?

    Так, досі вважаю, що мені дуже пощастило з колом моїх однолітків, які значно розширили мій кругозір. Інший бік олімпіад, крім мотивації більш гармонійно вивчати предмет, було знайомство з олімпіадниками. Вже в той час я помітив, що горизонтальне спілкування часом корисніше від вертикального - з викладачами на зборах.


    - Як ти вступав до ВНЗ? Вибирав факультет?

    Після 11 класу я вступив до біофаку МДУ. Саме більшість моїх тодішніх товаришів зробили вибір на користь ФББ, але тут першочергову роль відіграло те, що я не став призером всеросу. Значить мені треба було б складати внутрішній іспит з математики, а в ній, особливо шкільній – вищу я полюбив значно більше – я був не сильний. І в школі була дуже слабка підготовка (нас навіть не готували до майже всієї частини). У плані інтересів вже тоді я здогадувався, що, зрештою, можна дійти будь-якого результату, незалежно від місця надходження. Згодом з'ясувалося, що багато є і випускників ФББ, які переходили в переважно мокру біологію, і навпаки - багато хороших біоінформатиків починали любителями. Хоча в той момент мені і здавалося, що на біофаку контингент буде не в приклад слабшим за ФББшний. У цьому я, безперечно, помилявся.

    А ви знали?

    цікаво

    А ви знали?

    цікаво

    У таборі Слон та Жираф є зміни з біохімії та молекулярної біології, де школярі разом із досвідченими викладачі з МДУ ставлять експерименти, а також готуються до олімпіад.

    © Інтерв'ю брав Решетов Денис. Фотографії люб'язно надав Пирогов Сергій.

    31.2

    Для друзів!

    Довідка

    Молекулярна біологія виросла з біохімії у квітні 1953 року. Її поява пов'язана з іменами Джеймса Вотсона та Френсіса Крику, які відкрили структуру молекули ДНК. Відкриття стало можливим завдяки дослідженню генетики, бактерій та біохімії вірусів. Професія молекулярний біолог немає широкого поширення, але сьогодні її роль сучасному суспільстві дуже велика. Велика кількість захворювань, у тому числі, що виявляються на генетичному рівні, потребує вчених пошуку рішень даної проблеми.

    Опис діяльності

    Віруси та бактерії постійно мутують, а це означає, що людині перестають допомагати ліки та хвороби стають важковиліковними. Завдання молекулярної біології – випередити цей процес та розробити новий засіб від хвороб. Вчені працюють за налагодженою схемою: блокування причини захворювання, усунення механізмів спадковості та полегшення цим стану пацієнта. У світі існує низка центрів, клінік та лікарень, де молекулярні біологи на допомогу пацієнтам розробляють нові способи лікування.

    Трудові обов'язки

    До обов'язків молекулярного біолога входить вивчення процесів усередині клітини (наприклад, зміни у ДНК у разі розвитку пухлин). Також фахівці вивчають особливості ДНК, їх вплив на цілий організм та окрему клітину. Такі дослідження проводяться, наприклад, на підставі ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), яка дозволяє зробити аналіз організму на інфекції, спадкові захворювання та визначити біологічну спорідненість.

    Особливості кар'єрного зростання

    Професія молекулярний біолог є досить перспективною у своїй сфері і вже сьогодні претендує на перші місця у рейтингу медичних професій майбутнього. До речі, молекулярному біологу не обов'язково постійно залишатися у цій сфері. Якщо виникне бажання змінити рід занять, він може перекваліфікуватися на менеджери з продажу лабораторного обладнання, почати розробляти прилади для різних досліджень або відкрити свою справу.

    Розвиток біохімії, біофізики, генетики, цитохімії, багатьох розділів мікробіології та вірусології приблизно на початок 40-х років XX ст. впритул підвело до вивчення життєвих явищ на молекулярному рівні. Успіхи, досягнуті цими науками, одночасно і з різних сторін призвели до усвідомлення того факту, що саме на молекулярному рівні функціонують основні керуючі системи організму і що подальший прогрес цих наук залежатиме від розкриття біологічних функцій молекул, що становлять тіла організмів, їх участі у синтезі та розпаду, взаємних перетвореннях та репродукції сполук у клітині, а також обміну енергією та інформацією, що відбувається при цьому. Так на стику цих біологічних дисциплін з хімією та фізикою виникла зовсім нова галузь – молекулярна біологія.

    На відміну від біохімії, увага сучасної молекулярної біології зосереджена переважно на вивченні структури та функції найважливіших класів біополімерів – білків та нуклеїнових кислот, перші з яких визначають саму можливість протікання обмінних реакцій, а другі – біосинтез специфічних білків. Зрозуміло тому, що чітке розмежування молекулярної біології та біохімії, відповідних розділів генетики, мікробіології та вірусології неможливо.

    Виникнення молекулярної біології було тісно пов'язане з розробкою нових методів дослідження, про які вже йшлося у відповідних розділах. Поряд із розвитком електронної мікроскопії та інших методів мікроскопічної техніки велику роль відіграли розроблені у 50-х роках методи фракціонування клітинних елементів. Вони ґрунтувалися на вдосконалених методах диференціального центрифугування (А. Клод, 1954). До цього часу вже були досить надійні способи виділення та фракціонування біополімерів. Сюди належить, зокрема, запропонований А. Тизеліусом (1937; Нобелівська премія, 1948) метод фракціонування білків за допомогою електрофорезу, методи виділення та очищення нуклеїнових кислот (Е. Кей, А. Даунс, М. Севаг, А. Мирський та ін. ). Паралельно у багатьох лабораторіях світу розроблялися різні методи хроматографічного аналізу (А. Мартін та Р. Сінг, 1941; Нобелівська премія, 1952), згодом суттєво вдосконалені.

    Неоціненну послугу у розшифровці структури біополімерів зіграв рентгеноструктурний аналіз. Основні принципи рентгеноструктурного аналізу було розроблено у Королівському коледжі Лондонського університету під керівництвом У. Брегга групою дослідників, куди входили Дж. Бернал, А. Лондсдейл, У. Астбері, Дж. Робертсон та інших.

    Слід особливо відзначити дослідження професора Московського державного університетуА. Р. Кізеля з біохімії протоплазми (1925 - 1929), що мали найважливіше значення для подальшого становлення молекулярної біології. Кизель завдав удару міцно укоріненому уявленню, що в основі будь-якої протоплазми лежить особливе білкове тіло - пластин, що нібито визначає всі її найважливіші структурні та функціональні особливості. Він показав, що пластини - це білок, який зустрічається тільки у міксоміцетів, і то на певній стадії розвитку, і що жодного постійного компонента - єдиного скелетного білка - у протоплазмі не існує. Тим самим вивчення проблеми будови протоплазми та функціональної ролі білків вийшло на правильний шлях і одержало простір для свого розвитку. Дослідження Кізеля завоювали світове визнання, стимулювавши вивчення хімії складових частин клітини.

    Термін "молекулярна біологія", вперше використаний англійським кристалографом професором Лідського університету У. Астбері, виник, ймовірно, на початку 40-х років (до 1945 р.). Основні рентгеноструктурні дослідження білків і ДНК, проведені Астбері в 30-х роках, послужили основою для подальшого успішного розшифрування вторинної структури цих біополімерів. У 1963 р. Дж. Бернал писав: "Пам'ятник йому буде встановлено всією молекулярною біологією - наукою, яку він назвав і справді заснував" * , У літературі цей термін з'явився вперше, мабуть, у 1946 р. у статті У. Астбері "Прогрес рентгеноструктурного" аналізу органічних та фібрилярних сполук", опублікованій в англійському журналі "Природа"**. У своїй Гарвіївській лекції Астбері (1950) відзначав: "Мені приємно, що зараз термін молекулярна біологія вже досить широко вживається, хоча мало ймовірно, що я першим запропонував його. Він мені подобався і я вже давно намагався його поширювати". Вже в 1950 р. Астбері було ясно, що молекулярна біологія має справу насамперед із структурою та конформацією макромолекул, вивчення яких має вирішальне значення для розуміння функціонування живих організмів.

    * (Biogr. Mem. Fellows Roy. Soc, 1963, v. 9, 29.)

    ** (W. T. Astbury. Progress of X-ray analysis of organic and fibre structures.- Nature,. 1946, v. 157, 121.)

    *** (W. T. Astbury. Adventures in Molecular Biology. Thomas Springfield, 1952, p. 3.)

    Перед молекулярною біологією стояли і стоять, власне, ті самі завдання, що і перед усією біологією в цілому, - пізнання сутності життя та його основних явищ, зокрема таких, як спадковість та мінливість. Сучасна молекулярна біологія насамперед покликана розшифрувати структуру та функцію генів, шляхи та механізми реалізації генетичної інформації організмів на різних стадіях онтогенезу та на різних етапах її зчитування. Вона покликана розкрити тонкі механізми регуляції активності генів та клітинної диференціювання, з'ясувати природу мутагенезу та молекулярні основи еволюційного процесу.

    Встановлення генетичної ролі нуклеїнових кислот

    Для становлення молекулярної біології найбільше значення мали такі відкриття. У 1944 р. американські дослідники О. Евері, К. Мак-Леод (Нобелевська премія, 1923) і М. Мак-Карті показали, що виділені з пневмококів молекули ДНК мають трансформуючу активність. Після гідролізу цих ДНК дезоксирибонуклеазою їхня трансформуюча активність повністю зникала. Тим самим було вперше було переконливо доведено, що генетичними функціями у клітині наділена саме ДНК, а чи не білок.

    Заради справедливості слід зазначити, що явище бактеріальної трансформації було виявлено значно раніше відкриття Евері, Мак-Леода та Мак-Карті. У 1928 р. Ф. Гріффіт опублікував статтю, в якій повідомив, що після додавання до невірулентних (некапсульованих) пневмококів убитих клітин капсульованого вірулентного штаму одержувана суміш клітин стає згубною для мишей. Більш того, живі клітини пневмококів, що виділяються із заражених цією сумішшю тварин, були вже вірулентними і мали полісахаридну капсулу. Тим самим у цьому досвіді було показано, що під впливом якихось компонентів убитих клітин пневмококів некапсульована форма бактерій перетворюється на капсулоутворюючу вірулентну форму. Через 16 років Евері, Мак-Леод і Мак-Карті замінили в цьому досвіді вбиті цілі клітини пневмококів їх дезоксирибонуклеїновою кислотою і показали, що саме ДНК має трансформуючу активність (див. також розділи 7 і 25). Значення цього відкриття важко переоцінити. Воно стимулювало вивчення нуклеїнових кислот у багатьох лабораторіях світу та змусило сконцентрувати увагу вчених саме на ДНК.

    Поруч із відкриттям Эвери, Мак-Леода і Мак-Карти на початку 50-х вже накопичилося досить багато прямих і непрямих даних у тому, що нуклеїнові кислоти грають виняткову роль життєдіяльності і несуть генетичну функцію. На це, зокрема, вказував і характер локалізації ДНК у клітині та дані Р. Вендрелі (1948) про те, що вміст ДНК на клітину строго постійно і корелює зі ступенем плідності: у гаплоїдних статевих клітинах ДНК вдвічі менше, ніж у диплоїдних соматичних. На користь генетичної ролі ДНК свідчила також її виражена метаболічна стабільність. До початку 50-х років накопичилося багато різноманітних фактів, що свідчили, що більшість відомих мутагенних факторів діють переважно на нуклеїнові кислоти і, особливо, на ДНК (Р. Хочкісс, 1949; Г. Ефруссі-Тейлор, 1951; Е. Фріз , 1957 та ін.).

    Особливого значення у встановленні генетичної ролі нуклеїнових кислот мало вивчення різних фагів та вірусів. У 1933 р. Д. Шлезінгер знайшов ДНК у бактеріофазі кишкової палички. З моменту виділення У. Стенлі (1935, Нобелівська премія, 1946) вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) у кристалічному стані розпочався. новий етапу вивченні рослинних вірусів. У 1937 – 1938 рр. Співробітники Ротамстедської сільськогосподарської станції (Англія) Ф. Боуден і Н. Пірі показали, що багато виділених ними рослинних вірусів є не глобулінами, а являють собою рибонуклеопротеїди і містять як обов'язковий компонент нуклеїнову кислоту. На самому початку 40-х років були опубліковані роботи Г. Шрамма (1940), П. А. Агатова (1941), Г. Міллера та У. Стенлі (1941), що свідчили про те, що помітна хімічна модифікація білкового компонента не призводить до втрати інфекційності ВТМ. Це вказувало на те, що білковий компонент не може бути носієм спадкових властивостей вірусу, як продовжували вважати багато мікробіологів. Переконливі докази на користь генетичної ролі нуклеїнової кислоти (РНК) у рослинних вірусів були отримані у 1956 р. Г. Шраммом у Тюбінгені (ФРН) та X. Френкель-Конратом у Каліфорнії (США). Ці дослідники практично одночасно і незалежно один від одного виділили з ВТМ РНК і показали, що саме вона, а не білок, має інфекційність: у результаті зараження рослин тютюну цієї РНК у них відбувалося формування та розмноження нормальних вірусних частинок. Це означало, що РНК містить інформацію для синтезу та збирання всіх вірусних компонентів, у тому числі і вірусного білка. У 1968 р. І. Р. Атабеков встановив, що білок грає істотну роль при зараженні рослин - природою білка визначається спектр рослин-господарів.

    У 1957 р. Френкель-Конрат вперше здійснив реконструкцію ВТМ із складових його компонентів – РНК та білка. Поряд із нормальними частинками він отримав змішані "гібриди", у яких РНК була від одного штаму, а білок - від іншого. Спадковість таких гібридів повністю визначалася РНК, і потомство вірусів належало до того штаму, РНК якого було використано отримання вихідних змішаних частинок. Пізніше досліди А. Гірера, Г. Шустера та Г. Шрамма (1958) та Г. Вітмана (1960 – 1966) показали, що хімічна модифікація нуклеїнового компонента ВТМ призводить до появи різноманітних мутантів цього вірусу.

    У 1970 р. Д. Балтімор і Р. Темін встановили, що перенесення генетичної інформації може відбуватися як від ДНК до РНК, а й навпаки. Вони виявили у деяких онкогенних РНК-вірусів (онкорнавіруси) особливий фермент, так звану зворотну транскриптазу, який здатний на ланцюгах РНК комплементарно синтезувати ДНК. Це велике відкриття дозволило зрозуміти механізм вбудовування в геном господаря генетичної інформації РНК-вірусів і по-новому поглянути на природу їх онкогенної дії.

    Відкриття нуклеїнових кислот та вивчення їх властивостей

    Термін нуклеїнових кислот був введений німецьким біохіміком Р. Альтманом в 1889 р., після того, як ці сполуки були відкриті в 1869 р. швейцарським лікарем Ф. Мішером. Мішер екстрагував клітини гною розведеною соляною кислотою протягом кількох тижнів та отримав у залишку майже чистий ядерний матеріал. Цей матеріал він вважав характерною речовиною клітинних ядер і назвав його нуклеїном. За своїми властивостями нуклеїн різко відрізнявся від білків: він був більш кислим, не містив сірку, зате в ньому було багато фосфору, він добре розчинявся в лугах, але не розчинявся в розведених кислот.

    Результати своїх спостережень над нуклеїном Мішер направив Гоппе-Зейлеру для опублікування в журналі. Описана ним речовина була настільки незвичайною (тоді з усіх біологічних сполук фосфору був відомий тільки лецитин), що Гоппе-Зейлер не повірив досвідам Мішера, повернув йому рукопис і доручив своїм співробітникам М. Плошу та Н. Любавіну перевірити його висновки на іншому матеріалі. . Робота Мішера "Про хімічний склад клітин гною" побачила світ двома роками пізніше (1871). У той же час були опубліковані роботи Гоппе-Зейлера та його співробітників щодо складу клітин гною, еритроцитів птахів, змій та інших клітин. Протягом наступних трьох років нуклеїн був виділений із тварин клітин та дріжджів.

    У своїй роботі Мішер зазначав, що детальне вивчення різних нуклеїнів може призвести до встановлення відмінностей між ними, передбачивши цим ідею специфічності нуклеїнових кислот. Досліджуючи молоко лосося, Мішер встановив, що нуклеїн знаходиться в них у вигляді солі і пов'язаний з основним білком, який він назвав протаміном.

    У 1879 р. в лабораторії Гоппе-Зейлер вивченням нуклеїнів почав займатися А. Коссель. У 1881 р. він виділив з нуклеїну гіпоксантин, однак у той час він ще сумнівався у походженні цієї основи та вважав, що гіпоксантин може бути продуктом деградації білків. У 1891 р. серед продуктів гідролізу нуклеїну Коссель виявив аденін, гуанін, фосфорну кислоту та ще одну речовину з властивостями цукру. За дослідження з хімії нуклеїнових кислот Косселю у 1910 р. було присуджено Нобелівську премію.

    Подальші успіхи у розшифровці структури нуклеїнових кислот пов'язані з дослідженнями П. Левіна та співробітників (1911 – 1934). У 1911 р. П. Левін та В. Жакобс ідентифікували вуглеводний компонент аденозину та гуанозину; вони встановили, що до складу цих нуклеозидів входить D-рибоза. У 1930 р. Левін показав, що вуглеводним компонентом дезоксирибонуклеозидів є 2-дезокси-D-рибоза. З його робіт стало відомо, що нуклеїнові кислоти побудовані з нуклеотидів, тобто фосфорильованих нуклеозидів. Левін вважав, що основним типом зв'язку в нуклеїнових кислотах (РНК) є 2", 5"-фосфодіефірний зв'язок. Це уявлення виявилося помилковим. Завдяки роботам англійського хіміка А. Тодда (Нобелевська премія, 1957) та його співробітників, а також англійських біохіміків Р. Маркхема та Дж. Сміта на початку 50-х років стало відомо, що основним типом зв'язку в РНК є 3", 5"- фосфодіефірний зв'язок.

    Левін показав, що різні нуклеїнові кислоти можуть відрізнятися за природою вуглеводного компонента: одні містять цукор дезоксирибозу, інші - рибозу. Крім того, зазначені два типи нуклеїнових кислот розрізнялися за природою однієї з основ: у нуклеїнових кислотах пентозного типу містився урацил, а в нуклеїнових кислотах дезоксипентозного типу – тимін. Дезоксипентозну нуклеїнову кислоту (за сучасною термінологією, дезоксирибонуклеїнова кислота – ДНК) зазвичай легко виділяли у великих кількостях із тимусу (зобної залози) телят. Тому вона отримала назву тимонуклеїнової кислоти. Джерелом нуклеїнової кислоти пентозного типу (РНК) служили головним чином дріжджі та зародки пшениці. Цей тип часто називали дріжджовою нуклеїновою кислотою.

    На початку 30-х років досить міцно укоренилося уявлення, ніби для рослинних клітин характерна нуклеїнова кислота дріжджового типу, а тимонуклеїнова кислота властива лише ядрам тваринних клітин. Два типи нуклеїнових кислот - РНК і ДНК - тоді називали відповідно рослинної і тваринної нуклеїновими кислотами. Проте, як показали ранні дослідження А. Н. Білозерського, такий поділ нуклеїнових кислот є невиправданим. У 1934 р. Білозерський вперше виявив тимонуклеїнову кислоту в рослинних клітинах: з проростків гороху він виділив та ідентифікував тімін-піримідинову основу, характерну саме для ДНК. Потім він виявив тімін і в інших рослинах (насінні сої, квасолі). У 1936 р. А. Н. Білозерський та І. І. Дубровська виділили препаративно ДНК із проростків кінського каштана. Крім того, серія робіт, виконаних у 40-х роках в Англії Д. Девідсоном із співробітниками, переконливо показала, що рослинна нуклеїнова кислота (РНК) міститься у багатьох тваринних клітинах.

    Широке застосування розробленої Р. Фельгеном і Г. Розенбеком (1924) цитохімічної реакції на ДНК та реакції Ж. Браше (1944) на РНК дозволило досить швидко та однозначно вирішити питання про переважну локалізацію цих нуклеїнових кислот у клітині. Виявилося, що ДНК зосереджена в ядрі, тоді як РНК концентрується переважно в цитоплазмі. Пізніше було з'ясовано, що РНК міститься як у цитоплазмі, так і в ядрі, а крім того, були виявлені цитоплазматичні ДНК.

    Що стосується питання про первинну структуру нуклеїнових кислот, то до середини 40-х років у науці міцно утвердилося уявлення П. Левіна, згідно з яким всі нуклеїнові кислоти побудовані за одним типом і складаються з однакових так званих тетрануклеотидних блоків. У кожному з цих блоків, на думку Левіна, міститься чотири різні нуклеотиди. Тетрануклеотидна теорія будови нуклеїнових кислот значною мірою позбавляла ці біополімери специфічності. Тому не дивно, що всю специфіку живого пов'язували тоді лише з білками, природа мономерів яких набагато різноманітніша (20 амінокислот).

    Першу пролом теоренуклеотидного будови нуклеїнових кислот пробили аналітичні дані англійського хіміка Дж. Гуланда (1945 - 1947). При визначенні складу нуклеїнових кислот азоту підстав він не отримав еквімолярного співвідношення підстав, як це мало б бути згідно з теорією Левіна. Остаточно тетрануклеотидна теорія будови нуклеїнових кислот впала в результаті досліджень Е. Чаргаффа та його співробітників (1949 – 1951). Для поділу основ, що вищеплюються з ДНК внаслідок її кислотного гідролізу, Чаргафф використовував хроматографію на папері. Кожна з цих підстав була точно визначена спектрофотометрично. Чаргафф помітив значні відхилення від еквімолярного співвідношення підстав у ДНК різного походження і вперше виразно заявив, що ДНК має виражену видову специфічність. Тим самим було покінчено з гегемонією концепції про специфічність білка у живій клітині. Аналізуючи ДНК різного походження, Чаргафф відкрив і сформулював унікальні закономірності складу ДНК, що увійшли до науки під назвою правил Чаргаффа. Згідно з цими правилами, у всіх ДНК, незалежно від походження, кількість аденіну дорівнює кількості тиміну (А = Т), кількість гуаніну дорівнює кількості цитозину (Г = Ц), кількість пуринів дорівнює кількості піримідинів (Г + А = Ц + Т), кількість основ з 6-аміногрупами дорівнює кількості основ з 6-кетогруп-пами (А+Ц=Г+Т). Разом про те, попри такі суворі кількісні відповідності, ДНК різних видів відрізняються за величиною відношення А+Т:Г+Ц. В одних ДНК кількість гуаніну та цитозину переважає над кількістю аденіну та тиміну (ці ДНК Чаргафф назвав ДНК ГЦ-типу); інші ДНК містили аденіну та тиміну більше, ніж гуаніну та цитозину (ці ДНК були названі ДНК АТ-типу). Отримані Чаргаффом дані щодо складу ДНК зіграли виняткову роль молекулярної біології. Саме вони лягли в основу відкриття будови ДНК, зробленої в 1953 Дж. Уотсоном і Ф. Криком.

    Ще в 1938 р. У. Астбері і Ф. Белл за допомогою рентгеноструктурного аналізу показали, що площини основ у ДНК повинні бути перпендикулярними до довгої осі молекули і нагадувати як би стопку пластин, що лежать один над одним. У міру вдосконалення техніки рентгеноструктурного аналізу до 1952 – 1953 рр. накопичилися відомості, що дозволили судити про довжину окремих зв'язків та кутах нахилу. Це дозволило з найбільшою ймовірністю уявити характер орієнтації кілець пентозних залишків у сахарофосфатном кістяку молекули ДНК. У 1952 р. С. Фарберг запропонував дві умоглядні моделі ДНК, які представляли складену або закручену саму на себе однотяжку молекулу. Не менш спекулятивна модель будови ДНК була запропонована у 1953 р. Л. Полінгом (лауреат Нобелівської премії, 1954) та Р. Корі. У цій моделі три закручені ланцюги ДНК утворювали довгу спіраль, стрижень якої було представлено фосфатними групами, а підстави розташовувалися зовні від нього. До 1953 М. Вілкінс і Р. Франклін отримали більш чіткі рентгеноструктурні картини ДНК. Їхній аналіз показав повну неспроможність моделей Фарберга, Полінга та Корі. Використовуючи дані Чаргаффа, зіставляючи різні поєднання молекулярних моделей окремих мономерів та дані рентгеноструктурного аналізу, Дж. Вотсон і Ф. Крик у 1953 р. дійшли висновку, що молекула ДНК має бути двотяжкою спіраллю. Правила Чаргаффа різко обмежили кількість можливих упорядкованих поєднань основ у запропонованій моделі ДНК; вони підказали Уотсону і Крику, що у молекулі ДНК має бути специфічне спарювання основ - аденіну з тиміном, а гуаніну з цитозином. Іншими словами аденіну в одному ланцюзі ДНК завжди суворо відповідає тиміну в іншому ланцюзі, а гуаніну в одному ланцюзі обов'язково відповідає цитозин в інший. Тим самим Уотсон і Крик вперше сформулювали виняткову важливість принцип комплементарної будови ДНК, згідно з яким один ланцюг ДНК доповнює іншу, тобто послідовність підстав одного ланцюга однозначно визначає послідовність підстав в іншому (комплементарному) ланцюгу. Стало очевидно, що у самій структурі ДНК закладено потенційну можливість її точного відтворення. Ця модель будови ДНК нині є загальновизнаною. За розшифровку структури ДНК Крику, Вотсону та Вілкінсу в 1962 р. було присуджено Нобелівську премію.

    Слід зазначити, що ідея про механізм точного відтворення макромолекул та передачу спадкової інформації зародилася в нашій країні. У 1927 р. Н. К. Кольцов висловив припущення, що при розмноженні клітин відбувається репродукція молекул шляхом точного автокаталітичного відтворення наявних материнських молекул. Щоправда, тоді Кольцов наділяв цим властивістю не молекули ДНК, а молекули білкової природи, про функціональному значенні яких тоді нічого було відомо. Проте сама думка про автокаталітичне відтворення макромолекул і механізм передачі спадкових властивостей виявилася пророчою: вона стала керівною ідеєю сучасної молекулярної біології.

    Проведені в лабораторії А. Н. Білозерського А. С. Спіріним, Г. Н. Зайцевою, Б. Ф. Ванюшиним, С. О. Урисон, А. С. Антоновим та іншими багаторічними дослідженнями (1957-1974) складу ДНК у самих різноманітних організмів повністю підтвердили закономірності, виявлені Чаргаффом, та повну відповідність з молекулярною моделлю будови ДНК, запропонованою Вотсоном та Криком. Ці дослідження показали, що ДНК різних бактерій, грибів, водоростей, актиноміцетів, вищих рослин, безхребетних і хребетних мають специфічність складу. Особливо різко відмінності у складі (змісті АТ-пар основ) виражені у мікроорганізмів, виявляючись важливою таксономічною ознакою. У вищих рослин та тварин видові варіації у складі ДНК виражені значно слабкіше. Але це зовсім не означає, що ДНК у них менш специфічна. Крім складу підстав специфічність переважно визначається їх послідовністю в ланцюгах ДНК.

    Поряд із звичайними основами у складі ДНК та РНК були виявлені додаткові азотисті основи. Так, у складі ДНК рослин і тварин Г. Уайт (1950) знайшов 5-метилцитозин, а Д. Данн та Дж. Сміт (1958) виявили в деяких ДНК метильований аденін. Довгий час метилцитозин вважався характерною рисою генетичного матеріалу вищих організмів. У 1968 р. А. Н. Білозерський, Б. Ф. Ванюшин та Н. А. Кокуріна встановили, що він може зустрічатися також і в ДНК бактерій.

    У 1964 р. М. Голд та Дж. Хурвітц відкрили новий клас ферментів, що здійснюють природну модифікацію ДНК – її метилювання. Після цього відкриття стало ясно, що мінорні (що містяться в малих кількостях) основи виникають вже на готовому полінуклеотидному ланцюзі ДНК у результаті специфічного метилювання залишків цитозину та аденіну в особливих послідовностях. Зокрема, за даними Б. Ф. Ванюшина, Я. І. Бур'янова та А. Н. Білозерського (1969) метилювання аденіну в ДНК кишкової палички може відбуватися в термінуючих кодонах. За даними А. Н. Білозерського та співробітників (1968 – 1970), а також М. Мезельсона (США) та В. Арбера (Швейцарія) (1965 – 1969) метилювання надає молекулам ДНК унікальні індивідуальні риси та у поєднанні з дією специфічних нуклеаз є частиною складного механізму, який здійснює контроль за синтезом ДНК у клітині. Іншими словами, характер метилювання тієї чи іншої ДНК визначає питання про те, чи вона може розмножуватися в даній клітині.

    Практично в той же час почалося виділення та інтенсивне вивчення ДНК-метилаз та рестрикуючих ендонуклеаз; у 1969 – 1975 рр. встановлені нуклеотидні послідовності, відомі в ДНК деякими з цих ферментів (X. Бойєр, X. Сміт, С. Лін, К. Муррей). При гідролізі різних ДНК рестрицирующим ферментом вивіваються досить великі фрагменти з однаковими "липкими" кінцями. Це дає можливість як аналізувати структуру генів, як це зроблено в невеликих вірусів (Д. Натанс, З. Адлер, 1973 - 1975), а й конструювати різні геноми. З відкриттям цих специфічних ферментів рестрикції генетична інженерія стала відчутною реальністю. Вбудовані у невеликі плазмідні ДНК гени різного походження вже легко вводять у різні клітини. Так, отримано новий тип біологічно активних плазмід, що дають стійкість до деяких антибіотиків (С. Коен, 1973), введені рибосомальні гени жаби та дрозофіли в плазміди кишкової палички (Дж. Морроу, 1974; X. Бойєр, Д. Хогнесс, Р. , 1974 – 1975). Таким чином, відкриті реальні шляхи для отримання принципово нових організмів шляхом введення та вбудовування у їх генофонд різноманітних генів. Це відкриття може бути спрямоване на благо людства.

    У 1952 р. Г. Уайт та С. Коен виявили, що в ДНК Т-парних фагів міститься незвичайна основа – 5-оксиметилцитозин. Пізніше з робіт Е. Волькіна та Р. Сінсхеймера (1954) та Коена (1956) стало відомо, що залишки оксиметилцитозину можуть бути повністю або частково глюкозидовані, внаслідок чого молекула фагової ДНК виявляється захищеною від гідролітичної дії нуклеаз.

    На початку 50-х років із робіт Д. Данна та Дж. Сміта (Англія), С. Заменхофа (США) та А. Вакера (ФРН) стало відомо, що в ДНК можуть включатися багато штучних аналогів основ, заміщаючи іноді до 50% тиміну. Як правило, ці заміщення призводять до помилок при реплікації, транскрипції ДНК та трансляції та до появи мутантів. Так, Дж. Мармур (1962) встановив, що у ДНК деяких фагів замість тиміну міститься оксиметилурацил. У 1963 р. І. Такахаші та Дж. Мармур виявили, що в ДНК одного з фагів замість тиміну міститься урацил. Таким чином, звалився ще один принцип, за яким раніше поділяли нуклеїнові кислоти. З часів робіт П. Левіна вважалося, що характерною ознакою ДНК є тимін, а РНК – урацил. Стало ясно, що ця ознака не завжди надійна, і важливою відмінністю хімічної природи двох типів нуклеїнових кислот, як це представляється на сьогоднішній день, є лише характер вуглеводного компонента.

    Під час вивчення фагів було розкрито багато незвичайних ознак організації нуклеїнових кислот. З 1953 р. вважалося, що це ДНК є двотяжкі лінійні молекули, а РНК - лише однотяжні. Це становище суттєво похитнулося в 1961 р., коли Р. Сінсхеймер виявив, що ДНК фага φ X 174 представлена ​​однотяжкою кільцевою молекулою. Щоправда, потім з'ясувалося, що у такій формі ця ДНК існує лише у вегетативної фагової частинки, а реплікативна форма ДНК цього фага також є двотяжкою. Крім того, дуже несподіваним виявилося, що РНК деяких вірусів може бути двотяжкою. Цей новий тип макромолекулярної організації РНК було виявлено у 1962 р. П. Гоматосом, І. Таммом та іншими дослідниками у деяких вірусів тварин та у вірусу ранової пухлини рослин. Нещодавно В. І. Агол та А. А. Богданов (1970) встановили, що крім лінійних молекул РНК існують також замкнені або циклічні молекули. Циклічна двотяжка РНК виявлена ​​ними, зокрема, у вірусу енцефаломієлокардиту. Завдяки роботам X. Дево, Л. Тіноко, Т. І. Тихоненко, Е. І. Будовського та інших (1960 – 1974) стали відомі основні риси організації (укладання) генетичного матеріалу у бактеріофагів.

    Наприкінці 50-х років американський вчений П. Доті встановив, що при нагріванні відбувається денатурація ДНК, що супроводжується розривом водневих зв'язків між парами основ та розбіжністю комплементарних ланцюгів. Цей процес носить характер фазового переходу на кшталт "спіраль-клубок" і нагадує плавлення кристалів. Тому процес теплової денатурації ДНК Доті назвав плавленням ДНК. При повільному охолодженні відбувається ренатурацпя молекул, тобто возз'єднання комплементарних половинок.

    Принцип ренатурації в 1960 р. був використаний Дж. Мармуром і К. Шильдкраутом для визначення ступеня "гібридизування" ДНК різних мікроорганізмів. Згодом Е. Болтон та Б. Мак-Карті удосконалили цей прийом, запропонувавши метод так званих ДНК-агарових колонок. Цей метод виявився незамінним у вивченні ступеня гомології нуклеотидної послідовності різних ДНК та з'ясуванні генетичної спорідненості різних організмів. Відкрита Доти денатурація ДНК у поєднанні з описаною Дж. Манделем та А. Херши* (1960) хроматографією на метильованому альбуміні та центрифугуванням у градієнті щільності (метод розроблений у 1957 р. М. Мезельсоном, Ф. Сталем та Д. Виноградом) розділення, виділення та аналізу окремих комплементарних ланцюгів ДНК Так, наприклад, В. Шибальськи (США), використовуючи ці прийоми для поділу ДНК лямбда фага, показав у 1967 - 1969 рр., що генетично активними є обидва ланцюжки фага, а не одна, як це було прийнято рахувати (С. Спігельман, 1961). Слід зазначити, що вперше ідея про генетичну значущість обох ланцюжків ДНК лямбда фага була висловлена ​​в СРСР С. Є. Бреслером (1961).

    * (За роботи з генетики бактерій та вірусів А. Херші спільно з М. Дельбрюком та С. Луріа були удостоєні 1969 р. Нобелівської премії.)

    Для розуміння організації та функціональної активності геному першорядне значення має визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Пошуки методів такого визначення проводять у багатьох лабораторіях світу. У М. Бір зі співробітниками з кінця 50-х років намагається встановити послідовність ДНК за допомогою електронної мікроскопії, але поки що безуспішно. На початку 50-х років з перших робіт Сінсхеймера, Чаргаффа та інших дослідників з ферментативної деградації ДНК стало відомо, що різні нуклеотиди в молекулі ДНК розподілені хоч і нехаотично, але нерівномірно. За даними англійського хіміка К. Бартона (1961), піримідини (їх понад 70%) зосереджені переважно у вигляді відповідних блоків. А. Л. Мазін і Б. Ф. Ванюшин (1968 - 1969) встановили, що різні ДНК мають різний ступінь зблоченості піримідинів і що в ДНК тварин організмів вона помітно зростає в міру переходу від нижчих до вищих. Отже, еволюція організмів відбито у структурі їх геномів. Саме тому для розуміння еволюційного процесу в цілому порівняльне вивчення структури нуклеїнових кислот набуває особливого значення. Аналіз структури біологічно важливих полімерів і насамперед ДНК вкрай важливий і для вирішення багатьох приватних питань філогенетики та таксономії.

    Цікаво відзначити, що англійський фізіолог Е. Ланкестер, який вивчав гемоглобіни молюсків, що рівно 100 років тому передбачив ідеї молекулярної біології, писав: "Хімічні відмінності різних видів і пологів тварин і рослин мають таке ж важливе значення для з'ясування історії їх походження, як і відмінності в їхній формі.Якби ми могли чітко встановлювати відмінності в молекулярній організації та функціонуванні організмів, ми змогли б значно краще розібратися у походженні та еволюції різних організмів, ніж на підставі морфологічних спостережень"*. Значимість біохімічних досліджень систематики підкреслював і У. Л. Комаров, який писав, що " основу всіх навіть суто морфологічних ознак, виходячи з яких ми класифікуємо і встановлюємо види, лежать саме біохімічні відмінності " ** .

    * (Е. R. Lankester. Uber das Vorcommen von Haemoglobin in den Muskeln der Mollusken und die Verbreitung desselben in den lebendigen Organismen.- "Pfluger"s Archiv fur die gesammte Physiol., 1871, Bd 4, 319.)

    ** (В. Л. Комаров. Вибрані соч., Т. 1. М.-Л., Вид-во АН СРСР, 1945, стор 331.)

    А. В. Благовіщенський і С. Л. Іванов ще в 20-х роках зробили перші в нашій країні кроки з'ясування деяких питань еволюції та систематики організмів на основі порівняльного аналізу їхнього біохімічного складу (див. гл. 2). Порівняльний аналізструктури білків і нуклеїнових кислот в даний час стає все більш відчутною підмогою для систематиків (див. Розділ 21). Цей метод молекулярної біології дозволяє як уточнити становище окремих видів у системі, а й змушує по-новому подивитись самі принципи класифікації організмів, котрий іноді переглянути всю систему загалом, як і сталося, наприклад, із систематикою мікроорганізмів. Безсумнівно, й у майбутньому аналіз структури геному займатиме центральне місце у хемосистематиці організмів.

    Велике значення для становлення молекулярної біології мало розшифрування механізмів реплікації ДНК та транскрипції (див. розділ 24).

    Біосинтез білка

    Важливе зрушення у вирішенні проблеми біосинтезу білка пов'язане з успіхами у вивченні нуклеїнових кислот. У 1941 р. Т. Касперсон (Швеція) та 1942 р. Ж. Браше (Бельгія) звернули увагу на те, що в тканинах з активним білковим синтезом міститься підвищена кількість РНК. Вони дійшли висновку, що рибонуклеїнові кислоти грають визначальну роль синтезі білка. У 1953 р. Е. Гейл і Д. Фокс, начебто, отримали прямі докази безпосередньої участі РНК у біосинтезі білка: за їхніми даними, рибонуклеаза значно пригнічувала включення амінокислот у лізатах бактеріальних клітин. Аналогічні дані були отримані В. Олфрі, М. Делі та А. Мирським (1953) на гомогенатах печінки. Пізніше Еге. Гейл відмовився від висловленої їм правильної ідеї про провідну роль РНК у білковому синтезі, помилково вважаючи, що активація білкового синтезу в безклітинній системі відбувалася під впливом якоїсь іншої речовини невідомої природи. У 1954 р. П. Замітник, Д. Літлфілд, Р. Б. Хесін-Лур'є та інші виявили, що найбільш активне включення амінокислот відбувається у багатих РНК фракціях субклітинних частинок – мікросом. П. Замечник та Е. Келлер (1953 – 1954) виявили, що включення амінокислот помітно посилювалося у присутності надосадової фракції в умовах регенерації АТФ. П. Сікевіц (1952) та М. Хогланд (1956) виділили з надосадової рідини білкову фракцію (рН 5 фракція), яка була відповідальною за різке стимулювання включення амінокислот у мікросомах. Поряд із білками в надосадовій рідині було виявлено особливий клас низькомолекулярних РНК, які тепер називають транспортними РНК (тРНК). У 1958 р. Хогланд і Помічник, і навіть П. Берг, Р. Світ і Ф. Аллен та ще дослідники виявили, що з активації кожної амінокислоти необхідний свій спеціальний фермент, АТФ і специфічна тРНК. Стало ясно, що тРНК виконують виключно функцію адаптерів, тобто пристосувань, які знаходять на нуклеїновій матриці (іРНК) місце відповідної амінокислоті у білковій молекулі, що формується. Ці дослідження повністю підтвердили адапторну гіпотезу Ф. Крику (1957), що передбачала існування в клітині полінуклеотидних адапторів, необхідних для правильного розташування амінокислотних залишків білка, що синтезується, на нуклеїновій матриці. Вже набагато пізніше французький вчений Ф. Шапвіль (1962) в лабораторії Ф. Ліпмана (Нобелевська премія, 1953) у США дуже дотепно і однозначно показав, що місце розташування амінокислоти в білковій молекулі, що синтезується, повністю визначається тією специфічною тРНК, до якої вона приєднана. Адапторна гіпотеза Крику була розвинена у роботах Хогланда та Помічника.

    До 1958 стали відомі такі основні етапи білкового синтезу: 1) активація амінокислоти специфічним ферментом з "рН 5 фракції" в присутності АТФ з утворенням аміноациладенілату; 2) приєднання активованої амінокислоти до специфічної тРНК із вивільненням аденозинмонофосфату (АМФ); 3) зв'язування аміноацил-тРНК (тРНК, навантажена амінокислотою) з мікросомами та включення амінокислот у білок з вивільненням тРНК. Хогланд (1958) зазначив, що на останньому етапі білкового синтезу необхідний гуанозінтріфосфат (ГТФ).

    Транспортні РНК та синтез гена

    Після виявлення тРНК почалися активні пошуки їх фракціонування та визначення нуклеотидної послідовності. Найбільших успіхів досяг американський біохімік Р. Холлі. У 1965 р. він встановив структуру аланінової тРНК із дріжджів. За допомогою рибонуклеаз (гуанілова РНК-аза та панкреатична РНК-аза) Холлі розділив молекулу нуклеїнової кислоти на кілька фрагментів, визначив у кожному окремо нуклеотидну послідовність і потім реконструював послідовність всієї молекули аланінової тРНК. Цей шлях аналізу нуклеотидної послідовності отримав назву блочного методу. Заслуга Холлі полягала головним чином тому, що він навчився розділяти молекулу РНК як на дрібні шматки, як і багато хто й до нього, а й великі фрагменти (четвертинки і половинки). Це і дало можливість правильно зібрати окремі маленькі шматки воєдино і цим відтворити повну нуклеотидну послідовність всієї молекули тРНК (Нобелевская премія, 1968).

    Цей прийом відразу ж був прийнятий на озброєння у багатьох лабораторіях світу. Протягом наступних двох років у СРСР і там була розшифрована первинна структура відразу кількох тРНК. А. А. Баєв (1967) та співробітники вперше встановили послідовність нуклеотидів у дріжджовій валіновій тРНК. До теперішнього часу вивчено вже понад десяток різних індивідуальних тРНК. Своєрідний рекорд у визначенні нуклеотидної послідовності встановлено у Кембриджі Ф. Сенгером та Г. Браунлі. Ці дослідники розробили напрочуд витончений метод поділу олігонуклеотидів і встановили послідовність так званої 5 S ​​(рибосомної) РНК із клітин кишкової палички (1968). Ця РНК складається з 120 нуклеотидних залишків і, на відміну від тРНК, не містить додаткових мінорних основ, які помітно полегшують аналіз нуклеотидної послідовності, служачи унікальними орієнтирами окремих фрагментів молекули. В даний час завдяки використанню методу Сенгера та Браунлі успішно просувається робота з вивчення послідовності довгих рибосомних РНК та деяких вірусних РНК у лабораторії Ж. Ебеля (Франція) та інших дослідників.

    А. А. Баєв та співробітники (1967) виявили, що розрізана навпіл валінова тРНК відновлює свою макромолекулярну структуру в розчині і, незважаючи на дефект у первинній структурі, має функціональну активність вихідної (нативної) молекули. Цей підхід – реконструкція розрізаної макромолекули після видалення певних фрагментів – виявився дуже перспективним. Він широко використовується зараз з'ясування функціональної ролі окремих ділянок тих чи інших тРНК.

    В останні роки досягнуто великого успіху в отриманні кристалічних препаратів індивідуальних тРНК. Зараз у кількох лабораторіях у США та Англії вдалося закристалізувати вже багато тРНК. Це дозволило досліджувати стуруктуру тРНК з допомогою рентгеноструктурного аналізу. У 1970 р. Р. Бок представив перші рентгенограми та тривимірні моделі кількох тРНК, створені ним у Вісконсінському університеті. Ці моделі допомагають визначити локалізацію окремих функціонально активних ділянок у тРНК та зрозуміти основні засади функціонування цих молекул.

    Найважливіше значення для розкриття механізму синтезу білка та вирішення проблеми специфічності цього процесу мало розшифровка природи генетичного коду (див. розділ 24), яку без перебільшення можна розглядати як провідне завоювання природознавства XX ст.

    Розкриття Р. Холлі первинної структури тРНК дало поштовх роботам Г. Корани* (США) щодо синтезу олігонуклеотидів і направило їх на шлях синтезу певної біологічної структури – молекули ДНК, що кодує аланінову тРНК. Зроблені Кораною майже 15 років тому перші кроки з хімічного синтезу коротких олигонуклеотидов завершилися 1970 р. вперше здійсненим синтезом гена. Корана та його співробітники спочатку з окремих нуклеотидів синтезували хімічним шляхом короткі фрагменти завдовжки 8-12 нуклеотидних залишків. Ці фрагменти із заданою нуклеотидною послідовністю утворювали спонтанно двотяжкі комплементарні шматки з перекриттям 4 - 5 нуклеотидів. Потім ці готові шматки в потрібному порядку послідовно з'єднували кінець в кінець за допомогою ферменту ДНК-лігази. Таким чином, на відміну від реплікації молекул ДНК, за А. Корнбергом** (див. розділ 24), Корані вдалося заново створити молекулу природної двотяжкової ДНК за заздалегідь наміченою програмою відповідно до послідовності тРНК, описаної Холлі. Аналогічним чином зараз ведуться роботи з синтезу інших генів (М. Н. Колосов, 3. А. Шабарова, Д. Г. Кнорре, 1970 – 1975).

    * (За дослідження генетичного коду Г. Корані та М. Ніренбергу була присуджена у 1968 р. Нобелівська премія.)

    ** (За відкриття полімерази та синтез ДНК А. Корнбергу, а за синтез РНК С. Очоа у 1959 р. було присуджено Нобелівську премію.)

    Мікросоми, рибосоми, трансляція

    У 1950-х років вважалося, що центром білкового синтезу у клітині є мікросоми. Термін мікросоми був вперше введений у 1949 р. А. Клодом для позначення фракції дрібних гранул. Пізніше з'ясувалося, що за білковий синтез відповідальна не вся фракція мікросом, що складається з мембран та гранул, а лише дрібні рибонуклеопротеїдні частки. Ці частки 1958 р. були названі Р. Робертсом рибосомами.

    Класичні дослідження бактеріальних рибосом були проведені А. Тисьєром та Дж. Уотсоном у 1958 – 1959 рр. Бактеріальні рибосоми виявилися дещо дрібнішими за рослинні та тваринні. Дж. Літлтон (1960), М. Кларк (1964) та Е. Н. Светайло (1966) показали, що рибосоми хлоропластів вищих рослин та мітохондрій належать до бактеріального типу. А. Тисьєр та інші (1958) виявили, що рибосоми дисоціюють на дві нерівні субодиниці, що містять по одній молекулі РНК. Наприкінці 50-х років вважалося, що кожна молекула рибосомної РНК складається з кількох коротких фрагментів. Проте А. С. Спірін у 1960 р. вперше показав, що РНК у субчастинках представлені безперервною молекулою. Д. Уоллер (1960), розділивши рибосомні білки за допомогою електрофорезу в крохмальному гелі, встановив, що вони гетерогенні. Спочатку багато хто сумнівався в даних Уоллера, оскільки здавалося, що білок рибосоми повинен бути строго гомогенним, як, наприклад, білок ВТМ. В даний час в результаті досліджень Д. Уоллер, Р. Траута, П. Трауба та інших біохіміків стало відомо, що до складу власне рибосомних частинок входить більше 50 абсолютно різних за структурою білків. А. С. Спіріну в 1963 р. вдалося вперше розгорнути рибосомні субчастинки і показати, що рибосоми є компактно скрученим рибонуклеопротеїдним тяжом, який в певних умовах може розгортатися. У 1967 – 1968 рр. М. Номура повністю реконструював біологічно активну субчастицю з рибосомної РНК та білка і навіть отримав такі рибосоми, у яких білок та РНК належали різним мікроорганізмам.

    До сьогодні незрозуміла роль рибосомної РНК. Передбачається, що вона є тією унікальною специфічною матрицею, на якій при формуванні рибосомної частки знаходить строго певне місце кожен із численних рибосомних білків (А. С. Спірін, 1968).

    А. Річ (1962) виявив агрегати з кількох рибосом, з'єднаних між собою ниткою іРНК. Ці комплекси було названо полісомами. Виявлення полісом дозволило Річу і Уотсону (1963) висловити припущення, що синтез поліпептидного ланцюга відбувається на рибосомі, яка просувається по ланцюжку іРНК. У міру просування рибосоми по ланцюжку іРНК в частинці відбувається зчитування інформації та утворення поліпептидного ланцюга білка, а нові рибосоми по черзі приєднуються до прочитаного кінця іРНК, що вивільняється. З даних Річа та Уотсона випливало, що значення полісом у клітині полягає у масовій продукції білка шляхом послідовного прочитування матриці відразу декількома рибосомами.

    В результаті досліджень М. Ніренберга, С. Очоа, Ф. Ліпмана, Г. Корани та інших у 1963 – 1970 рр. в. стало відомо, що поряд з іРНК, рибосомами, АТФ та аміноацил-тРНК у процесі трансляції бере участь велика кількість різноманітних факторів, а сам процес трансляції може бути умовно поділений на три етапи – ініціацію, власне трансляцію та термінацію.

    Ініціація трансляції означає синтез першого пептидного зв'язку в комплексі рибосома – матричний полінуклеотид – аміноацил-тРНК. Таку ініціаторну активність має не всяка аміноацил-тРНК, а формілметіоніл-тРНК. Ця речовина була вперше виділена у 1964 р. Ф. Сенгером та К. Маркером. С. Бретчер і К. Маркер (1966) показали, що ініціаторна функція формілметіоніл-тРНК обумовлена ​​її підвищеною спорідненістю до пептидильного центру рибосоми. Для початку трансляції дуже важливими є також деякі білкові фактори ініціації, які були виділені в лабораторіях С. Очоа, Ф. Гро та інших дослідницьких центрах. Після утворення першого пептидного зв'язку в рибосомі починається власне трансляція, тобто послідовне приєднання аміноацильного залишку до С-кінця поліпептиду. Багато деталей процесу трансляції вивчили К. Монро та Дж. Бішоп (Англія), І. Рихлік та Ф. Шорм (ЧССР), Ф. Ліпман, М. Бретчер, В. Гілберт (США) та інші дослідники. У 1968 р. А. С. Спірін для пояснення механізму роботи рибосоми запропонував оригінальну гіпотезу. Привідним механізмом, що забезпечує всі просторові переміщення тРНК та іРНК під час трансляції, є періодичне розмикання та змикання субчастинок рибосоми. Закінчення трансляції закодовано в матриці, що зчитується, яка містить термінуючі кодони. Як показав С. Бреннер (1965 – 1967), такими кодонами є триплети УАА, УАГ та УГА. М. Капеччі (1967) виявив також спеціальні білкові фактори термінації. А. С. Спіріним та Л. П. Гавриловою описаний так званий "неферментативний" синтез білка в рибосомах (1972 - 1975) без участі білкових факторів. Це відкриття важливе для розуміння походження та еволюції біосинтезу білка.

    Регуляція активності генів та білків

    Після проблеми специфічності білкового синтезу першому місці у молекулярної біології виявилася проблема регуляції синтезу білків, чи, що саме, регуляції активності генів.

    Функціональна нерівнозначність клітин та пов'язані з нею репресія та активація генів давно привертали увагу генетиків, але досі реальний механізм контролю генної активності залишався невідомим.

    Перші спроби пояснити регуляторну активність генів пов'язані з вивченням гістонних білків. Ще подружжя Стедман на початку 40-х років XX ст. висловлювали думку, що саме гістони можуть грати у цьому явищі основну роль. Надалі вони отримали перші чіткі дані про відмінності у хімічній природі гістонних білків. Нині кількість фактів, які свідчать користь цієї гіпотези, з кожним роком дедалі більше зростає.

    * (Е. Stedman, E. Stedman. The basic proteins of cell nuclei.- Phylosoph. Trans. Roy. Soc. London, 1951, v. 235, 565 – 595.)

    У той самий час накопичується дедалі більше даних, які говорять у тому, що регуляція генної активності - набагато складніший процес, ніж просте взаємодію ділянок генів з молекулами гістонних білків. У 1960 – 1962 рр. в лабораторії Р. Б. Хесина-Лур'є було з'ясовано, що гени фагів починають зчитуватися неодночасно: гени фага Т2 можна поділити на ранні, функціонування яких відбувалося в перші хвилини зараження бактеріальної клітини, і пізні, що починали синтезувати іРНК після завершення ранніх генів.

    У 1961 р. французькі біохіміки Ф. Жакоб і Ж. Моно запропонували схему регулювання активності генів, яка зіграла виняткову роль у розумінні регуляторних механізмів клітини взагалі. Згідно зі схемою Жакоба і Моно, у ДНК крім структурних (інформаційних) генів є ще гени-регулятори та гени-оператори. Ген-регулятор кодує синтез специфічної речовини - репресора, який може приєднуватись як до індуктора, так і до гена-оператора. Ген-оператор зчеплений зі структурними генами, а ген-регулятор перебуває у певному віддаленні них. Якщо в середовищі немає індуктора, наприклад, лактози, то синтезований геном-регулятором репресор зв'язується з геном-оператором і, блокуючи його, вимикає роботу всього оперону (блок структурних генів разом з керуючим ними оператором). Утворення ферменту цих умовах немає. Якщо ж середовищі з'являється індуктор (лактоза), то продукт гена-регулятора - репресор - зв'язується з лактозою і знімає блок з гена-оператора. В цьому випадку стає можливою робота структурного гена, що кодує синтез ферменту, і фермент (лактоза) утворюється в середовищі.

    На думку Жакоба і Моно, ця схема регуляції застосовна всім адаптивним ферментам і може бути як при репресії, коли освіту ферменту придушується надлишком продукту реакції, і при індукції, коли внесення субстрату викликає синтез ферменту. За дослідження регулювання активності генів Жакоб і Моно були удостоєні в 1965 р. Нобелівської премії.

    Спочатку ця схема здавалася надто надуманою. Однак згодом з'ясувалося, що регуляція генів за цим принципом має місце не лише у бактерій, а й у інших організмів.

    Починаючи з 1960 р. помітне місце в молекулярній біології займають дослідження організації геному і структури хроматину в еукаріотичних організмів (Дж. Боннер, Р. Бріттен, В. Олфрі, П. Уокер, Ю. С. Ченцов, І. Б. Збарський та ін.) .) та з регуляції транскрипції (А. Мирський, Г. П. Георгієв, М. Бернстіл, Д. Голл, Р. Цанев, Р. І. Салганік). Довгий час залишалася невідомою та спірною природа репресора. У 1968 р. Пташне (США) показав, що репресором є білок. Він виділив його в лабораторії Дж. Уотсона і виявив, що репресор, дійсно, має спорідненість до індуктора (лактози) і одночасно "пізнає" ген-оператор лак-оперону і специфічно зв'язується з ним.

    В останні 5 - 7 років отримані дані про наявність ще одного керуючого осередку генної активності - промотор. Виявилося, що по сусідству з операторною ділянкою, до якої приєднується продукт, синтезований на ген-регуляторі - білковій речовині репресора, є інша ділянка, яку також слід віднести до членів регуляторної системи генної активності. До цієї ділянки приєднується білкова молекула ферменту РНК-полімерази. У промоторному ділянці має відбутися взаємне впізнавання унікальної послідовності нуклеотидів у ДНК та специфічної конфігурації білка РНК-полімерази. Від ефективності впізнавання залежатиме здійснення процесу зчитування генетичної інформації з даною послідовністю генів оперону, що примикає до промотору.

    Крім описаної Жакобом і Моно схеми, у клітині існують інші механізми регуляції генів. Ф. Жакоб та С. Бреннер (1963) встановили, що регуляція реплікації бактеріальної ДНК певним чином контролюється клітинною мембраною. Досліди Жакоба (1954) з індукції різних профагів переконливо показали, що під впливом різних мутагенних факторів у клітині лізогенних бактерій починається вибіркова реплікація гена профагу, а реплікація геному господаря блокується. У 1970 р. Ф. Белл повідомив у тому, що у цитоплазму з ядра можуть переходити невеликі молекули ДНК і там транскрибироваться.

    Таким чином, регуляція активності генів може здійснюватися на рівні реплікації, транскрипції та трансляції.

    Значних успіхів досягнуто у вивченні регуляції як синтезу ферментів, а й їх активності. На явища регуляції активності ферментів у клітині вказували ще у 50-х роках А. Новік та Л. Сциллард. Г. Умбаргер (1956) встановив, що у клітині існує дуже раціональний шлях придушення активності ферменту кінцевим продуктом ланцюга реакцій на кшталт зворотний зв'язок. Як було встановлено Ж. Моно, Ж. Шанже, Ф. Жакобом, А. Парді та іншими дослідниками (1956 – 1960), регуляція активності ферментів може здійснюватися за алостеричним принципом. Фермент або одна з його субодиниць, крім спорідненості до субстрату, має спорідненість з одним з продуктів ланцюга реакцій. Під впливом такого продукту-сигналу фермент змінює свою конформацію, що втрачає активність. В результаті весь ланцюг ферментативних реакцій вимикається на самому початку. На суттєву роль конформаційних змін білка у ферментативних реакціях, а у відомому сенсі і на наявність алостеричного ефекту, вказували Д. Вімен та Р. Вудворд (1952; лауреат Нобелівської премії, 1965).

    Структура та функції білків

    В результаті робіт Т. Осборна, Г. Гофмейстера, А. Гюрбера, Ф. Шульца та багатьох інших наприкінці XIXв. було отримано багато тварин та рослинні білки в кристалічному вигляді. Приблизно в цей час за допомогою різних фізичних методів були встановлені молекулярні ваги деяких білків. Так, в 1891 р. А. Сабанєєв і Н. Александров повідомили, що молекулярна вага овальбуміну становить 14 000; в 1905 р. Е. Рейд встановив, що молекулярна вага гемоглобіну дорівнює 48 000. Полімерна структура білків була розкрита в 1871 р. Г. Глазівець і Д. Габерманом. Ідея про пептидний зв'язок окремих амінокислотних залишків у білках була висловлена ​​Т. Куртіусом (1883). Роботи з хімічної конденсації амінокислот (Е. Шаал, 1871; Г. Шифф, 1897; Л. Бальбіано та Д. Траскіатті, 1900) та синтезу гетерополіпептидів (Е. Фішер, 1902 - 1907, хімічна структура білків.

    Перший кристалічний фермент (уреаза) було отримано 1926 р. Дж. Самнером (Нобелевская премія, 1946), а 1930 р. Дж. Нортроп (Нобелевская премія, 1946) отримав кристалічний пепсин. Після цих робіт стало зрозуміло, що ферменти мають білкову природу. У 1940 р. М. Куніц виділив кристалічну РНК-азу. До 1958 вже було відомо більше 100 кристалічних ферментів і понад 500 ферментів, виділених у некристалічному вигляді. Одержання високоочищених препаратів індивідуальних білків сприяло розшифровці їхньої первинної структури та макромолекулярної організації.

    Велике значення у розвиток молекулярної біології взагалі і генетики людини, особливо, мало відкриття Л. Полингом (1940) ненормального гемоглобіну S, виділеного з еритроцитів людей із тяжкою спадковою хворобою - серповидно-клітинної анемією. У 1955 – 1957 рр. В. Інгрем використовував розроблений Ф. Сенгер метод "відбитків пальців" (плям, утворених окремими пептидами при хроматографії на папері) для аналізу продуктів гідролізу гемоглобіну S лугом і трипсином. У 1961 р. Інгрем повідомив, що гемоглобін S відрізняється від нормального гемоглобіну тільки за природою одного амінокислотного залишку: у нормальному гемоглобіні в сьомому положенні ланцюга знаходиться залишок глютамінової кислоти, а в гемоглобіні S - залишок валіну. Цим повністю підтвердилося (1949) припущення Полінга, що серповидно-клітинна анемія є хворобою молекулярної природи. Спадкова зміна всього одного залишку амінокислоти в кожній половинці макромолекули гемоглобіну призводить до того, що гемоглобін втрачає здатність легко розчинятися при низькій концентрації кисню і починає кристалізуватися, що призводить до порушення структури клітини. Ці дослідження з усією очевидністю показали, що структура білка є суворо певною амінокислотною послідовністю, яка закодована в геномі. Про виняткове значення первинної структури білка у формуванні унікальної біологічно активної конформації макромолекули свідчили роботи К. Анфінсена (1951). Анфінсен показав, що біологічно активна макроструктура панкреатичної рибонуклеази, що втрачається в результаті відновлення, зумовлена ​​амінокислотною послідовністю і може знову виникати спонтанно при окисленні SH-груп залишків цистеїну з утворенням дисульфідних зшивок у строго визначених місцях пептидного ланцюга ферменту.

    До теперішнього часу детально вивчений механізм дії великої кількості ферментів та визначено структуру багатьох білків.

    У 1953 р. Ф. Сенгер встановив амінокислотну послідовність інсуліну. :Цей білок складається з двох поліпептидних ланцюгів, з'єднаних двома дисульфідними зшивками. Один з ланцюгів містить всього 21 амінокислотний залишок, а інший - 30 залишків. На розшифрування будівлі цього порівняно простого білка Сенгер витратив близько 10 років. У 1958 р. за це видатне дослідження йому було присуджено Нобелівську премію. Після створення В. Стейном та С. Муром (1957) автоматичного аналізатора амінокислот, ідентифікація продуктів часткового гідролізу білків значно прискорилася. У 1960 р. Стейн і Мур вже повідомили у тому. що їм вдалося визначити послідовність рибонуклеази, пептидний ланцюжок якого представлений 124 амінокислотними залишками. У тому ж році в лабораторії Г. Шрамма у Тюбінгені (ФРН) Ф. Андерер та інші визначили амінокислотну послідовність у білку ВТМ. Потім амінокислотна послідовність була визначена в міоглобіні (А. Едмунсон) та α- та β-ланцюгах гемоглобіну людини (Г. Браунітцер, Е. Шредер та ін), лізоцимі з білка курячого яйця (Ж. Жолле, Д. Кейфілд). У 1963 р. Ф. Шорм та Б. Кейл (ЧССР) встановили послідовність амінокислот у молекулі хімотрипсиногену. У тому ж році було визначено амінокислотну послідовність трипсиногену (Ф. Шорм, Д. Уолш). У 1965 р. К. Такахаші встановив первинну структуру рибонуклеази Т1. Потім послідовність амінокислот було визначено ще в кількох білків.

    Як відомо, остаточним доказом правильності визначення тієї чи іншої структури є її синтез. У 1969 р. Р. Меріфілд (США) вперше здійснив хімічний синтез панкреатичної рибонуклеази. За допомогою розробленого ним методу синтезу на твердофазовому носії Меріфілд приєднував до ланцюжка одну амінокислоту за іншою відповідно до тієї послідовності, яка була описана Стейном і Муром. В результаті він отримав білок, який за своїми якостями був ідентичний панкреатичній рибонуклеазі А. За розкриття будови рибонуклеази В. Стейну, С. Муру та К. Анфінсену була у 1972 р. присуджено Нобелівську премію. Цей синтез природного білка відкриває грандіозні перспективи, вказуючи на можливість створення будь-яких білків відповідно до запланованої послідовності.

    З рентгеноструктурних досліджень У. Астбері (1933) випливало, що пептидні ланцюги білкових молекул скручені або укладені якимось строго певним чином. Починаючи з цього часу, багато авторів висловлювали різні гіпотези про способи укладання білкових ланцюгів, але до 1951 всі моделі залишалися умоглядними побудовами, що не відповідали експериментальним даним. У 1951 р. Л. Полінг та Р. Корі опублікували серію блискучих робіт, у яких остаточно була сформульована теорія вторинної структури білків – теорія α-спіралі. Поряд з цим стало також відомо, що білки мають ще третинну структуру: α-спіраль пептидного ланцюга може бути певним чином складена, утворюючи досить компактну структуру.

    У 1957 р. Дж. Кендрю та його співробітники вперше запропонували тривимірну модель структури міоглобіну. Ця модель потім уточнювалася протягом декількох років, поки в 1961 не з'явилася підсумкова робота з характеристикою просторової структури цього білка. У 1959 р. М. Перутц та співробітники встановили тривимірну структуру гемоглобіну. На цю роботу дослідники витратили понад 20 років (перші рентгенограми гемоглобіну були отримані Перутцем 1937 р.). Оскільки молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць, то, розшифрувавши його організацію, Перутц цим вперше описав четвертинну структуру білка. За роботи з визначення тривимірної структури білків Кендрю та Перутцу в 1962 р. було присуджено Нобелівську премію.

    Створення перуком просторової моделі структури гемоглобіну дозволило. наблизитися до розуміння механізму функціонування цього білка, який, як відомо, здійснює перенесення кисню у клітинах тварин. Ще 1937 р. Ф. Гауровиц дійшов висновку у тому, що взаємодія гемоглобіну з киснем, повітря має супроводжуватися зміною структури білка. У 60-х роках Перутц та його співробітники виявили помітне зміщення ланцюгів гемоглобіну після його окислення, що викликалося зрушенням атомів заліза внаслідок зв'язування з киснем. На цій основі сформувалися уявлення про "дихання" білкових макромолекул.

    У 1960 р. Д. Філліпс та його співробітники розпочали рентгеноструктурні дослідження молекули лізоциму. До 1967 р. їм більш-менш точно вдалося встановити деталі організації цього білка та локалізацію окремих атомів у його молекулі. Крім цього, Філіпс з'ясував характер приєднання лізоциму до субстрату (тріацетилглюкозаміну). Це дозволило відтворити механізм цього ферменту. Таким чином, знання первинної структури та макромолекулярної організації дало змогу не лише встановити природу активних центрів багатьох ферментів, а й повністю розкрити механізм функціонування цих макромолекул.

    Використання методів електронної мікроскопії допомогло розкрити принципи макромолекулярної організації таких складних білкових утворень, як нитки колагену, фібриногену, скорочувальних фібрил м'язів та ін. Наприкінці 50-х років було запропоновано моделі м'язового скорочувального апарату. Виняткове значення розуміння механізму м'язового скорочення мало відкриття У. А. Енгельгардтом і М. М. Любимової (1939) АТФ-азной активності міозину. Це означало, що в основі акта м'язового скорочення лежить зміна фізико-хімічних властивостей та макромолекулярної організації скоротливого білка під впливом аденозинтрифосфорної кислоти (див. розділ 11).

    Для розуміння принципів складання біологічних структур важливе значення мали вірусологічні дослідження (див. Розділ 25).

    Невирішені проблеми

    Основні успіхи у сучасній молекулярній біології досягнуто переважно у результаті вивчення нуклеїнових кислот. Проте навіть у цій галузі ще далеко не всі проблеми вирішені. Великих зусиль вимагатиме, зокрема, розшифровка всієї нуклеотидної послідовності геному. Ця проблема у свою чергу нерозривно пов'язана з проблемою гетерогенності ДНК і вимагає розробки нових досконалих методів фракціонування та виділення індивідуальних молекул із сумарного генетичного матеріалу клітини.

    До цих пір зусилля в основному були зосереджені на окремому вивченні білків та нуклеїнових кислот. У клітині ці біополімери нерозривно пов'язані один з одним і функціонують головним чином у формі нуклеопротеїдів. Тому зараз з особливою гостротою виявилася необхідність вивчення взаємодії білків та нуклеїнових кислот. На перший план висувається проблема впізнавання білками певних ділянок нуклеїнових кислот. Вже намітилися кроки до вивчення такої взаємодії цих біополімерів, без якого немислимо повне розуміння структури та функцій хромосом, рибосом та інших структур. Без цього неможливо також усвідомити регулювання активності генів і остаточно розшифрувати принципи роботи білоксинтезуючих механізмів. Після робіт Жакоба та Моно з'явилися деякі нові дані про регуляторне значення мембран у синтезі ядерного матеріалу. Це ставить завдання глибшого дослідження ролі мембран у регуляції реплікації ДНК. У цілому нині проблема регуляції активності генів і клітинної активності взагалі стала однією з найважливіших проблем сучасної молекулярної біології.

    Сучасний стан біофізики

    У зв'язку з проблемами молекулярної біології йшов розвиток біофізики. Інтерес до цієї галузі біології стимулювався, з одного боку, необхідністю всебічного вивчення впливу на організм різноманітних випромінювань, з іншого - потребою дослідження фізичних і фізико-хімічних основ життєвих явищ, що протікають на молекулярному рівні.

    Отримання точних відомостей про молекулярні структури і процесах, що в них відбуваються, стало можливим в результаті застосування нових тонких фізико-хімічних методів. На основі досягнень електрохімії вдалося вдосконалити метод вимірювання біоелектричних потенціалів, застосувавши іонно-виборчі електроди (Г. Ейзенман, Б. П. Нікольський, Кхурі, 50 – 60-і роки). Дедалі ширше входить у практику інфрачервона спектроскопія (з використанням лазерних пристроїв), що дозволяє досліджувати конформаційні зміни білків (І. Плотніков, 1940). Цінні відомості дає також метод електронного парамагнітного резонансу (Е. К. Завойський, 1944) та біохемолюмінесцентний метод (Б. Н. Тарусов та ін., 1960), які дозволяють, зокрема, судити про транспорт електронів при окисних процесах.

    До 50-х років біофізика завойовує міцне становище. Виникає потреба у підготовці кваліфікованих спеціалістів. Якщо у 1911 р. у Європі лише в університеті м. Печ, в Угорщині, була кафедра біофізики, то до 1973 р. такі кафедри існують майже у всіх великих університетах.

    У 1960 р. було організовано Міжнародне товариство біофізиків. Торішнього серпня 1961 р. відбувся перший Міжнародний біофізичний конгрес у Стокгольмі. Другий конгрес був проведений у 1965 р. у Парижі, третій – у 1969 р. у Бостоні, четвертий – у 1972 р. у Москві.

    У біофізиці зберігається чітке розмежування між двома різними за змістом напрямками – молекулярною біофізикою та клітинною біофізикою. Це розмежування отримує й організаційний вираз: створюються окремі кафедри цих двох напрямів біофізики. У Московському університеті перша кафедра біофізики була створена в 1953 р. на біолого-грунтовому факультеті, дещо пізніше виникла кафедра біофізики на фізичному факультеті. За таким же принципом організовувалися кафедри у багатьох інших університетах.

    Молекулярна біофізика

    В останні роки все більше зміцнювався зв'язок молекулярної біофізики з молекулярною біологією, і зараз іноді буває важко визначити, де проходить межа розділу між ними. У генеральному наступі на проблему спадкової інформації така кооперація біофізики з молекулярною біологією неминуча.

    Головним напрямом у дослідницькій роботі є вивчення фізики нуклеїнових кислот – ДНК та РНК. Застосування зазначених вище методів і насамперед рентгеноструктурного аналізу сприяло розшифровці молекулярної структури нуклеїнових кислот. В даний час ведуться інтенсивні дослідження з вивчення поведінки цих кислот у розчинах. Особлива увага приділяється при цьому конформаційним переходам "спіраль-клубок", що вивчаються щодо змін в'язкості, оптичних та електричних показників. У зв'язку з вивченням механізмів мутагенезу розвиваються дослідження щодо вивчення дії іонізуючої радіації на поведінку нуклеїнових кислот у розчинах, а також дії радіації на нуклеїнові кислоти вірусів та фагів. Всебічного аналізу піддавався вплив ультрафіолетового випромінювання, деякі спектральні ділянки якого добре поглинаються нуклеїновими кислотами. Велику питому вагу в таких дослідженнях займає виявлення активних радикалів нуклеїнових кислот і білків методом електронного парамагнітного резонансу. Із застосуванням цього пов'язано виникнення цілого самостійного напрями.

    Проблема кодування інформації ДНК та РНК та її передачі при синтезі білка давно цікавила молекулярну біофізику, і фізики неодноразово висловлювали з цього приводу ті чи інші міркування (Е. Шредінгер, Г. Гамов). Розшифровка генетичного коду викликала численні теоретичні та експериментальні дослідження по структурі спіралі ДНК, механізму ковзання та закручування її ниток, вивчення фізичних сил, що беруть участь у даних процесах.

    Значну допомогу молекулярна біофізика надає молекулярної біології у вивченні структури білкових молекул з допомогою рентгеноструктурного аналізу, вперше застосованого 1930 р. Дж. Берналом. Саме в результаті використання фізичних методів у поєднанні з біохімічними (ферментативні методи) було розкрито молекулярну конформацію та послідовність розташування амінокислот у ряді білків.

    Сучасні електронно-мікроскопічні дослідження, що виявили наявність у клітинах та її органоїдах складних мембранних систем, стимулювали спроби зрозуміти їхню молекулярну будову (див. глави 10 та 11). Вивчається прижиттєво хімічний склад мембран та, зокрема, властивості їх ліпідів. Було з'ясовано, що останні здатні до переокислення та неферментативних реакцій ланцюгового окиснення (Ю. А. Володимиров та Ф. Ф. Литвин, 1959; Б. Н. Тарусов та ін., 1960; І. І. Іванов, 1967), що призводить до порушення мембранних функцій. Для вивчення складу мембран стали користуватися також методами математичного моделювання (В. Ц. Пресман, 1964 – 1968; М. М. Шемякін, 1967; Ю. А. Овчинников, 1972).

    Клітинна біофізика

    Знаменною подією в історії біофізики стало формування в 50-х роках чітких уявлень про термодинаміку біологічних процесів, внаслідок чого остаточно відпали припущення про можливість самостійного утворення енергії в живих клітинах всупереч другому закону термодинаміки. Розуміння дії цього закону в біологічних системах пов'язане із запровадженням бельгійським ученим І. Пригожиним (1945) * у біологічну термодинаміку поняття відкритих систем, що обмінюються із зовнішнім середовищем енергією та матерією. Пригожин показав, що позитивна ентропія утворюється в живих клітинах при робочих процесах відповідно до другого закону термодинаміки. Введені ним рівняння визначили умови, у яких виникає так зване стаціонарне стан (раніше його називали також динамічним рівновагою), у якому кількість вільної енергії (негентропії), що надходить у клітини з їжею, компенсує її витрата, а позитивна ентропія виводиться. Це відкриття підкріпило загальнобіологічну ідею про нерозривний зв'язок зовнішнього та внутрішнього середовища клітин. Воно поклало початок реальному вивченню термодинаміки живих систем, у тому числі методом моделювання (А. Бертон, 1939; А. Г. Пасинський, 1967).

    * (Загальну теоріювідкритих систем вперше висунув Л. Берталанфі у 1932 р.)

    Відповідно до основного принципу біотермодинаміки, необхідною умовою існування життя виявляється стаціонарність у розвитку її біохімічних процесів, для здійснення якої потрібна координація швидкостей численних реакцій обміну речовин. На основі нової біофізичної термодинаміки виник напрям, що виділяє зовнішні та внутрішні фактори, які забезпечують цю координацію реакцій та роблять її стійкою. За останні два десятиліття виявлено велику роль у підтримці стаціонарного стану системи інгібіторів і особливо антиоксидантів (Б. Н. Тарусов та А. І. Журавльов, 1954, 1958). Встановлено, що надійність стаціонарного розвитку пов'язана з факторами зовнішнього середовища (температурою) та фізико-хімічними властивостямисередовище клітин.

    Сучасні принципи біотермодинаміки дозволили надати фізико-хімічне тлумачення механізму адаптації. За нашими даними, пристосування до умов зовнішнього середовища може відбуватися тільки в тому випадку, якщо за їх зміни організм здатний встановити стаціонарність у розвитку біо хімічних реакцій(Б. Н. Тарусов, 1974). Постало питання розробці нових методів, які б оцінювати стаціонарний стан прижиттєво і прогнозувати його можливі порушення. Велику користь обіцяє впровадження в біотермодинаміки та дослідження процесів біологічної адаптації кібернетичних принципів саморегулівних систем. Стало ясно, що для вирішення питання про стійкість стаціонарного стану важливий облік так званих факторів, що обурюють, до яких відносяться, зокрема, неферментативні реакції окислення ліпідів. Останнім часом дедалі більше розширюються дослідження процесів переокислення в ліпідних фазах живих клітин та наростання активних радикальних продуктів, що порушують регуляторні функції мембран. Джерелом інформації про ці процеси служить як виявлення активних перекисних радикалів, так і перекисних сполук біоліпідів (А. Таппель, 1965; І. І. Іванов, 1965; Є. Б. Бурлакова, 1967 та інші). Для виявлення радикалів використовують біохемолюмінесценцію, що виникає у ліпідах живих клітин при їх рекомбінації.

    На основі фізико-хімічних уявлень про стабільність стаціонарного стану виникли біофізичні уявлення про адаптацію рослин до змін умов зовнішнього середовища як порушення інгібуючих антиокислювальних систем (Б. Н. Тарусов, Я. Є. Доскоч, Б. М. Кітлаєв, А. М. Агавердієв , 1968 – 1972). Це відкрило можливість оцінювати такі властивості, як морозостійкість та солестійкість, а також робити відповідні прогнози під час селекції сільськогосподарських рослин.

    У 50-х роках було відкрито надслабке світіння – біохемолюмінесценція низки біологічних об'єктів у видимій та інфрачервоній частинах спектру (Б. Н. Тарусов, А. І. Журавльов, А. І. Поливода). Це стало можливо в результаті розробки методів реєстрації надслабких світлових потоків за допомогою фотоелектронних помножувачів (Л. А. Кубецький, 1934). Будучи результатом біохімічних реакцій, що протікають у живій клітині, біохемолюмінесценція дозволяє судити про важливі окисні процеси в ланцюгах перенесення електронів між ферментами. Відкриття та вивчення біохемолюмінесценції має велике теоретичне та практичне значення. Так, Б. Н. Тарусов та Ю. Б. Кудряшов відзначають велику роль продуктів окислення ненасичених жирних кислоту механізмі виникнення патологічних станів, що розвиваються під дією іонізуючих випромінювань, при канцерогенезі та інших порушеннях нормальних функційклітини.

    У 50-х роках у зв'язку з бурхливим розвитком ядерної фізики з біофізики виділилася радіобіологія, що досліджує біологічну дію іонізуючих випромінювань. Отримання штучних радіоактивних ізотопів, створення термоядерної зброї, атомних реакторів та розвиток інших форм практичного використання атомної енергії поставило з усією гостротою проблему захисту організмів від шкідливої ​​дії іонізуючої радіації, розробки теоретичних засадпрофілактики та лікування променевої хвороби. Для цього необхідно було насамперед з'ясувати, які компоненти клітини та ланки обміну речовин є найбільш уразливими.

    Об'єктом вивчення біофізики та радіобіології стало з'ясування природи первинних хімічних реакцій, що виникають у живих субстратах під впливом енергії випромінювань. Тут було важливо не тільки зрозуміти механізми цього явища, а й зуміти впливати на процес обміну. фізичної енергіїна хімічну, зменшити його коефіцієнт "корисної" дії. Роботам у цьому напрямі започаткували дослідження школи Н. Н. Семенова (1933) в СРСР і Д. Хіншельвуда (1935) в Англії.

    Велике місце у радіобіологічних дослідженнях зайняло вивчення ступеня радіаційної опірності різних організмів. Було встановлено, що підвищена радіорезистентність (наприклад, гризунів пустель) обумовлена ​​високою антиокислювальною активністю ліпідів клітинних мембран (М. Чанг та ін., 1964; Н. К. Огризов та ін., 1969). Виявилося, що у формуванні антиоксидативних властивостей цих систем велику роль відіграють токофероли, вітамін К і тіосполуки (І. І. Іванов та ін., 1972). В останні роки велику увагу привертають до себе також дослідження механізмів мутагенезу. З цією метою вивчається дія іонізуючих випромінювань на поведінку нуклеїнових кислот та білків in vitro, а також у вірусах та фагах (А. Густафсон, 1945 – 1950).

    Боротьба за подальше підвищення ефективності хімічного захисту, пошук ефективніших інгібіторів та принципів інгібування залишаються у цьому напрямі основними завданнями біофізики.

    Просунулося вперед дослідження збуджених станів біополімерів, що визначають їхню високу хімічну активність. Найбільш успішно йшло вивчення збуджених станів, що виникають на первинній стадії фотобіологічних процесів – фотосинтезу та зору.

    Так, зроблено солідний внесок у розуміння первинної активації молекул пігментних систем рослин. Встановлено велике значення перекидання (міграції) енергії збуджених станів без втрат активованих пігментів на інші субстрати. Велику роль розвитку цих уявлень зіграли теоретичні роботи А. М. Тереніна (1947 і пізніше). А. А. Красновський (1949) відкрив і досліджував реакцію оборотного фотохімічного відновлення хлорофілу та його аналогів. Нині складається загальне переконання, що найближчим часом можна буде відтворити фотосинтез у штучних умовах (див. також розділ 5).

    Біофізики продовжують працювати над розкриттям природи м'язового скорочення та механізмів нервового збудження та проведення (див. розділ 11). Актуального значення набули також дослідження механізмів переходу від збудженого стану до норми. Збуджений стан розглядають тепер як результат автокаталітичної реакції, а гальмування - як наслідок різкої мобілізації інгібіторної антиокислювальної активності в результаті молекулярних перегрупувань в таких сполуках, як токоферол (І. І. Іванов, О. Р. Кольс, 1966; О. Р. Кольс, 1970).

    Найважливішою загальною проблемоюбіофізики залишається пізнання якісних фізико-хімічних особливостей живої матерії. Такі властивості, як здатність живих біополімерів вибірково пов'язувати калій або поляризувати електричний струм, не вдається зберегти навіть при їхньому обережному вилученні з організму. Тому клітинна біофізика продовжує інтенсивно розробляти критерії та методи для прижиттєвого дослідження живої матерії.

    Попри молодість молекулярної біології, успіхи, досягнуті нею у цій галузі, воістину приголомшливі. За порівняно короткий термін встановлено природу гена та основні принципи його організації, відтворення та функціонування. Понад те, здійснено як розмноження генів in vitro, а й уперше завершено повний синтез самого гена. Повністю розшифровано генетичний код і вирішено найважливішу біологічну проблему специфічності біосинтезу білка. Виявлено та досліджено основні шляхи та механізми утворення білка в клітині. Повністю визначено первинну структуру багатьох транспортних РНК - специфічних молекул-адапторів, що здійснюють переклад мови нуклеїнових матриць на мову амінокислотної послідовності білка, що синтезується. До кінця розшифрована амінокислотна послідовність багатьох білків та встановлена ​​просторова структура деяких з них. Це дозволило з'ясовувати принцип і деталі функціонування молекул ферментів. Здійснено хімічний синтез одного з ферментів – рибонуклеази. Встановлено основні принципи організації різних субклітинних частинок, багатьох вірусів та фагів та розгадано основні шляхи їх біогенезу у клітині. Розкрито підходи до розуміння шляхів регуляції активності генів та з'ясування регуляторних механізмів життєдіяльності. Вже простий перелік цих відкриттів свідчить у тому, що половина XX в. ознаменувалася величезним прогресом біології, який зобов'язаний насамперед поглибленому вивченню структури та функції біологічно найважливіших макромолекул - нуклеїнових кислот і білків.

    Досягнення молекулярної біології вже сьогодні використовуються на практиці та приносять відчутні плоди у медицині, сільському господарстві та деяких галузях промисловості. Безперечно, що віддача цієї науки зростатиме з кожним днем. Однак головним підсумком все ж таки слід вважати, що під впливом успіхів молекулярної біології зміцнилася впевненість у існуванні необмежених можливостей на шляху розкриття найпотаємніших таємниць життя.

    У майбутньому, мабуть, будуть відкриті нові шляхи дослідження біологічної форми руху матерії. молекулярного рівнябіологія перейде на атомарний рівень. Однак зараз не знайдеться, мабуть, жодного дослідника, який міг би реально передбачити розвиток молекулярної біології навіть на найближчі 20 років.

    Молекулярна біологія / м? лɛ доJʊ лər / є гілкою біології, що стосується молекулярної основи біологічної активності між біомолекулами в різних системах клітини, у тому числі взаємодій між ДНК, РНК, білків та їх біосинтезу, а також регулювання цих взаємодій. Запис у природі 1961 року, Астбері описав молекулярну біологію:

    Не так техніка, як підхід, підхід з погляду про фундаментальних наук із провідною ідеєю пошуку нижче великомасштабних проявів класичної біології для відповідного молекулярного плану. Він стурбований тим, зокрема, з формамибіологічних молекул і [...] переважно тривимірним і структурно - що не означає, однак, що це лише уточнення морфології. Він має водночас досліджувати генезис та функції.

    Ставлення до інших біологічних наук

    Дослідники в галузі молекулярної біології використовують специфічні методи ростуть молекулярну біологію, але все більше і більше комбінують їх з методами та ідеями від генетики та біохімії. Існує не певна межа між цими дисциплінами. Це показано на наступній схемі, що зображує один можливий вид відносин між полями:

    • Біохімія є вивчення хімічних речовині життєво важливих процесів, що відбуваються в живих організмах. Біохіміки важко зосередитися на ролі, функції та структури біомолекул. Вивчення хімії за біологічних процесів та синтезу біологічно активних молекул є прикладами біохімії.
    • Генетика є вивчення впливу генетичних відмінностей у організмах. Це часто може бути виведено у відсутності нормальної компоненти (наприклад один ген). Вивчення «мутанти»-організми мають один або більше функціональні компоненти по відношенню до так званого «дикого типу» або нормального фенотипу. Генетичні взаємодії (епістаз) часто плутають прості інтерпретації таких «нокаут» дослідження.
    • Молекулярна біологія є вивчення молекулярних основ процесів реплікації, транскрипції, трансляції та функції клітин. Центральна догма молекулярної біології, де генетичний матеріал транскрибується в РНК і потім транслюється в білок, незважаючи на спрощене, як і раніше забезпечує хорошу початкову точку для розуміння поля. Картина була переглянута у світлі нових ролей для РНК .

    Методи молекулярної біології

    Молекулярне клонування

    Одним із найголовніших методів молекулярної біології для вивчення функції білка є молекулярним клонуванням. У цій техніці, ДНК, що кодує білок, що представляє інтерес, клонованої за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), та/або ферменти рестрикції в плазміді (вектора експресії,). Вектор має 3 відмітні особливості: початок реплікації, а сайт множинного клонування (MCS), і селективний маркер, як правило, зі стійкістю до антибіотиків. Розташовані вище сайт множинного клонування є промоторними областями та транскрипції сайту ініціації, що регулюють експресію клонованого гена. Ця плазміда може бути вставлена ​​або бактеріальні або тваринних клітин. Введення ДНК у бактеріальні клітини може бути зроблено шляхом трансформації за допомогою поглинання голої ДНК, кон'югацій за допомогою міжклітинних контактів або трансдукції за допомогою вірусного вектора. Введення ДНК в еукаріотичні клітини, такі як клітини тварин, за допомогою фізичних чи хімічних засобів, називається трансфекцією. Декілька різних методів трансфекції доступні, такі як фосфат кальцію трансфекції, електропорації, мікроін'єкції та ліпосомальної трансфекції. Плазміда може бути інтегрована в геном, що призводить до стабільної трансфекції, або може залишатися незалежними від геному, званого перехідними процесами трансфекції.

    ДНК, що кодують білки, що представляє інтерес, в даний час всередині клітини, і білки тепер можуть бути виражені. Різноманітні системи, такі як індуцибельні промотори та специфічні клітинні сигнальні фактори, які допоможуть виявити інтерес білок на високих рівнях. Великі кількості білка можуть бути витягнуті з бактеріальної або еукаріотичної клітини. Білок може бути перевірений на ферментативну активність при різних ситуаціях, білка можна кристалізувати, тому його третинна структура може бути вивчена, або, у фармацевтичній промисловості, активність нових препаратів проти білка може бути вивчена.

    Полімеразної ланцюгової реакції

    Макромолекули-блот та дослідження

    Терміни північний , західнийі східнийБлоттінг отримує з того, що спочатку була молекулярна біологія жарт, яка грала на терміні Саузернет, після методики, описаної Edwin Southern для гібридизації BLOTTED ДНК Патриція Томас, розробник РНК - блот, який потім став відомий як північному - блоттингунасправді не використовувати цей термін.

    Саузернблот

    Названий на честь його винахідника, біолог Едвін Південний, то Саузерн - блот є методом дослідження на наявність специфічної послідовності ДНК у зразку ДНК. Зразки ДНК до або після ферменту рестрикції (рестриктаз) переварювань розділені за допомогою електрофорезу в гелі, а потім переносили на мембрану за допомогою блотингу за допомогою капілярної дії. Мембрану потім піддають впливу міченого ДНК - зонда, який має послідовність підстав доповненням до послідовності ДНК, що представляє інтерес. Саузерн - блоттинг менш широко використовується в науковій лабораторії через здатність інших методів, таких як ПЛР, для виявлення специфічних послідовностей ДНК із зразків ДНК. Ці блоти все ще використовуються для деяких застосувань, однак, таких як вимірювання трансгена числа копій в трансгенних мишах або в інженерії гена нокаутних ліній стовбурових ембріональних клітин .

    Північний Блоттінг

    Northern блот діаграма

    Східно-блотингу

    Клінічні дослідження та медичні методи лікування, що випливають із молекулярної біології, частково охоплені генною терапією. Застосування молекулярної біології чи молекулярних клітинна біологія підходів у медицині тепер називається молекулярною медициною. Молекулярна біологія також грає важливу рольу розумінні освіти, дій і нормативних актів різних частин клітин , які можуть бути використані для ефективних призначатися нові ліки , хвороба діагнозу та зрозуміти фізіологію клітини.

    подальше читання

    • Cohen, SN, Чанг, НКД, Бойєр, H. & Heling, RB Конструювання біологічно функціональних бактеріальних плазмід у пробірці .
    Поділіться з друзями або збережіть для себе:

    Завантаження...